MMP-9通过RhoC/Src途径抑制裸鼠舌移植模型口腔鳞状细胞癌淋巴结转移

摘要

口腔鳞癌(OSCC)是发展中国家最常见的癌症之一。OSCC高死亡率的一个主要原因是在癌症发展的早期阶段，口腔癌细胞倾向于转移到头颈部周围的淋巴结。基质金属蛋白酶9 (Matrix metalloproteinase 9, MMP-9)是一种内肽酶，可降解细胞外基质和基底膜，在肿瘤侵袭转移中起关键作用。在体外时，细胞迁移能力通过抓挠法测定。我们还通过粘附实验和跨内皮迁移实验研究了OSCC细胞与血管内皮细胞(ECs)之间的相互作用能力。我们建立了BALB/c裸鼠舌移植转移模型，研究MMP-9在OSCC生长、淋巴结转移和血管生成中的作用，并探讨其潜在机制在活的有机体内．结果表明，下调MMP-9可显著抑制OSCC细胞的迁移、增殖、内皮细胞间的相互作用、肿瘤生长和血管生成，同时显著抑制OSCC细胞向小鼠颈浅表淋巴结、腋窝淋巴结甚至腹股沟远端淋巴结的转移。通过RT-PCR、western blotting和免疫组化研究发现，MMP-9的下调也会导致RhoC、Src和F-actin的表达降低。生物信息学分析表明，在TCGA数据库中，OSCC中MMP-9、RhoC和Src mRNA的表达呈线性正相关。综上所述，我们的研究结果表明MMP-9在OSCC的生长、迁移、血管生成和淋巴结转移中起着非常重要的作用，其潜在机制可能与RhoC和Src基因表达介导有关。

1.简介

根据国际癌症研究机构(IARC)的统计数据，口腔鳞状细胞癌(OSCC)是头颈部最常见的恶性肿瘤，2012年有30万例(占世界总数的2.1%)和14.5万例死亡(占世界总数的1.8%)[1］．尽管积极治疗，OSCC患者的5年生存率仍约为50%。OSCC死亡率的增高与其高度局部侵袭性和早期转移至区域淋巴结的侵袭性生长模式有关[2］．

上皮-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)被认为是一种转化过程，使肿瘤细胞获得侵袭性特征，如侵袭性和转移能力。在许多类型的恶性肿瘤中，如OSCC，基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)在肿瘤微环境中发挥作用，诱导EMT过程中的变化，并通过侵袭转移行为促进EMT。在基质金属蛋白酶中，基质金属蛋白酶9 (matrix metalloproteinase 9, MMP-9)是基质金属蛋白酶参与转移形成的主要蛋白水解酶，可降解细胞外基质(extracellular matrix, ECM)中的各种蛋白成分，破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，加速肿瘤转移[3.］．MMP-9在胃癌、乳腺癌、前列腺癌、骨肉瘤、非小细胞肺癌等多种肿瘤组织中均有高表达，与临床分型、淋巴结转移及总生存率相关[4- - - - - -8］．虽然临床研究认为MMP-9的高表达与肿瘤侵袭有关，但进一步在活的有机体内而且体外MMP-9在OSCC中的作用仍需进一步研究。

我们的初步数据发现，在斑马鱼模型中，MMP-9的下调可以抑制OSCC细胞的转移[9］．为了进一步证实MMP-9在转移中的作用并探讨其潜在机制，我们建立了BALB/c裸鼠舌原位OSCC细胞异种移植模型。与斑马鱼异种移植模型相比，小鼠舌原位异种移植模型具有更大的优势，可以更好地了解MMP-9基因敲低在肿瘤生长、血管生成和局部淋巴结转移中的作用，有助于进一步探索其潜在机制。具体来说，我们研究了MMP-9的下调抑制OSCC的恶性生物学行为，这可能是由RhoC和Src的表达介导的。

2.材料与方法

2.1.MMP-9在OSCC细胞中敲除模型的建立

OSCC细胞株CAL27从武汉大学作为礼物获得，SCC15从American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA)购买。细胞在DMEM高糖或DMEM/F12培养基(Invitrogen Life Science, Carlsbad, CA)中培养，并添加10%胎牛血清(FBS, HyClone, Logan, UT)、100 U/mL青霉素和100μ克/毫升链霉素。人脐静脉内皮细胞(HUVECs)取自北京协和医院，在VascuLife基础培养基(Lifeline Cell Technology, Frederick, MD)中培养。所有细胞在37°C和5% CO孵育₂．基于HIV慢病毒转染建立了稳定转染的OSCC细胞株CAL27/MMP-9/shRNA和SCC15/MMP-9/shRNA及其对照细胞[9］．

