Hsa-miR-105-1通过靶向ANXA9调控卵巢癌细胞对顺铂的耐药

摘要

目的．顺铂是治疗卵巢癌(OC)最有效的药物之一，卵巢癌是最致命的癌症之一。然而，随着时间的推移，对顺铂的化疗耐药导致许多OC患者的临床结果较差。因此，有必要清楚地了解药物耐药的分子机制。在本研究中，我们研究了Hsa-miR-105-1在顺铂耐药OC细胞中的作用。方法．采用qRT-PCR检测顺铂敏感和耐药OC细胞系中Hsa-miR-105-1的表达水平。通过TargetScan和Starbase数据库预测Hsa-miR-105-1的靶基因，并通过双荧光素酶报告基因检测进行验证。Hsa-miR-105-1的靶基因被鉴定为ANXA9,ANXA9通过qRT-PCR、western blotting和免疫荧光检测表达。为了验证Hsa-miR-105-1在OC细胞中的功能，我们分别在顺铂敏感或耐药OC细胞系中沉默或过表达Hsa-miR-105-1。western blot检测凋亡相关蛋白P53、P21、E2F1、Bcl-2、Bax、caspase-3的表达水平。结果。在顺铂耐药OC细胞中Hsa-miR-105-1表达水平异常下调ANXA9在这些细胞中表达显著上调。Hsa-miR-105-1抑制剂可促进顺铂敏感OC细胞中ANXA9 mRNA和蛋白的表达，增强对顺铂的耐药性，减弱顺铂诱导的细胞凋亡。此外，Hsa-miR-105-1模拟物处理被抑制ANXA9进一步提高P53、P21和Bax的表达水平，降低E2F1和Bcl-2的表达水平，最终导致顺铂耐药OC细胞对顺铂的敏感性增加。结论．我们发现Hsa-miR-105-1表达下调增强了顺铂耐药性，而Hsa-miR-105-1表达上调则恢复了OC细胞对顺铂的敏感性。hsa - mir - 105 - 1 /ANXA9轴在OC细胞的顺铂抗性中起重要作用。

1.简介

卵巢癌(OC)是世界上最致命的妇科肿瘤之一，根据组织来源可分为上皮性卵巢癌、生殖细胞瘤、卵巢性腺间质瘤、转移性肿瘤等亚型[1］．每年有超过22万名女性被诊断出患有OC, 14万人死于OC。它的治疗通常包括最佳的减细胞手术和铂基联合化疗。顺铂，也被称为“癌症的青霉素”，自1971年以来在治疗癌症方面发挥了关键作用。顺铂是一种烷基化剂，可引起链间和链内DNA交联的形成，最终导致细胞周期阻滞。虽然顺铂是治疗卵巢癌最有效的抗癌药物之一，但对顺铂的先天和获得性耐药经常被观察到。因此，晚期卵巢癌患者(III期和IV期)的5年生存率仅为20-30%。越来越明显的是，早期发现耐药并及时调整患者的化疗方案对于改善卵巢癌患者的临床结果至关重要。

MicroRNAs (miRNAs)由一组进化上保守的小非编码rna组成，在转录或转录后水平调控基因表达[2］．MicroRNAs在细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭、分化和代谢等许多生物学过程中发挥着重要作用[3.］．大量研究表明，miRNAs参与了各种癌症形成的化疗耐药[4，5］．对GSE数据集的搜索显示，与顺铂耐药癌细胞相比，miR-105-1在非顺铂耐药癌细胞中的表达水平显著高于顺铂耐药癌细胞(数据未显示)。因此，我们推测miR-105-1可能在卵巢癌肿瘤产生顺铂化疗耐药中发挥重要作用。膜联蛋白A9 (ANXA9)是膜联蛋白家族的一员，已被报道参与多种癌细胞的侵袭和转移，如结直肠癌(CRC) [6]、乳癌[7，8]，以及头颈部鳞状细胞癌[9］．然而，鲜有研究探讨ANXA9在OC中的作用。在本研究中，我们检测了Hsa-miR-105-1和ANXA9在OC细胞顺铂耐药发展中的作用。

