应用WGCNA和LASSO建立5基因评分系统预测直肠癌患者预后

摘要

背景．尽管越来越多的证据表明分子标记面板可能比常规临床特征更能有效预测预后，但目前的研究主要集中在结直肠癌。目前还没有报告专门关注直肠癌(RC)的签名面板。我们目前的研究旨在开发一种新的预后标志面板的RC。方法．RC患者的测序(或微阵列)数据和临床病理细节均从癌症基因组图谱(TCGA-READ)或基因表达Omnibus (GSE123390, GSE56699)数据库中检索。采用加权基因共表达网络来识别rc相关模块。采用最小绝对收缩和选择算子分析筛选预后特征面板。通过生存曲线分析评估风险评分对预后的影响。根据相互作用蛋白和与肿瘤浸润免疫细胞的相关性预测预后基因的功能。利用Human Protein Atlas (HPA)工具验证蛋白表达水平。结果．利用TCGA和GSE123390数据集，共鉴定出247个差异表达基因(DEGs)。棕色和黄色模块(包括77个DEGs)被鉴定为RC保存。这两个模块中的5个DEGs (ASB2、GPR15、PRPH、RNASE7和TCL1A)构成了最佳预后标志面板。Kaplan-Meier曲线分析显示高危组患者预后较低危组。受试者工作特征(ROC)曲线分析表明，该风险评分对不良预后具有较高的预测精度，TCGA和GSE56699数据的ROC曲线下面积分别为0.915和0.827。这个5 - mrna分类器是一个独立的预后因素。其预测精度也高于所有临床因素模型。通过综合风险评分和临床因素，建立了预后nomogram预测图，显示了最高的预后能力。ASB2、PRPH和GPR15/TCL1A分别与CASQ2/PDK4/EPHA67、PTN和CXCL12相互作用。 TCL1A and GPR15 influenced the infiltration levels of B cells and dendritic cells, while the expression of PRPH was positively associated with the abundance of macrophages. HPA analysis supported the downregulation of PRPH, RNASE7, CASQ2, EPHA6, and PDK4 in RC compared with normal controls.结论．我们的免疫相关签名面板可能是一个有前途的预后指标的RC。

1.简介

以前，结肠癌(CC)和直肠癌(RC)被认为是单一的肿瘤实体(称为结直肠癌(CRC)) [1］．然而，最近的研究表明，在流行病学、病理学、分子机制和对治疗的反应方面存在显著差异[1］．据估计，发生RC的风险比CC高4倍，而且由于对当前治疗方案的反应较差，RC患者的5年生存率比CC患者低(60%比72%)[1- - - - - -3.］．因此，探索死亡风险高的早期分离RC患者的治疗方法，进而提供改进的专科护理，以进一步降低整体死亡率就显得尤为重要。

随着测序技术和生物信息学的发展，近年来有学者提出分子标记组可能比常规临床特征(如肿瘤淋巴结转移(TNM)期)更能有效预测预后[4，5］．Li等人确定了一个4 - mrna签名面板作为CRC的独立预后因素。该四mrna签名面板可以有效预测CRC患者的预后，受试者工作特征曲线下面积(ROC)曲线下面积(AUC)为0.730。分层分析表明，同样属于T期(T3+T4)、N期(N1+N2)、TNM期(III+IV)的患者也可以通过这个4基因签名面板将其分为高危组和低危组[6］．Zuo等人的研究显示，6 - mrna签名面板对区分高危患者和低危患者具有显著的预后价值，3年和5年生存率的AUC分别为0.711和0.683。在调整了临床因素后，这个6个基因的签名面板是OS的独立因素，可以预测早期(或晚期)TNM期患者的不同生存结局[7］．Sun等人开发了一种12基因表达签名面板，可以准确预测CC患者的预后，可以区分II/III期预后差与预后好的患者[8］．Chen等人发现由24个基因组成的16对基因组成的签名面板比TNM期具有更好的预后能力(AUC: 0.724 vs. 0.703;5年的一致性指数(c指数):0.869 vs.小于0.8 [9］．虽然也有研究确定与RC患者预后相关的mrna [10- - - - - -13]，目前还没有报告专门关注该特征面板，并将其预后价值与临床因素进行比较。