2.2.裸鼠舌移植模型肿瘤的发展

所有动物护理条件和实验方案均经首都医科大学附属北京口腔医院动物伦理委员会批准(批准文号KQYY-201708-004)。实验在首都医科大学附属北京口腔医院北京口腔研究所实验动物中心进行。小鼠被安置在特定的无病原体动物设施中，在12小时的光照/黑暗循环中，免费获得食物和水。在实验的任何阶段，动物都没有经历过多的痛苦。BALB/c裸鼠35只，雄性，6周龄，平均体重19.5 g，购自SPF(北京)生物科技有限公司，随机分为3组:A组(11/35)为空白对照组，B组(12/35)为接种CAL27/MMP-9/shRNA细胞，c组(12/35)为接种CAL27/对照细胞。裸鼠用1%戊巴比妥钠(Merck, Darmstadt, Germany, 50mg /kg, IP)麻醉，并接种cal27转染的OSCC细胞(25μPBS中的L， ）在老鼠舌头的外侧区域。裸鼠每3天测量一次体重，接种OSCC细胞后37天腹腔注射戊巴比妥钠(100 mg/kg)安乐死。舌、淋巴结标本用中性福尔马林固定，进行苏木精、伊红染色(H&E)及免疫组化染色。用SCC15 OSCC细胞系(SCC15/MMP-9/shRNA)建立了相似的舌原位异种移植模型。所有实验均按照首都医科大学附属北京口腔医院动物保护与福利委员会的机构指南进行。

2.3.组织病理学和免疫组化

将肿瘤组织用石蜡包埋，切成5μm厚切片，然后用H&E染色，并在光学显微镜下评估(Olympus, BX61, Tokyo, Japan)。根据制造商的说明对每个抗体进行免疫组化(IHC)。简单来说，用10%山羊血清阻塞后，切片用抗MMP-9 (ab19906, Abcam，剑桥，MA，美国，1:20 0)、RhoC (ab180785, Abcam, 1:20 0)、Src (ab109381, Abcam, 1:10 0)、Ki67 (A00052208, DAKO，丹麦，1:20 0)、血管性血友病因子(VWF) (A00042568, DAKO, 1:20 0)、CK (kit-009，福州，迈新)一抗4℃孵育过夜，然后分别用二抗(kit-5020，迈新)孵育过夜。采用Image-Pro Plus 6.0软件( )．

2.4.免疫细胞化学

我们使用甲醇固定在13毫米直径玻璃上生长10分钟的细胞，并使用10%山羊血清(ZSBiO, Beijing, China)在37°C下阻断细胞60分钟。然后用RhoC一抗(ab180785, Abcam, 1:20 0)在4℃孵育过夜，再用二抗(kit-5020，迈新)孵育30min。使用安装介质(Beyotime, Xiamen, China)将样品安装到载玻片上，并使用显微镜(Olympus, BX61)获取图像。

2.5.实时聚合酶链反应

使用TRIzol试剂(ComWin Biotech Co.， China Beijing, China)从转染的OSCC细胞中提取总RNA，并使用Super RT cDNA Synthesis Kit (ComWin)进行反转录反应。PCR使用ULtraSYBR mix (Low ROX) (ComWin)进行。人类RhoC引物集(目录号:QRP20382)由GeneCopoeia (Rockville, MD, USA)提供。GAPDH引物组(正向，5CATGGGTGTGAACCATGAGAAGTAT-3 ；相反,5GACTGTGGTCATGAGTCCTTCCA-3 )，MMP-9(向前，5TGTACCGCTATGGTTACACTCG-3 ；相反,5GGCAGGGACAGTTGCTTCT-3 )，和Src(向前，5ATCACCGCAAGAGCTACCAT-3 ；相反,5TGACGGTGTCCGAGGAGTTG-3 ）由生工生物技术有限公司(上海)提供。PCR结果用方法。

2.6.西方墨点法

从转染的OSCC细胞中提取的总蛋白变性并负载在4-20%的丙烯酰胺凝胶上(Bio-Rad, Hercules, CA)。蛋白质通过电泳分离并转移到硝化纤维膜(Bio-Rad)。用5%脱脂乳阻断后，用一抗RhoC (ab180785, Abcam, 1:10 00)、Src (ab109381, Abcam, 1:5 000)、MMP-9 (ab137867, Abcam, 1:6 00)或GAPDH (M121107，华安生物科技，杭州，1:20 00)孵育膜。然后使用ECL试剂(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)进行化学发光检测蛋白条带。