2.材料与方法

2.1.细胞培养

5株OC细胞株(SW626、SK-OV-3、TOV-112D、A2780和OVcar3)和1株正常卵巢上皮细胞株(IOSE-80)购自南京凯根生物科技公司(南京，中国)。所有细胞系最初储存在液氮中，随后在使用前含有10%胎牛血清、10,000 UI/mL青霉素和10 mg/mL链霉素的完全DMEM培养基(赛默飞世尔科学公司，Waltham, MA, USA)中恢复。然后将细胞培养在37°C含5%二氧化碳的湿润培养箱中。

2.2.获得性耐顺铂OC细胞模型的建立

为了建立稳定的顺铂耐药OC模型，将SW626和OVcar3细胞暴露于逐步增加浓度的顺铂(Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germany)。简单地说, SW626或OVcar3细胞培养于6 mm板中，初始处理为0.1μM顺铂(浓度低于各自的IC₅₀)，为期一个月。随后，培养基中顺铂浓度增加0.1μM每2周一次，直到最终浓度为1μM(直到选定的细胞群显示IC至少高出3倍₅₀(45μg/mL)对顺铂的影响大于亲本细胞系。同时，对照野生型细胞以同样的方式处理，但不加顺铂。建立的顺铂耐药SW626和OVcar3细胞分别命名为SW626/DDP和OVcar3/DDP。为消除培养基中顺铂残留对SW626/DDP和OVcar3/DDP细胞的影响，将SW626/DDP和OVcar3/DDP细胞在无顺铂的DMEM补充培养基中培养2周后用于实验。

2.3.转染

GenePharma公司(中国上海)合成了Hsa-miR-105-1抑制剂和Hsa-miR-105-1模拟物。转染时，将细胞接种到培养板中，并根据制造商说明使用Lipofectamine TM2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)进行转染。

2.4.Hsa-miR-105-1靶基因的预测

使用TargetScan和Starbase数据库预测ha - mir -105-1的靶基因。两个数据库同时预测的基因被确定为Hsa-miR-105-1的靶基因。然后预测潜在的结合位点。

2.5.双荧光素酶报告基因检测

野生型ANXA9使用PrimeSTAR®HS从人类基因组DNA中扩增出含有Hsa-miR-105-1潜在结合位点的片段。DNA聚合酶(Takara，日本)。引物序列如下 -CCCTCGAGTGAAACTGAGCCCAATTACCAAG-3和5 -ATTTGCGGCCGCAGTGAGGCAGAAACTATCAAAGA-3 ．采用以下突变反向引物实现种子区诱变 -TCCCTGCCCCACCCCACATGTGTAGGCTGGATCTGAGATTTCCGTGTT-3和5 -AACACGGAAATCTCAGATCCAGCCTACACATGTGGGGTGGGGCAGGGA-3 ．3 .包含野生型的片段UTR的ANXA9（ANXA93UTR-WT)和突变体3UTR的ANXA9（ANXA93UTR-MUT)插入到psiCHECK-2启动子载体荧光素酶基因的下游区域，得到重组质粒psiCHECK-2-ANXA93UTR-WT和psiCHECK-2-ANXA93分别UTR-MUT。对于荧光素酶报告检测，psiCHECK-2-ANXA93UTR-WT或psiCHECK-2-ANXA93使用Lipofectamine™2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)将UTR-MUT、Hsa-miR-105-1模拟物或模拟NC(阴性对照)和具有Renilla荧光素酶活性的报告质粒pRL-TK瞬间共转染到细胞中。转染24小时后，使用双荧光素酶报告检测系统(Promega, Madison, WI, USA)根据制造商的方案检测荧光素酶活性。

2.6.实时定量PCR (qRT-PCR)