在本研究中，我们的目标是(1)加权基因共表达网络分析(WGCNA)筛选rc相关基因[14]，(2)利用最小绝对收缩和选择算子(LASSO)方法建立一个可靠的mRNA签名面板，用于预测RC患者的总生存期(OS) [15，16]，(3)通过分层分析比较AUC和c指数，验证其对各种临床特征的优越预后表现;(4)建立临床病理- mrna nomogram临床预测图，提高临床预测的准确性。

2.材料和方法

2.1.数据访问

从The Cancer Genome Atlas (TCGA;https://portal.gdc.cancer.gov)数据库，以“tcga -直肠腺癌(READ)”为关键词。该数据集中有177例READ病例和10例对照组。然而，只有162例READ病例提供了临床资料。因此，TCGA数据集(包括162例和10例对照组)作为我们后续分析的训练数据集。此外，我们还从基因表达Omnibus (GEO，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)资料库，以“直肠癌”为关键词。GSE123390用于WGCNA模型验证，因为它研究了人类RC组织中mRNA的表达谱( ）和控制( )．72例RC患者中有61例的预后信息来自GSE56699，因此我们使用GSE56699进行生存模型验证。研究流程图如图所示1．

2.2.差异表达基因(DEGs)鉴定

在TCGA-READ和GSE123390数据集上，使用R (version 3.34.7;https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html)[17］． 而且 被定义为统计阈值。利用R (version 1.0.8;https://cran.r-project.org/web/packages/pheatmap)，并利用生成的热图评估RC与对照之间基因表达模式的异质性。“绘制维恩图”在线工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn)用于识别TCGA-READ和GSE123390数据集之间的共享deg。使用gProfiler工具(http://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost)．基因本体论(GO)术语，京都基因和基因组百科全书(KEGG)，反应组通路 被认为具有统计学意义。

2.3.WGCNA

为了筛选与RC发育相关的基因，使用R中WGCNA包(版本1.61;https://cran.r-project.org/web/packages/WGCNA/index.html)[14]，通过这种方法，高度相关的mrna可以聚集到相同的共表达模块中。WGCNA包括六个步骤:(1)计算TCGA-READ和GSE123390数据集之间mrna的表达和连接相关性;(2)软阈值功率( ）根据无标度拓扑准则;(3)计算TCGA-READ中各基因之间的拓扑重叠矩阵差异，构建树状图并进行模块鉴定( 而且 ）动态砍树法[18];(四)保存评估( 而且 ）使用modulePreservation统计数据[19];(5)利用超几何算法将DEGs扩充为模块 ［20.];(6)共表达模块与临床信息的关联。

2.4.蛋白质-蛋白质相互作用网络

利用互作基因检索工具(Search Tool for The Retrieval of Interacting Genes, STRING;11.0版本;https://string-db.org)数据库(21］．只有与组合的交互 选用Cytoscape软件(版本3.4;http://www.cytoscape.org/)[22］．利用STRING中实现的KEGG、GO和Reactome分析了PPI网络中基因的功能。使用一种方法选择重要的GO项、KEGG途径和Reactome途径 作为统计阈值。

2.5.开发预测签名面板

采用单因素Cox回归分析从保存模块的DEGs中筛选os相关基因。具有日志级别的deg 在单因素分析中进入多因素Cox回归模型以确定独立的预测因子。惩罚包中的l1 -惩罚(LASSO) Cox比例风险模型(版本0.9-5;http://bioconductor.org/packages/penalized/)[15，16]进一步应用于这些独立预后deg，以选择最优的签名面板子集。根据预后相关的DEGs (Exp ._度)及其LASSO系数( )：

以中位风险评分为临界值，将患者分为高危组和低危组。采用Kaplan-Meier生存曲线分析和log-rank检验比较高危组和低危组OS差异。通过ROC曲线计算的AUC来估计风险评分的预测精度。这些分析首先在TCGA-READ数据集上进行，然后在GSE56699数据集上验证。

采用TCGA-READ队列单因素和多因素Cox分析评估风险评分是否独立于其他临床变量预测预后。采用Kaplan-Meier生存曲线分析来确定风险评分是否也是对具有相同临床特征的患者进行分层的有效工具。我们开发了一个包含风险评分和临床预后因素的nomogram预测3年和5年OS率的模型。通过AUC和c指数(使用survcomp包计算)来评估nomogram预测功能。http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/survcomp.html)．