2.7.细胞迁移试验

转染后的细胞接种于6孔板( )．细胞汇合后，我们用200μL型移液管尖在每个孔上直绕，然后用PBS去除所有细胞碎片。细胞在含2%胎牛血清的培养基中培养，37°C, 5% CO₂．我们使用40倍放大的显微镜(Olympus, IX71)在24 h和48 h评估伤口闭合或填充情况。

2.8.内皮细胞粘附测定

CAL27/MMP-9/shRNA细胞和CAL27/对照细胞( ）加入合流HUVECs ( ）它们生长在96孔培养皿中，37°C, 5% CO₂．90分钟后，用PBS冲洗未粘附的细胞。我们用microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)在580nm的激发和630 nm的发射滤波器对贴壁细胞进行了分析。

2.9.跨内皮迁移试验

HUVECs放置于上腔(8μM孔径;Corning, Corning, NY)的培养板插入。HUVECs到达汇合点后，我们添加( ）CAL27/MMP-9/shRNA细胞和CAL27/对照细胞在37°C和5% CO的上腔中₂．90 min后，用棉球去除上膜上残留的细胞。我们用荧光显微镜(Olympus, IX71)计数了通过HUVECs进入下腔的细胞。

2.10.免疫荧光

我们用甲醇固定在13毫米直径玻璃上生长10分钟的细胞。然后，用10%山羊血清(ZSBiO)在37℃下阻断细胞60分钟。FITC-phalloidin标记的F-actin (3.5μL / 14μM f -肌动蛋白稀释500μL PBS) (Cytoskeleton, Denver, CO)孵育样品30分钟，然后用DAPI (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO)染色5分钟。使用安装介质(Beyotime)将样品安装在载玻片上，并使用荧光显微镜(Olympus, BX61)获取图像。

2.11.生物信息学分析

为了分析OSCC中MMP-9、RhoC和Src的相关性，对TCGA数据进行分析(https://www.cancer.gov/必威2490about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga)．下载341份OSCC原始数据，使用TPM值log2转换后的标准化数据。标准化数据用于计算OSCC中MMP-9、RhoC和Src mRNA水平。用R v3.6.1进行绘图。

2.12.统计分析

所有实验数据均采用单因素方差分析或卡方检验(SPSS Statistics 25.0, IBM, Armonk, NY)进行分析。数据表示为 三个独立的实验。统计显著性设为 ．

3.结果

3.1.MMP-9抑制裸鼠舌移植模型肿瘤生长和增殖

进一步证实MMP-9/shRNA抑制转移的作用并探讨其潜在机制在活的有机体内，以CAL27/MMP-9/shRNA或SCC15/MMP-9/shRNA细胞及对照细胞建立裸鼠舌移植模型。通过real-time PCR和western blotting验证了MMP-9/ shrna转染细胞的敲除效率(图S1)．数据1(一)而且1 (e)图示小鼠舌粘膜的组织学结构(H&E染色)。与空白对照组相比，注射CAL27/MMP-9/shRNA或SCC15/MMP-9/shRNA细胞可导致小鼠舌粘膜轻度至中度上皮异常增生。然而，与载体对照细胞组相比，MMP-9/shRNA组上皮细胞发育不良程度降低(图1(一)而且1 (e))．H&E染色显示，CAL27/MMP-9/shRNA或SCC15/MMP-9/shRNA细胞组肿瘤细胞区域较对照组减少(图1 (b)，1 (c)，1 (f),1 (g))．此外,空白组的小鼠体重保持稳定(平均体重约为22 g CAL27-transfected细胞空白组和SCC15-transfected 24 g细胞空白组),和身体重必威2490量的裸体小鼠注射CAL27——或者SCC15-transfected细胞减少(平均体重约为17 g和18 g)与空白相比控制,但没有显著区别MMP-9 /成分和控制向量组(数字1 (d)而且1 (h))．

我们还测试了MMP-9下调对异种移植瘤细胞增殖的影响。首先，通过免疫组化检测MMP-9在CAL27/MMP-9/shRNA和SCC15/MMP-9/shRNA舌移植肿瘤中的表达。与shRNA对照组相比，MMP-9/shRNA组MMP-9表达明显降低(图2(一个)而且2 (b))．此外，我们通过Ki67 IHC染色评估MMP-9下调对OSCC细胞增殖的影响。MMP-9敲低降低CAL27和SCC15细胞增殖(图2 (c)而且2 (d))．

