分析细胞病理学

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分析细胞病理学/2021/文章

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体积 2021 |文章的ID 9652420 | https://doi.org/10.1155/2021/9652420

谢毅,薛从玉,郭帅,杨磊 MicroRNA-520a通过靶向RRM2/Wnt轴抑制非小细胞肺癌的发病和进展”,分析细胞病理学 卷。2021 文章的ID9652420 12 页面 2021 https://doi.org/10.1155/2021/9652420

MicroRNA-520a通过靶向RRM2/Wnt轴抑制非小细胞肺癌的发病和进展

学术编辑器:Consuelo Amantini
收到了 4月27日
修改后的 2021年1月14日
接受 2021年2月25日
发表 2021年3月31日

摘要

MicroRNAs (miRNAs)调节多种细胞行为,其异常表达往往与疾病进展相关。本研究重点研究了miR-520a在非小细胞肺癌(NSCLC)发展中的作用以及相关分子。收集24例NSCLC患者的肿瘤组织和正常组织。使用微阵列筛选肿瘤组织和正常组织之间差异表达的mirna,并筛选出miR-520a在肿瘤样本中显著低表达。MTT、EdU标记、transwell和流式细胞术分别显示,人工上调miR-520a可降低NSCLC A549和H460细胞的增殖、迁移和侵袭以及对死亡的耐药性。miR-520a的上调抑制了体内异种移植瘤的生长和转移。综合生物信息学分析和双荧光素酶分析表明,miR-520a靶向核糖核酸还原酶亚基2 (RRM2) mRNA并灭活Wnt/β-catenin信号通路。RRM2的上调增强了非小细胞肺癌的恶性行为,但在miR-520a过表达后,RRM2的致癌作用被阻断。综上所述,本研究证明miR-520a通过抑制RRM2和Wnt信号通路抑制NSCLC的进展。这篇论文可能会为NSCLC的治疗提供新的见解。

1.简介

肺癌(LC)是最常见和危及生命的癌症类型之一,估计占2020年癌症相关死亡率的近四分之一[1].LC按病理类型分为非小细胞肺癌(NSCLC,占所有病例的近85%)和小细胞肺癌(占所有病例的15%)两大亚型[2].在中国,LC在所有癌症类型中死亡率最高[3.].尽管手术、放疗、化疗等常规治疗方案有所改善,LC患者的治疗效果仍不理想[4].一个主要原因是相当一部分LC患者最初诊断时已处于具有转移性的晚期,这些患者的总体5年生存率极低,约为5% [必威24901].识别LC生长和转移的关键分子对于开发新的治疗方案具有重要意义。

基因疗法是一种很有前途的疾病治疗靶点,引起了广泛关注。大约97%的人类基因组被转录为非编码(nc) rna,并能在dna - rna -蛋白质水平上调节分子过程[5].MicroRNAs (miRNAs)主要被研究为短的ncRNAs,以其主要通过与3相互作用来控制基因表达的能力而闻名 -目标mrna的UTR [6].由于其强大的基因修饰功能,miRNAs在包括LC在内的几种癌症中可调节多种基本细胞过程,包括凋亡、增殖、细胞分化维持和肿瘤发生[7].本研究中的微阵列分析确定miR-520a是NSCLC组织中异常低表达的miRNA。miR-520a已被证明是许多人类恶性肿瘤的肿瘤抑制剂[8- - - - - -11].其他RNA转录物下调miR-520-3p被认为促进NSCLC的进展[1213].然而,miR-520a在NSCLC中的独立作用及其涉及的下游分子尚不完全清楚。在这里,我们的综合生物信息学分析表明,核糖核苷酸还原酶亚基2 (RRM2) mRNA是miR-520a的潜在靶转录本。RRM2在许多恶性肿瘤如胃癌中显示出致癌作用[14]及胰腺癌[15].在此,我们假设miRNA-520a通过抑制RRM2来抑制NSCLC的进展,并进行了细胞和动物实验来验证这一假设。

2.材料与方法

2.1.临床样本采集

纳入2015年1月至2016年1月在山东省胸科医院确诊并治疗的24例NSCLC患者。排除有其他慢性疾病、化疗/放疗史或恶性肿瘤家族史的患者。术中切除肿瘤组织及邻近正常组织(距离病变部位5cm以上),立即用液氮冷冻,-80℃保存备用。进行了为期三年的随访研究。本研究由山东省胸科医院伦理委员会批准并监督。收集每位符合条件的患者签署的知情同意书。所有参与者的临床特征信息见表1


集团 n

性别 男性 14
10
年龄 ≤60 11
> 60 13
TNM I和II 5
III及IV 19
淋巴结转移 6
积极的 18
肿瘤大小 ≤3cm 15
> 3厘米 9
组织学 腺癌 10
鳞状细胞癌 8
其他人 6