2.6.免疫细胞浸润分析

通过肿瘤免疫估算资源(TIMER;https://cistrome.shinyapps.io/timer/)，基于Spearman相关检验。 根据肿瘤纯度被认为是显著的调整。

2.7.预后基因蛋白表达的验证

从人类蛋白图谱(Human Protein Atlas, HPA)中下载直肠和正常组织中与预后相关的DEGs及其相互作用基因的免疫组化结果，以确定其蛋白表达水平。

3.结果

3.1.在RC和正常控制之间的DEGs

基于的阈值 而且 ，TCGA数据集的162个RC组织和10个正常对照组织中筛选出1053个DEGs(830个下调，223个上调)，GSE123390数据集的28个RC组织和5个正常对照组织中筛选出1711个DEGs(728个下调，983个上调)。图中显示了这两个数据集的火山分布图和热图2(一个)而且2 (b)和数字2 (c)而且2 (d),分别。此外，我们还使用了在线工具Draw Venn Diagram来研究这两个数据集中的deg的交集。结果发现了268个重叠的DEGs，但只有247个DEGs的表达趋势一致(图2 (e)；表格S1)．

应用gProfiler在线工具集对247个基因进行功能富集分析。结果显示，9个氧化石墨烯分子功能项(如糖胺聚糖结合:核糖化酶A家族成员7 (RNASE7))、57个氧化石墨烯生物过程项(如内源性刺激的反应:钙螯素2 (CASQ2)、pyruvate脱氢酶激酶4 (PDK4)和C-X-C基序趋化因子配体12 (CXCL12));离子输运:CASQ2和CXCL12;对有机物的响应:CASQ2、TCL1家族AKT共激活因子A (TCL1A)和CXCL12;对化学物质的反应:PDK4和EPH受体A6 (EPHA6);趋化性:CXCL12和EPHA6;和心脏收缩调控:CASQ2)， 7个KEGG通路(如钙信号通路:CASQ2)， 5个Reactome通路(如肌肉收缩:CASQ2;GPCR配体结合:CXCL12)富集(表S2)．

3.2.WGCNA对rc相关模块的识别

相关分析显示，表达水平呈正相关( ， ）以及连通性( ， ）训练数据集TCGA和验证数据集GSE123390之间的rna。使用TCGA数据集，选择软阈值功率10创建无标度拓扑网络(首次达到0.9;平均连通性等于1)。树状图显示，利用TCGA数据集将这些基因聚类为9个模块(图2)3(一个))．这些模块也在GSE123390数据集的分析中得到验证(图3 (b))．其中，蓝色、棕色、灰色、红色、绿松石和黄色模块被认为是保存完好的，因为它们的 而且值< 0.051)．棕色和黄色模块被DEGs(富集)显著富集 而且值< 0.05)，表明它们可能对RC的发展尤其重要(表1)．棕色和黄色模块中的基因也被发现与RC患者的病理M、病理N、病理T、病理阶段、生存时间和死亡显著相关(图1)3 (c))．

3.3.PPI网络建设

将棕色和黄色模块中的77个deg上传到STRING数据库中，获取它们的交互关系。结果鉴定出69个DEGs之间的281对相互作用(如peripherin- (PRPH-) PTN, ankyrin repeat和含有2- (ASB2-) CASQ2/PDK4/EPHA6的SOCS box, G蛋白偶联受体15 (GPR15)/TCL1A-CXCL12)，用于构建PPI网络(图S1)．功能富集分析得到30个GO生物过程项(如心脏收缩调控:CASQ2;离子转运调控:CASQ2和CXCL12;组织重塑调控:PDK4;白细胞栓转负调控:CXCL12;以及负调控树突状细胞凋亡过程:CXCL12)、4条KEGG通路(如细胞色素P450代谢外来生物、化学致癌)、4条Reactome通路(如肌肉收缩:CASQ2)(表S3)．