这些数据表明，MMP-9的下调可以降低OSCC细胞的增殖和舌移植肿瘤的生长在活的有机体内．

3.2.MMP-9抑制OSCC细胞内皮细胞与异种移植肿瘤血管生成的相互作用

为了检测MMP-9下调对血管生成的影响，我们通过粘附实验和跨内皮迁移实验研究了OSCC细胞与血管内皮细胞之间的相互作用在体外首先在裸鼠舌移植模型中观察微血管的形成情况。

通过加入转染的CAL27细胞融合HUVECs，研究肿瘤微环境过程中OSCC细胞与血管内皮细胞的相互作用。90分钟后，我们洗掉未附着的细胞;然后，在荧光显微镜下观察到转染的CAL27细胞附着在HUVECs上。简单地说，通过内皮细胞粘附实验，粘附HUVECs的细胞荧光值与对照组相比下降到74.3%(图3 (b))．

此外，我们将转染细胞添加到连接到transwell上腔的HUVECs中。培养24 h后，清除上腔全部细胞;荧光显微镜下观察到的细胞是经HUVECs传递到下腔的转染细胞。通过跨内皮迁移实验，24小时内通过HUVECs的细胞数量从对照组的65.1个/场(×400)显著减少到MMP-9/shRNA组的30.0个/场(×400)3 (c))．

此外，我们还在OSCC细胞异种移植瘤中通过VWF IHC染色评估了MMP-9下调对OSCC细胞血管生成的影响。结果显示，MMP-9的下调降低了OSCC细胞的血管生成(图3(一个))．

这些数据表明，敲低MMP-9可以减少OSCC细胞与内皮细胞的粘附和内皮细胞间的跨内皮迁移，抑制OSCC细胞异种移植肿瘤血管生成，这在SCC15细胞系中也得到证实(图S2)．因此，MMP-9是OSCC细胞穿过内皮完成肿瘤微环境和血管生成所必需的。

3.3.OSCC细胞裸鼠舌移植淋巴结转移模型的建立

口腔癌细胞由于口腔解剖结构特殊，血供丰富，淋巴反流，具有较强的迁移侵袭能力，特别容易早期转移到局部淋巴结，导致患者生存率低，预后差。在我们的小鼠OSCC细胞舌原位异种移植模型中，转染MMP-9 shRNA的OSCC细胞CAL27和SCC15能够转移到口腔附近的淋巴结，颈部和腋窝淋巴结，甚至远至腹股沟淋巴结。然而，在远处的实体器官如肺、肝或肾中未检测到转移性OSCC细胞。由于小鼠淋巴结非常小，因此我们使用抗人细胞角蛋白泛型抗体(CK，上皮细胞的特征性标记物)免疫免疫检测转移到宫颈浅表淋巴结、腋窝淋巴结和腹股沟淋巴结的OSSC细胞。

3.4.MMP-9抑制OSCC细胞迁移在体外

为了验证MMP-9的下调是否影响OSCC细胞的转移能力，我们进行了迁移实验在体外首先。我们发现，MMP-9的下调可使CAL27细胞相对迁移率在24 h时从对照组的24.8%降至MMP-9/shRNA组的13.2%，在48 h时从49.1%降至35.2%(图2)4(一))．此外，在SCC15细胞系中也检测到细胞迁移实验，结果与CAL27细胞系一致(图4 (b))．这些数据进一步证明MMP-9可以促进OSCC细胞的迁移和侵袭能力。

3.5.MMP-9抑制OSCC细胞向浅表宫颈淋巴组织转移

此外，为了检测MMP-9/ shrna转染细胞在裸鼠舌移植模型中的转移，我们首先通过细胞角蛋白IHC和H&E染色检测了浅表宫颈淋巴病。通过免疫组化染色MOD值可见，CAL27/MMP-9/shRNA组和SCC15/MMP-9/shRNA组颈浅部淋巴结转移OSCC细胞数量较对照组明显减少(图5(一个)而且5 (b))．H&E染色显示宫颈浅表淋巴结处有一个转移瘤块。与对照组相比，CAL27/MMP-9/shRNA组颈浅部淋巴结转移面积显著降低至47.2%，SCC15/MMP-9/shRNA组转移面积分别降低至60.55 (c)而且5 (e))．此外，CAL27/MMP-9/shRNA组的转移率也从对照组的97.2%显著降低至68.0%，SCC15/MMP-9/shRNA组的转移率从对照组的96.7%显著降低至72.4%(图5 (d)而且5 (f))．