根据制造商的说明，使用RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germany)提取总RNA，然后使用Prime Script™RT试剂盒和gDNA Eraser (Takara, Japan)反转录成cDNA。使用Mir-X miRNA第一链合成试剂盒(Takara, Japan)将小RNA逆转录为cDNA。qRT-PCR的条件为:95°C持续5 min, 95°C持续15 s, 60°C持续50 s, 95°C持续15 s, 60°C持续15 s, 95°C持续15 s，循环40次。Hsa-miR-105-1和ANXA9使用SYBR Advantage qPCR预混料(Takara，日本)在7900 HT快速实时PCR系统(Applied Biosystems, Foster City，美国)上进行检测。使用RNU6-1 (U6)和GAPDH作为内部对照来估计Hsa-miR-105-1和ANXA9水平,分别。qRT-PCR使用的引物对如下:Hsa-miR-105-1， (F) 5 -ACACTCCAGCTGGGACGGATGTTTGAGCATGT-3和(R) 5 -CTCAACTGGTGTCGTGGA-3 ；U6， (f) 5 -CTCGCTTCGGCAGCACA-3和(R) 5 -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3 ；ANXA9(f) 5 -CAGCTCATCTCACGAAACTTCC-3和(R) 5 -GGTTCGAGTGGCAAGAATTTCAA-3 ；Gadp， (f) 5 -TGTTCGTCATGGGTGTGAAC-3和(R) 5 -ATGGCATGGACTGTGGTCAT-3 ．每次PCR分析均重复3次。基因表达的相对水平用2^−ΔΔCt方法。

2.7.西方墨点法

用150裂解细胞μL含1%蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液(Beyotime, China)(赛默飞世尔科学公司)在冰上浸泡5分钟，然后用冰冷的PBS冲洗两次。接下来，收集细胞，在4°C下，12000 g离心5分钟，使用BCA Kit (Beyotime)测定每个上清液中的蛋白质浓度。等量的总蛋白质(20μG)从每个上清液中溶解20μ经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Beyotime)分离。分离的蛋白质条带转移到聚偏二氟乙烯(Roche Applied Science, Germany)膜上，随后用5%脱脂干牛奶在室温下阻塞1小时。免疫印迹通过将抗ANXA9、E2F1、Bcl-2和Bax的一抗(每一种抗体稀释1:500)、P53和P21(每一种抗体稀释1:1000)以及caspase-3和GAPDH(每一种抗体稀释1:2000)在室温下孵育1小时进行。用一抗孵育后，清洗膜，然后用酶标连接的二抗(1:5 000稀释)在室温下孵育1小时。用增强化学发光试剂(Biosharp, China)检测免疫染色蛋白条带，用化学发光相机(Tanon, China)捕获图像。使用ImageJ软件(美国国立卫生研究院)测量各条带的染色强度。来自同一样品的GAPDH作为内部加载控制。进行了三个独立的实验。

2.8.免疫荧光

处理后的细胞用4%多聚甲醛(PFA)和0.0075%戊二醛的混合物固定15 min;之后，用含0.1% Triton X-100 (PBST)的磷酸盐缓冲溶液渗透，用10% BSA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)在室温下封闭30分钟。用抗鼠ANXA9(在PBST中稀释1:500)在4°C孵育过夜后，用PBST (3× 5分钟)洗涤细胞，然后用Alexa FluorR 488共轭物[F(ab ）2-山羊抗鼠IgG (H + L)二抗在PBST中稀释，室温下交叉吸附1 H。细胞核用4 ，6-二氨基氨基-2-苯基吲哚(DAPI)，细胞置于载玻片上。使用荧光显微镜(Olympus，日本)获得图像。

2.9.细胞生存能力

将处理后的细胞悬浮在培养基中，以5000个细胞/孔的密度接种到96孔板中培养24 h。将培养基替换为含有10% CCK-8溶液(Beyotime)的新鲜培养基。孵育1小时后，用荧光微孔板读取器(Tecan Infinite 200 PRO，瑞士)测量每个孔在450 nm处的吸光度，检测OC细胞的活力。的集成电路₅₀值定义为与对照细胞相比使活细胞数量减少50%的药物浓度，并使用GraphPad Prism 6.0软件(GraphPad software, USA)计算。每个处理组使用3个培养孔，进行3个独立实验。