3.4.预后风险评分的发展

单因素Cox回归分析发现35个DEGs与OS显著相关，包括EPHA6(风险比 )，CASQ2 ( )，和PDK4 ( ）(表S4)．经多因素Cox回归分析筛选出其中8例为独立预后预测因子(表)S5)．使用基于lasso的Cox PH模型进一步发现，5个DEGs (ASB2、GPR15、PRPH、RNASE7和TCL1A)可能是预后预测的最佳标志面板(表)2)．

在训练TCGA数据集和验证GSE56699数据集中，每个患者的预后风险评分由以下公式估计: ．根据风险评分中位数将患者分为低危组和高危组。Kaplan-Meier曲线分析显示高危组患者预后明显差于低危组(TCGA: ，95%置信区间 -14.88, ，数字4(一);GSE56699: ，95％ -25.50, ，数字4(b))。ROC曲线分析显示，该风险评分对不良预后具有较高的预测精度，AUC为0.915(图4(c))和0.827(图4(d))，分别为TCGA和GSE56699数据集。

利用风险评分和其他临床因素进行单因素和多因素Cox回归分析，以确认我们的5个mrna签名面板的独立性。结果显示，在对临床病理因素进行多变量调整后，风险评分仍与患者OS显著相关3.)，提示这种基于5 mrna的分类器是一个独立的预后因素。此外，风险评分显示有能力进一步分类65岁以上的人群( )，病理M0 ( )，病理N0 ( )，及病理II期( ）预测其不同的预后结果(图5)，提示其预后优于常规临床因素。此外，随时间变化的ROC曲线分析也表明，风险评分( ；C - ）的比例高于年龄( ；C - )，病理( ；C - )，病理N ( ；C - )，及病理阶段( ；C - ）以及包含所有临床因素的模型( ；C - ）(图6(一))．因此，风险评分应与临床因素相结合，以更好地预测临床预后，并以此为基础制定预后nomogram临床预测图(图2)6 (b))．与预期的一样，nomogram ogram的AUC(0.976)和c指数(0.913)均高于任何临床因素模型和风险评分模型(图2)6(一))．

3.5.预后相关基因mRNA水平与肿瘤浸润免疫细胞的相关性

TIMER分析显示ASB2/TCL1A表达与B细胞、CD4+ T细胞、树突状细胞显著相关;GPR15的表达与B细胞和树突状细胞(dc)的丰度呈正相关;PRPH表达与CD4+ T细胞和巨噬细胞浸润水平呈正相关(图7)．RNASE7的表达与所有6种免疫细胞的浸润水平之间均未观察到显著的相关性(图7)．

3.6.预后基因蛋白表达的验证

利用HPA数据库的免疫染色结果验证5个特征基因及其相互作用基因的表达。结果支持与正常对照相比，RC中PRPH、RNASE7、CASQ2、EPHA6和PDK4的下调8)．RC组织和正常直肠组织均未检出GPR15、TCL1A和PTN。ASB2和CXCL12未见免疫染色证据。未采直肠标本研究RC中PDK4的表达。

4.讨论

在本研究中，我们基于5种预后相关的deg (ASB2、GPR15、PRPH、RNASE7和TCL1A)建立了风险评分模型。ROC曲线分析表明，该5-mRNA签名面板能够准确预测RC患者的预后，训练数据集和验证数据集的AUC分别为0.915和0.827。我们的风险评分的预后表现似乎优于先前报道的CRC签名面板(如4个基因: 用于外部数据集，用于内部数据集的0.607 [4];6基因: ［7];和9基因: ［23]或CC(16对基因: ［9];9基因: ［22])。此外，在Zuo等人的研究中[7]，他们进行了亚组分析，以确认6基因签名面板是否对结肠腺癌(COAD)和READ有效。因此，COAD和READ的AUC分别为0.653和0.74，均低于我们的signature panel。此外，与其他CRC或CC患者识别的签名面板一致[6- - - - - -9，24]，我们的风险评分被证明是预测预后的独立因素，并对TNM分期相同的患者进行生存分层。此外，AUC和风险评分的c指数也高于年龄( ；C - )，病理( ；C - )，病理N ( ；C - )，及病理阶段( ；C - ）以及包含所有临床因素的模型( ；C - )．这些结果表明，我们的风险评分可能作为一个有效的分子生物标志物来预测RC患者的不良预后。为了更好地指导临床预后，一些作者建议将分子预后模型与临床病理模型相结合[24- - - - - -27，它显示出了最高的预测能力。与这些研究一致的是，我们的结果还显示，结合5 - mrna分类器和4个临床危险因素(年龄、病理M、病理N和病理分期)的nomogram ogram曲线下面积(AUC)最高(0.976)，c指数最高(0.913)。