3.6.MMP-9抑制OSCC细胞向腋窝淋巴结转移

接下来，我们检查了小鼠腋窝淋巴结转移。与对照组(100%)相比，MMP-9/shRNA组腋窝淋巴结转移率显著降低至72.0%(图6 (b))．此外，通过免疫组化染色MOD值显示，MMP-9/shRNA组腋窝淋巴结转移OSCC细胞数量由对照组的92.7个显著减少至34.4个(图6(一))．用shRNA敲除MMP-9基因表达也显著减少了腋窝淋巴结SCC15转移细胞的存在(图6 (c))及其转移率(图6 (d))．

3.7.MMP-9抑制OSCC细胞向腹股沟淋巴结转移

我们研究了MMP-9基因下调不仅对附近淋巴结转移的影响，而且对远处淋巴结腹股沟淋巴结转移的影响。与上述数据一致，与对照组(91.7%)相比，MMP-9/shRNA组腹股沟淋巴结转移率显著降低至62.5%(图7 (b))．此外，MMP-9/shRNA组与对照组相比，腹股沟淋巴结转移CAL27细胞的数量也明显减少，通过免疫组化染色确定MOD值(图7(一))．在SCC15细胞舌移植模型中也得到了类似的结果(图7 (c)而且7 (d))．

总的来说，数据表明，MMP-9的下调通过抑制转移率和转移OSCC细胞的数量来抑制局部和远端淋巴结的转移。

3.8.MMP-9抑制OSCC细胞RhoC, Src和F-Actin的表达在体外而且在活的有机体内

上述结果表明，下调MMP-9基因可有效抑制OSCC细胞迁移、增殖及内皮细胞间相互作用能力，抑制远端和近端淋巴结转移。为了进一步研究其潜在机制，我们通过实时PCR、western blotting和IHC评估了MMP-9/ shrna转染的OSCC细胞中RhoC、Src和F-actin(肿瘤细胞转移的关键调控因子)的表达。通过real-time PCR，我们发现敲低MMP-9可以下调RhoC和Src RNA及蛋白的表达(图8(一个),图S3 (a))、western blotting(图8 (b),图S3 (b))和免疫细胞化学(图8 (c),图S3 (c)）在体外．此外，免疫荧光染色MOD值显示，MMP-9/shRNA组F-actin表达较对照组明显降低(图8 (d),图S3 (d))．

在CAL27或SCC15/MMP-9/shRNA舌部移植肿瘤中，通过免疫组化染色观察，与对照组相比，MMP-9/shRNA组RhoC和Src的表达也降低(图9(一个)- - - - - -9 (d))，结果与在体外数据。

这些数据表明，MMP-9表达下调可下调OSCC中RhoC、Src和F-actin的表达。

3.9.MMP-9、RhoC、Src在OSCC中呈线性正相关

TCGA是肿瘤研究领域最丰富、最权威的数据库。为了进一步探讨MMP-9、RhoC和Src mRNA表达的相关性分析，我们根据TCGA数据库中的OSCC样本分析了MMP-9、RhoC和Src mRNA表达的相关性。在OSCC中，MMP-9与RhoC呈正线性相关(图10 ())、MMP-9和Src(图10 (b))、RhoC和Src(图10 (c))观察mRNA表达情况。综上所述，我们的研究结果表明MMP-9在OSCC侵袭和淋巴结转移中起着非常重要的作用，其潜在机制可能与RhoC和Src基因表达介导有关。

4.讨论

MMP-9在癌症的发生发展中起关键作用，与多种恶性肿瘤的肿瘤转移有关[10- - - - - -14］．此外，据报道，在许多基因工程小鼠癌症模型中，MMP-9基因的缺失可以延缓肿瘤发作或抑制肿瘤进展[15- - - - - -19］．这些发现与我们在本研究中的数据是一致的。MMP-9在肿瘤侵袭早期起着至关重要的作用，其主要功能是降解和重塑ECM的稳态。ECM的降解是肿瘤转移的重要机制。OSCC易发生颈部淋巴结转移，约有40%的病例发生，即使在早期也会发生[必威249020.］．在裸鼠舌移植模型中，MMP-9的下调可显著抑制OSCC细胞向宫颈浅表淋巴结、腋窝淋巴结、甚至腹股沟淋巴结的转移。我们的数据证实，MMP-9在淋巴结转移早期OSCC进展中起着关键作用。