2.10.流式细胞术

对于细胞周期分析，细胞( 每孔细胞)在不同处理后收获，然后在70%乙醇中4℃固定过夜。固定后，细胞在1000g下离心5分钟以除去乙醇;之后，他们被清洗，随后用碘化丙啶(PI)染色(10μg / mL)。然后用RNase A (100μg/mL)室温30分钟。对于膜联蛋白v -异硫氰酸荧光素(FITC)/PI双染色试验，细胞( 每孔收集细胞)，室温下1000g离心5分钟;之后，将它们重新悬浮在冰冷的PBS中，以1000克离心5分钟，并清洗。接下来，洗过的细胞在500中重新悬浮μL ( Buffer和5μL膜联蛋白v -异硫氰酸荧光素(FITC)染色液加5μ悬液中加入1 L PI染色液。然后将悬浮细胞充分混合，在室温下孵育30分钟。使用BD FACS Calibur流式细胞仪(Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)分析处理后的细胞，使用FlowJo软件(FlowJo LLC, Ashland, OR, USA)测定细胞在细胞周期不同阶段的分布和细胞凋亡率。进行了三个独立的实验。

2.11.赫斯特染色

将细胞按密度播种到12孔板中 每口井。处理后用PBS洗涤两次，4% PFA固定20 min，再用PBS洗涤两次。固定细胞用Hoechst 33342染色液(Invitrogen, USA)孵育5分钟，在显微镜下观察细胞荧光(Olympus, Japan)。

2.12.统计分析

所有数据均使用IBM SPSS Statistics for Windows, Version 19.0软件(IBM Corp, Armonk, NY USA)进行分析，结果以a表示 （ )．两组之间的比较使用Student 's -多组间比较采用单向方差分析，然后采用Student-Newman-Keuls检验事后测试。一个值< 0.05为有统计学意义。

3.结果

3.1.Hsa-miR-105-1在顺铂耐药OC细胞中表达下调

采用qPCR方法分析正常细胞和OC细胞中Hsa-miR-105-1的表达水平。结果显示，在5个OC细胞系中，有3个细胞系的Hsa-miR-105-1水平明显低于IOSE-80细胞系(图1(一))．选择Hsa-miR-105-1水平最低的SW626和OVcar3细胞分别建立顺铂耐药OC细胞系SW626/DDP和OVcar3/DDP。采用CCK-8法检测父细胞活力及对不同浓度顺铂的耐药性。结果显示，顺铂耐药细胞比其亲本细胞更有活力，对顺铂更不敏感(图)1 (b)而且1 (c))．此外，qPCR检测显示，Hsa-miR-105-1在顺铂耐药细胞中的表达水平明显低于野生型细胞(图1 (d))．

3.2.Hsa-miR-105-1靶基因ANXA9在顺铂耐药OC细胞中表达上调

为了研究Hsa-miR-105-1的功能机制，使用TargetScan和Starbase数据库预测其推测的靶基因。两项分析都表明ANXA9作为Hsa-miR-105-1的可能靶基因(图2(一个))．确认是否ANXA9是Hsa-miR-105-1的真正靶标，我们生成了一个萤火虫荧光素酶报告质粒，其中包含野生型或Hsa-miR-105-1种子突变体3UTR的ANXA9．荧光素酶报告酶测定结果表明，野生型荧光素酶活性较高Hsa-miR-105-1组的UTR明显低于对照组，证实了这一点ANXA9是Hsa-miR-105-1的实际靶基因(图2 (b))．此外，通过qRT-PCR、western blot和免疫荧光分析验证了Hsa-miR-105-1与Hsa-miR-105-1之间的关系ANXA9．这些结果显示，与野生型细胞相比，顺铂耐药细胞中ANXA9 mRNA的表达水平显著升高，与Hsa-miR-105的表达相反(图2 (c))．此外，在顺铂耐药细胞中，ANXA9蛋白表达水平也显著上调(图2 (d)而且2 (e))．最后，从Kaplan-Meier Plotter数据库(https://kmplot.com/analysis/index.php?p=service&cancer=ovar)显示，高水平的ANXA9表达总是与OC患者预后不良相关(图2 (f))．