虽然所有的5个签名基因都不包括在以前CRC的签名面板中[6- - - - - -9，24]，其中部分与CRC的进展及预后相关(包括ASB2、GPR15、TCL1A、PRPH) [28- - - - - -31］．ASB2的高表达预示着CRC患者的短期无复发生存[28］．造血细胞中ASB2缺失对小鼠结肠缩短和肿瘤负荷有抑制作用。功能分析表明ASB2可能通过降低Th1、Th17和细胞毒性CD8+ T细胞反应发挥促肿瘤作用，从而保护肿瘤进展[28］．与Spinner等人的研究一致[28]，我们的结果也显示ASB2高水平患者的OS率可能比低表达患者的OS率高12.505倍。此外，ASB2被预测与趋化相关的EPHA6基因相互作用，EPHA6基因高甲基化可通过抗炎白细胞介素-6导致EPHA6表达下调[32，33]，一种Th17细胞生物标志物[34］．EPHA6基因的表达降低了前列腺癌细胞的侵袭能力在体外减少肺和淋巴结转移在活的有机体内［35］．在乳腺癌患者中，高EPHA6表达与较低的OS率相关[36]及我们的RC ( )．除了EPHA6，我们还预测ASB2可能通过影响CASQ2和PDK4的表达参与RC。高表达CASQ2 [37]及PDK4 [38]被报道与癌症患者较差的OS和无病生存显著相关。过表达PDK4促进细胞增殖、侵袭和肿瘤生长在活的有机体内［38］．CASQ2 ( ）和PDK4 ( ）我们对RC的研究也证实了这一点。TCL1A通过在免疫B细胞亚群(CD3-/CD19+/CD10+/CD34-)中表达对癌症的发展至关重要。高TCL1A/CD20 (B细胞)比例或TCL1A表达与生存率的提高相关[39，40］．与其他癌症一致[39，40]，我们的研究亦显示TCL1A对RC患者的生存具有保护性风险( ）并且与B细胞的丰度呈正相关。此外，我们预测TCL1A可能与CXCL12相互作用，CXCL12是一个趋化因子基因，在我们的功能富集分析中，我们推测该基因参与调控树突状细胞凋亡过程。据报道，CXCL12高表达给乳腺癌患者带来生存优势[41]及第三阶段CC [42］．转化生长因子-沉默CXCL12β肿瘤原发部位的间充质间质细胞通过增加CXCL12受体CXCR7的表达促进肿瘤转移[43］．一项荟萃分析显示，dc免疫治疗显著改善肝癌患者6个月、1年、3年和5年的OS [44］．dc共培养能明显抑制肝癌干细胞的生长在体外而且在活的有机体内［45］．与这些发现一致的是，我们还发现TCL1A的表达与DCs的浸润呈显著正相关。Wang和Wang利用TCGA和基因型-组织表达数据发现，与正常组织相比，GPR15在COAD和READ中显著低表达[30.，这在我们的研究中得到了验证。GPR15的表达与COAD患者的预后呈显著正相关(即高表达者OS更长)[30.]，这在我们的阅读阅读研究中也观察到了。Wang和Wang认为GPR15可能是一种肿瘤抑制因子，通过调控免疫系统中富集的一系列基因，增加B细胞(颈部鳞癌、肺腺癌、胃腺癌)、CD4+ T细胞、dc(颈部鳞癌、胃腺癌)的浸润[30.］．同样，我们发现GPR15的表达与肿瘤浸润免疫B细胞和dc的水平呈正相关，并预测GPR15可以与dc相关的CXCL12相互作用参与RC进展。CD133+人脐带造血祖细胞可促进CRC细胞的增殖和侵袭在体外促进肿瘤生长和转移在活的有机体内上调PRPH [31］．然而，PRPH在CRC中的作用机制尚不清楚。在本研究中，我们推测PRPH可能通过与下游PTN相互作用发挥作用。肿瘤相关巨噬细胞通过分泌PTN增加淋巴瘤中肿瘤干细胞的比例[46］．上调PTN通过激活NF-促进肿瘤细胞增殖，抑制细胞凋亡和化学敏感性κB通路(46，47］．meta分析显示，肿瘤患者PTN高表达与TNM晚期和OS较差显著相关[48］．与这些研究相似，我们也报道了PRPH与肿瘤相关的巨噬细胞呈正相关。