血管生成是肿瘤转移的主要机制。MMP-9常在血管生成区表达[21]，可刺激肿瘤血管生长因子的释放和/或激活原血管生成因子(如VEGF)的沉积，从而招募血管内皮细胞[22]和周细胞[23，24从而导致肿瘤中的血管生成。我们的研究表明，MMP-9的下调可以抑制OSCC细胞与血管内皮细胞的相互作用在体外并抑制裸鼠舌移植肿瘤血管生成。我们的研究间接证实了MMP-9对肿瘤血管生成的促进作用。

MMP-9的下调不仅可以抑制OSCC细胞的增殖、迁移、血管内皮细胞的粘附和血管生成，还可以抑制其他肿瘤转移相关因子，如RhoC和Src基因，从而抑制口腔癌细胞的侵袭和转移。我们进一步的机制研究表明，MMP-9的下调抑制了RhoC和Src基因RNA和蛋白的表达在活的有机体内而且在体外．此外，生物信息学分析表明，在TCGA数据库中，MMP-9、RhoC和Src mRNA的表达在OSCC中呈线性正相关。RhoC是rhogtp家族成员，是肿瘤细胞迁移和侵袭的关键介质。据报道，RhoC过表达可能预示淋巴结转移和不良预后。另有研究表明，RhoC的缺失降低了肿瘤细胞与内皮细胞的粘附能力，抑制了肿瘤细胞诱导内皮细胞连接开放的能力[25］．Src家族激酶在人细胞中广泛表达，异常激活的Src蛋白可促进癌细胞增殖转移，影响癌细胞细胞骨架的重组。敲低MMP-9不仅能抑制Src的表达，还能抑制细胞骨架蛋白F-actin的表达。

肿瘤细胞转移是一个多步骤过程，包括ECM的降解、细胞迁移和侵袭、癌细胞粘附到内皮细胞、血管生成和转移灶形成[26，27］．我们的研究结果提供了强有力的证据，证明MMP-9在OSCC中具有抑制肿瘤的功能，特别是MMP-9对小鼠淋巴结转移有一定的抑制作用。MMP-9的潜在机制可能与抑制涉及多个通路的多步骤过程有关，如RhoC和Src信号通路。虽然我们认为RhoC、Src和F-actin是MMP-9的潜在靶点，但仍需要进一步的研究来阐明MMP-9如何调节其下游基因表达级联。

5.结论

综上所述，我们的研究表明，MMP-9的下调可以通过多种途径或机制显著抑制OSCC细胞的恶性生物学行为，如迁移、转移能力以及ECs之间的相互作用。此外，下调MMP-9可显著抑制裸鼠舌移植OSCC细胞肿瘤生长、增殖、淋巴结转移和血管生成。进一步的机制研究发现MMP-9的下调可能是通过RhoC和Src信号通路的表达介导的。

缩写

MMP-9:	基质金属蛋白酶9
OSCC:	口腔鳞癌
EMT:	Epithelial-mesenchymal过渡
ECs:	血管内皮细胞
ECM:	细胞外基质
HUVECs:	人脐静脉内皮细胞
包含IHC:	免疫组织化学
VWF:	冯·维勒布兰德因子
CK:	抗人细胞角蛋白盘。

数据可用性

所有必要的材料都可以在文本或补充材料中找到。

伦理批准

所有动物实验均按照首都医科大学附属北京口腔医院动物关爱福利委员会的机构准则进行，实验在首都医科大学附属北京口腔医院北京口腔研究所实验动物中心进行。所有动物护理和方案均经首都医科大学附属北京口腔医院动物伦理委员会批准(批准文号KQYY-201708-004)。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

PY负责主要实验和数据分析，并撰写稿件。XZ设计了本研究并指导了实验。YS、SC、JW、FG和YW分别进行了部分实验。XZ修改了手稿。所有作者都对结果进行了解释，并对最终手稿进行了编辑和批准。