3.3.Hsa-miR-105的下调增加了ANXA9的表达，促进了OC细胞对顺铂的耐药性

为了研究Hsa-miR-105-1在OC细胞中的功能，对Hsa-miR-105-1表达水平相对较高的A2780和TOV-112D细胞转染Hsa-miR-105-1抑制剂。随后的qRT-PCR和western blot检测显示，转染Hsa-miR-105 inhibitor后表达上调ANXA9mRNA和蛋白质水平的表达(图3(一个)而且3 (b))．免疫荧光检测也表明，Hsa-miR-105-1抑制剂可以增加ANXA9蛋白的表达(图3 (c))．与此同时，经Hsa-miR-105-1抑制剂转染的细胞显示出对顺铂的高耐药性，CCK-8试验确定(图3 (d))．的集成电路₅₀转染miR-105-1 inhibitor的细胞明显高于scramble组的细胞(图3 (e))．接下来，我们用顺铂刺激细胞(1μg/mL)，随后的流式细胞术分析显示，与scramble处理的细胞相比，Hsa-miR-105-1抑制剂处理的细胞处于G0/G1期的百分比较低，处于S和G2/M期的百分比较高(图4(一)而且4 (b))．此外，Hsa-miR-105-1抑制剂抑制了顺铂诱导的细胞凋亡(图4 (c)而且4 (d))．Hoechst染色显示，Hsa-miR-105-1抑制剂处理的细胞具有更少的明亮荧光点，这表明细胞凋亡较少(图4 (e))．此外，western blot研究显示，下调Hsa-miR-105-1可降低P53、P21、Bax和Cleaved Caspase-3蛋白表达水平，增加E2F1和Bcl-2蛋白表达水平(图4 (f))．这些结果表明，下调Hsa-miR-105-1可增强OC细胞对顺铂的耐药性。

3.4.Hsa-miR-105上调可增加顺铂耐药细胞对顺铂的敏感性

为了确定Hsa-miR-105-1是否可以逆转顺铂耐药，我们上调了顺铂耐药OC细胞、SW626/DDP细胞和OVcar3/DDP细胞中Hsa-miR-105-1的水平。随后的qRT-PCR分析显示Hsa-miR-105-1模拟物被抑制ANXA9western blot和免疫荧光分析显示，Hsa-miR-105-1模拟物也抑制了ANXA9蛋白的表达(图5(一个)- - - - - -5 (c))．用Hsa-miR-105-1模拟物转染OC细胞降低了顺铂治疗的顺铂耐药细胞的活力(图5 (d))，作为集成电路₅₀Hsa-miR-105-1 mimic转染细胞的值明显低于scramble组细胞(图5 (e))．模拟后用10μg/mL时，流式细胞术分析显示，与scramble处理的细胞相比，Hsa-miR-105-1 mimics处理的细胞处于G0/G1期的百分比更高，处于S和G2/M期的百分比显著降低(图6(一)而且6 (b))．流式细胞仪和Hoechst染色实验均显示转染Hsa-miR-105-1模拟物促进顺铂诱导的细胞凋亡(图6 (c)- - - - - -6 (e))．此外，western blot研究显示，上调Hsa-miR-105-1可上调P53、p21、Bax的表达水平，降低E2F1和Bcl-2的表达水平(图6 (f))．这些结果表明，上调Hsa-miR-105-1可恢复顺铂耐药OC细胞对顺铂的敏感性。

4.讨论

近年来OC的发病率和死亡率呈上升趋势。虽然以顺铂为基础的治疗被广泛用于治疗OC，但顺铂耐药的发展已成为治疗卵巢癌的主要障碍。因此，如果要克服这一重大临床问题，了解顺铂耐药的机制是很重要的。在本研究中，我们发现Hsa-miR-105-1在顺铂耐药细胞中异常低水平表达，其靶基因为ANXA9．

miRNAs不仅作为肿瘤抑制因子或癌基因发挥作用，而且还在多种癌症中调节化疗耐药。近年来，研究各种mirna在癌症化疗耐药中的作用越来越受欢迎。在OC中，许多miRNAs，如miR-132 [10]， miR-142 [11]， miR-186 [12]，以及miR-195 [13]已被报道可调节顺铂耐药性。对miR-105的研究主要集中在其作为预后标志物的作用及其调节细胞增殖、凋亡和转移的能力[14- - - - - -17］．据我们所知，miR-105与顺铂耐药之间的关系仅在三阴性乳腺癌(TNBC)中被探索过，在TNBC中它被证明可以激活Wnt/β-catenin信号通路通过下调SFRP1，从而促进TNBC的化疗耐药[18］．在本研究中，我们证明了Hsa-miR-105-1的表达在顺铂耐药OC细胞中被抑制，并且上调Hsa-miR-105-1可以恢复OC细胞对顺铂的敏感性。