虽然编码一种抗菌肽的RNASE7没有被证明与CRC相关，但其自身及其家族成员在其他癌症中的作用可能间接验证我们的结论。Scola等报道RNASE7在恶性转化过程中表达逐渐降低，在健康皮肤中表达最高，在口腔鳞状细胞癌中表达最低[49］．RNase家族成员的低表达导致了对细菌感染的免疫防御的丧失[50- - - - - -53]，这是引发癌症的重要原因。RNase L的下调增加了前列腺癌细胞的迁移[54]，并可促进小鼠前列腺植入后的肿瘤生长及转移[55]，其机制与整合素在细胞表面表达增加有关β1和局灶黏附激酶-肉瘤通路的激活和ras相关的C3肉毒毒素底物1-鸟苷三磷酸酶活性[54］．RNase H2水平较低的结直肠肿瘤生存时间明显较短[56］．在这些研究中，我们也证明了RNASE7在RC中是下调的，且RNASE7水平较高的患者与对照组相比，OS更长。

在这项研究中应该承认一些局限性。首先，基于从公共数据集(TCGA和GSE56699)回顾性收集的生存信息，开发并验证预后标志面板。我们需要在我院开展前瞻性试验，以进一步验证该签名面板的预后价值。其次，利用公共TCGA和GSE123390数据集对这些签名DEGs的表达式进行了识别。在这些数据集中，正常组的样本数量比癌症组的样本数量要少得多。这种不平衡可能会导致统计问题。RC组和对照组的样本量应设计一致，以进一步证实其表达。第三，临床(PCR、免疫组化、Pearson相关性)，在体外(免疫细胞共沉淀、敲除、过表达或共孵育)和在活的有机体内(肿瘤移植、模拟物、siRNA转染和免疫治疗)实验应探索我们的特征基因(PRPH-PTN、ASB2-CASQ2/PDK4/EPHA67和GPR15/TCL1A-CXCL12)之间的PPI关系，并评估我们的特征基因在RC进展中的功能(特别是RNASE7，此前未在CRC中报道)。第四，其他分组变量选择方法(如Elastic net和CoxBoost) [57]，以识别预后标志板应单独使用或与LASSO联合使用，以识别更有效的预后指标的RC。第五，比较CC和RC样本中特征基因的表达、预后能力和功能。

5.结论

我们的研究开发了一个五mrna签名面板(ASB2, GPR15, PRPH, RNASE7和TCL1A)作为RC的免疫相关预后生物标志物。该签名面板在对死亡风险较高的患者进行分层时表现出极好的准确性。将风险评分与临床特征(年龄、病理M、病理N、病理分期)相结合的nomogram信息图谱可以更有效地指导临床个性化治疗决策。

数据可用性

为这项研究生成的数据集可在GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/；GSE123390, GSE56699)及TCGA (https://gdc-portal.nci.nih.gov/)．

的利益冲突

作者声明不存在利益冲突。

作者的贡献

HH、XSL、TXS和HKP构想了这项研究。HH和XSL收集数据并进行统计分析。CAD, LF, WJZ参与了文献调查和结果解释。HH和XSL起草了这篇文章。TXS和HKP修改了原稿。所有作者已经阅读并批准了文章的最终版本。黄鹤和许世雷对这一工作做出了同等的贡献。

补充材料

图S1:由关键模块基因构建的蛋白质-蛋白质相互作用网络。红色,调节的表情;绿色,表达下调表达。表S1:在GSE123390和TCGA数据集中识别的通用deg。表S2:两个数据集中共同差异表达基因的函数富集。表S3: PPI网络中基因的功能富集。表S4:与OS相关的DEGs的单因素Cox回归分析。表S5:与OS相关的DEGs的多因素Cox回归分析。（补充材料）

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