致谢

国家自然科学基金(81772868)和北京市自然科学基金(7202057)资助。感谢北京口腔医院、首都医科大学口腔医学院田振川教授在动物实验方面的专家帮助。

补充材料

图S1: OSCC细胞中MMP-9基因敲除。(a)转染MMP-9/shRNA通过RT-PCR抑制mmp - 9mrna的表达。 ，与对照组比较。(b) western blotting检测蛋白水平MMP-9的表达。图S2: MMP-9抑制OSCC细胞间ec与异种移植肿瘤血管生成的相互作用。(a)转染MMP-9/shRNA可通过免疫组化抑制微血管密度(MVD)。(b) MMP-9的下调可减少细胞在ECs之间的跨内皮迁移。(c)通过粘附实验，MMP-9的下调可降低细胞对ECs的粘附。所有数据显示为 ． ，与对照组比较。图S3: MMP-9的下调抑制了RhoC、Src和F-actin的表达在体外．(a) RT-PCR检测scc15转染细胞中RhoC和Src的RNA表达。(b)经scc15转染的细胞中RhoC和Src蛋白的western blotting表达。(c) MMP-9的下调可通过免疫细胞化学抑制RhoC的表达。(d) MMP-9/shRNA转染降低了免疫荧光法的阴茎素染色。所有数据均以 ． ，与对照组比较。（补充材料）