mirna通常通过与3其下游靶mrna的UTR [17］．在我们的研究中，生物信息学分析表明Hsa-miR-105-1可以直接与ANXN9 mRNA结合。荧光素酶报告基因检测表明，过表达Hsa-miR-105-1可显著抑制荧光素酶活性，表明ANXA9 mRNA具有Hsa-miR-105-1结合位点。根据荧光素酶报告分析的数据，我们发现Hsa-miR-105-1抑制剂治疗显著促进ANXA9的表达，而Hsa-miR-105-1模拟的处理抑制了OC细胞中ANXA9的表达。

ANXA9是膜联蛋白家族的一员，它包含进化上保守的蛋白质，其特征是它们能够与Ca的膜磷脂相互作用^{2 +}端依赖的方式。这种性质很可能解释了膜联蛋白如何协助调节膜组织和渗透性，并被认为取决于所谓的II型钙^{2 +}在膜联蛋白中发现结合位点。特别是，膜联蛋白A亚群的许多成员与癌症的发展密切相关[19- - - - - -21］．然而，对ANXA9的研究远远少于其他膜联蛋白。ANXA9最初被称为annexin 31，在表达序列标签(EST)数据库中首次被发现[22］．的ANXA9基因(大小8,233 bp)位于人类染色体1q21上，包含14个外显子，编码345个氨基酸链[23，24］．ANXA9蛋白是膜联蛋白家族的一个独特成员，因为它的细胞内活性似乎不受钙的调控[24，25］．它的近亲是ANXA1和ANXA2 [26，27]，该分支的成员被认为在组织和调节膜/细胞骨架连接中起作用[27，28］．

很少有研究分析了ANXA9在癌症中的表达。Miyoshi等人[29]报道了高水平的ANXA9 mRNA预示结直肠癌(CRC)患者预后不良。另有研究认为，ANXA9可能通过调控肿瘤侵袭转移相关基因，促进CRC的侵袭转移[6］．在乳腺癌中，ANXA9基因表达与骨转移和患者预后相关[7，8］．在头颈部鳞状细胞癌中ANXA9常发生改变并与肿瘤分化程度相关，提示ANXA9与这些癌症的发病机制有关[9］．以上研究表明，ANXA9在肿瘤细胞的侵袭和转移中发挥作用。在这项研究中，我们发现当ANXA9Hsa-miR-105-1抑制剂可上调表达，增强顺铂耐药性，促进细胞分裂，抑制细胞凋亡。相反，当ANXA9被Hsa-miR-105-1模拟物下调，对顺铂的耐药性恢复，OC细胞仍处于G0/G1期，细胞凋亡率增加。值得注意的是，尽管在体外研究表明Hsa-miR-105-1在治疗顺铂耐药OC中可能具有靶向治疗作用，在活的有机体内关于Hsa-miR-105-1在OC中如何发挥作用的研究仍然缺乏。后续在活的有机体内研究Hsa-miR-105-1在OC顺铂耐药性中所起作用的研究可能会导致针对Hsa-miR-105-1/的药物的开发ANXA9轴。

5.结论

综上所述，本研究表明Hsa-miR-105-1通过靶向介导OC细胞对顺铂的敏感性ANXA9Hsa-miR-105-1的表达在OC细胞中受到抑制。此外，下调Hsa-miR-105-1表达增强了OC细胞对顺铂的耐药性，降低了OC细胞的凋亡率，而上调Hsa-miR-105-1表达可恢复OC细胞对顺铂的敏感性。我们的研究结果为如何克服对顺铂治疗的获得性耐药提供了新的见解，并可能有助于改善顺铂耐药OC患者的治疗结果。

数据可用性

支持本文结论的数据集包含在本文中。

利益冲突

所有作者声明与本研究没有利益冲突。

致谢

本研究由河南省科技厅科研项目(No. 172102310301)资助。

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