参考文献

1. J. Ferlay, I. Soerjomataram, R. Dikshit等人，“全球癌症发病率和死亡率:来源，方法和GLOBOCAN 2012的主要模式，”国际癌症杂志，第136卷，no。5，页E359-E386, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
2. J. Wikner, A. Gröbe, K. Pantel和S. Riethdorf，“口腔鳞状细胞癌和循环肿瘤细胞，”世界临床肿瘤学杂志，第5卷，no。2，页114-124,2014。视图:出版商的网站|谷歌学者
3. B. Poudel, D. K. Kim, H. H. Ki, Y. B. Kwon, Y. M. Lee和D. K. Kim，“ERK信号下调通过抑制MMP9的产生来损害U2OS骨肉瘤细胞在胶原基质中的迁移。”肿瘤的信件，第7卷，no。1，页215-218,2014。视图:出版商的网站|谷歌学者
4. E. M. Yousef, M. R. Tahir, Y. St-Pierre和L. A. Gaboury，“MMP-9的表达根据乳腺癌的分子亚型而变化，”BMC癌症，第14卷，no。1，页609,2014。视图:出版商的网站|谷歌学者
5. 周春杰，邝荣光，吴海霞，郝光霞，王俊伟，“IGF-2, PCNA, MMP-7，和，和的表达和意义α-肌动蛋白在胃癌Lauren分级中的作用土耳其胃肠病学杂志， vol. 24, pp. 99-108, 2013。视图:谷歌学者
6. N. H. Yamaguchi, A. J. Lichtenfels, L. M. Demarchi等人，“COX-2, MMP-9和Noguchi分类提供了肺腺癌的额外预后信息。必威2490一项对巴西117名患者的研究美国临床病理学杂志，第121卷，no。1, pp. 78-86, 2004。视图:出版商的网站|谷歌学者
7. S. H. Kim, H. Y. Choi, J. Lee等人，“治疗切除I期NSCLC患者非肿瘤肺组织中MMP-2活性升高与肿瘤复发和生存率差相关。”外科肿瘤学杂志，第95卷，no。4, pp. 337-346, 2007。视图:出版商的网站|谷歌学者
8. Lin H.， Hao Y.， Z. Zhao，和Y. Tong，“Sirtuin 6通过ERK1/2/MMP9途径促进骨肉瘤细胞的迁移和侵袭。”FEBS Open Bio，第7卷，no。9，第1291-1301页，2017。视图:出版商的网站|谷歌学者
9. 温俊良，殷培培，李丽文等，“基质金属肽酶9抑制斑马鱼移植模型中口腔鳞癌细胞的转移，”生物医学研究国际，卷2020,10页，2020。视图:出版商的网站|谷歌学者
10. T. Oku, K. Shimada, H. Kenmotsu等人，TNF-刺激腹膜间皮细胞分泌基质金属蛋白酶-9 (MMP-9)α在胃癌细胞的侵袭中起作用。”国际分子科学杂志，第19卷，no。12，页3961,2018。视图:出版商的网站|谷歌学者
11. S. Subhawa, T. Chewonarin和R. banjerdongchai，“鱼腥草和Piper ribesioides壁提取物对乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响”，分子，第25卷，no。5，第1196页，2020年。视图:出版商的网站|谷歌学者
12. A. Ok atjlgan, B. H. Özdemir, E. yillmaz Akçay, M. tepeo土耳其鲁，P. Börcek，和A. Dirim，“局灶性黏附激酶和基质金属蛋白酶-9在前列腺腺癌中的表达及其对前列腺腺癌进展的影响”病理诊断年鉴， vol. 45, p. 151480, 2020。视图:出版商的网站|谷歌学者
13. 黄问，兰飞，王旭等，“IL-1βp38的激活通过上调AP-1/c-fos、MMP2和MMP9促进胃腺癌的转移。”分子癌症，第13卷，no。1，页18,2014。视图:出版商的网站|谷歌学者
14. 杨晓哲，崔淑贞，曾丽生等，“Rab1B和MMP9的过表达预示着结直肠癌患者较差的生存率和对化疗的良好反应。”老化，第9卷，no。3，页914-931,2017。视图:出版商的网站|谷歌学者
15. A. K. George, R. P. Homme, A. Majumder, S. C. Tyagi，和M. Singh，“MMP-9基因敲除对视网膜血管形态和功能的影响”，生理基因组学，第51卷，no。12, pp. 613-622, 2019。视图:出版商的网站|谷歌学者
16. A. C. Thomas和A. C. Newby，“敲除基质金属蛋白酶9对小鼠静脉移植重构的影响”，血管研究杂志，第47卷，no。4, pp. 299-308, 2010。视图:出版商的网站|谷歌学者
17. M. de Bruyn, C. Breynaert, I. Arijs等人，“抑制明胶酶B/MMP-9并不能减弱炎症性肠病小鼠模型中的结肠炎。”自然通讯，第8卷，no。1，页15384,2017。视图:出版商的网站|谷歌学者
18. M. D. Martin, K. J. Carter, S. R. Jean-Philippe等人，“在乳腺癌模型中，消融或抑制基质基质金属蛋白酶9对肺转移的影响取决于遗传背景。”癌症研究，第68卷，no。15, pp. 6251-6259, 2008。视图:出版商的网站|谷歌学者
19. B. Pijet, M. Stefaniuk, A. Kostrzewska-Ksiezyk, P. E. Tsilibary, A. Tzinia和L. Kaczmarek，“创伤性脑损伤后MMP-9水平升高促进癫痫发生”分子神经生物学，第55卷，no。12，页9294-9306,2018。视图:出版商的网站|谷歌学者
20. D. K. Chhetri, J. D. Rawnsley和T. C. Calcaterra，“颊黏膜癌”，耳鼻咽喉头颈外科，第123卷，no。5, pp. 566-571, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学者
21. D. M. le, a . Besson, D. K. Fogg等人，“胶质瘤细胞利用星形胶质细胞促进侵袭:涉及基质金属蛋白酶-2和尿激酶型纤溶酶原激活剂-纤溶酶级联的机制”神经科学杂志，第23卷，no。10, pp. 4034-4043, 2003。视图:出版商的网站|谷歌学者
22. G. Bergers, R. Brekken, G. McMahon等人，“基质金属蛋白酶-9在癌变过程中触发血管生成开关”，自然细胞生物学，第2卷，no。10, pp. 737-744, 2000。视图:出版商的网站|谷歌学者
23. C. F. Chantrain, H. Shimada, S. Jodele等人，“基质基质金属蛋白酶-9通过促进周细胞募集来调节成神经细胞瘤的血管结构”癌症研究第64卷，no。5, pp. 1675-1686, 2004。视图:出版商的网站|谷歌学者
24. S. Jodele, C. F. Chantrain, L. Blavier等人，“成神经细胞瘤中骨髓来源细胞对肿瘤血管系统的贡献依赖于基质金属蛋白酶9，”癌症研究，第65卷，no。8, pp. 3200-3208, 2005。视图:出版商的网站|谷歌学者
25. N. Reymond, J. H. Im, R. Garg等人，“RhoC和ROCKs调节癌细胞与内皮细胞的相互作用，”分子肿瘤学，第9卷，no。6, pp. 1043-1055, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
26. S. A. Brooks, H. J. Lomax-Browne, T. M. Carter, C. E. Kinch和D. M. Hall，“癌细胞转移中的分子相互作用”，Acta Histochemica，第112卷，no。1, pp. 3-25, 2010。视图:出版商的网站|谷歌学者
27. S. Kikuchi, Y. Yoshioka, M. Prieto-Vila和T. Ochiya，“细胞外囊泡在癌症进展和转移中血管相关功能的参与，”国际分子科学杂志，第20卷，no。10，页2584,2019。视图:出版商的网站|谷歌学者

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