注:TNM:肿瘤淋巴结转移。
2.2.苏木精和伊红(HE)染色

采集的患者组织和小鼠肝、肺组织(见下图)用石蜡包埋,切成5-μ片。组织切片在60°C下依次烘烤1小时,在二甲苯I、II、III中浸泡(各10分钟),按升序酒精脱水5分钟,水洗5分钟。切片在苏木精溶液中染色8分钟,0.5%盐酸-乙醇混合物中分化10秒,氨水浸泡40秒,0.5%伊红染色5分钟。之后,将切片按递减的酒精顺序再水化,用中性香脂密封(96949-21-2,Solarbio, Science & Technology Co., China Beijing, China),然后在显微镜下观察(BX53, Olympus Optical Co., Ltd, Tokyo, Japan),随机选取5个场。细胞核呈蓝色,胞浆呈红色。对每一组,从同一组织样本中抽取三片进行染色。

2.3.微阵列分析

分别使用miRNeasy试剂盒(217061,Qiagen GmbH, Hilden,德国)和mirVana miRNA分离试剂盒(AM1560, Ambion, Austin, Texas, USA)从15 mg NSCLC和邻近组织中提取总RNA。RNA纯度由Nano Drop (2000/2000C, Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA)检测。随后,收集100 ng RNA,并使用miRNA完全标记和Hyb试剂盒(5190-0456,Agilent Technologies, Inc.)进行标记。韦克菲尔德,MA,美国)。然后,将样品与Human V2 mi RNA Microarrays (G4470B, Agilent)在200 rpm、60°C下杂交20小时。图像使用DNA微阵列扫描仪(G2505-60525,安捷伦)进行扫描和分析,而数据通过genspring GX (V11.5,安捷伦)获得和分析。

2.4.生物信息学分析

数据分析使用 -语言包(3.6.3版本)。微阵列结果分析使用Limma软件包(http://www.bioconductor.org/).筛选肿瘤组织与正常组织间差异表达的mirna 而且 作为筛选标准。该热图是使用一个pheatmap包制作的(https://cran.r-project.org/web/packages/pheatmap/index.html).miR-520a在NSCLC中的表达和预后价值首次在The Cancer Genome Atlas (TCGA,肿瘤基因组图谱)上预测。https://cancergenome.nih.gov/).miR-520a的靶mrna在多个生物信息系统上进行预测,包括StarBase (http://starbase.sysu.edu.cn/)、TargetScan (http://www.targetscan.org), miRDB (http://www.mirdb.org),及miRbase (http://www.mirbase.org).使用gplot程序包(https://cran.r-project.org/web/packages/gplots/),并使用clusterProfiler包(http://www.bioconductor.org/).

2.5.逆转录-定量聚合酶链反应(RT-qPCR)

使用TRIzol试剂(赛默飞世尔科学公司)从组织和细胞中提取总RNA。然后,使用高容量cDNA逆转录试剂盒(4368814,Thermo Fisher Scientific)将RNA逆转录为cDNA。随后,在7900HT快速实时PCR系统(Applied Biosystems, Foster City, CA)上使用TaqMan microRNA检测试剂盒(4427975,Thermo Fisher Scientific)进行实时qPCR。利用2-ΔΔCt方法。引物序列见表2,其中miRNA以U6为内对照,RRM2 mRNA以GAPDH为对照。


基因 引物序列(5 -3.

mir - 520 a F: GCCACCACCATCAGCCATAC
接待员:GCACATTACTCTACTCAGAAGGG
RRM2 F: CCTGACTGTAAATCGTCCAGTGGTA
接待员:AGTTTGGAAGCGACTGTAGGT
U6 F: CTCGCAGCGCTTCGACA
接待员:ACTTGCGGCTTCACGAATT
GAPDH F: GATATATGATCAGTCATCTGC
接待员:TTGGATGATCTGGTTTAGCG

注:RT-qPCR:逆转录定量聚合酶链反应;RRM2:核糖核苷酸还原酶亚基2;GAPDH:甘油醛-3-磷酸脱氢酶;F:向前;接待员:逆转。
2.6.细胞培养和转染

肺大细胞癌细胞株H273 (CRL-5917)和H460 (HTB-177),肺腺癌细胞株H23 (CRL-5800)和A549 (CCL-185),正常肺上皮细胞株16HBE (PCS-300-010)和HEK293T (CRL-3216)细胞购自American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA)。细胞在含有10%胎牛血清(FBS, North Andover, MA, USA)的rmi -1640 (21870076, Thermo Fisher Scientific)中培养,37℃,5% CO2.miR-520模拟物和RRM2过表达(OE)载体由瑞博生物有限公司(中国广东广州)合成。使用Lipofectamine 2000 DNA转染试剂(11668027,赛默飞雪科学公司)进行细胞转染。简而言之,当细胞合流达到80%时,将Lipofectamine Reagent在Opti-MEM中稀释,同时使用另一个Opti-MEM稀释DNA。稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000按1:1的比例混合。5分钟后,细胞充满dna -脂质化合物,37℃培养48小时。

2.7.3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑(MTT)测定

指数生长的细胞被重悬到 细胞悬液在100孔时被分类到96孔板中μL,直到细胞密度达到 细胞/孔(边缘孔用无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)填充以消除潜在的边缘效应)。每组设3个重复井。培养皿在37°C、5% CO的培养箱中培养2.每24小时取出一个平板进行测量。简而言之,每口井装了20个μL MTT溶液(M1025, Solarbio),细胞再孵育4小时。然后丢弃井中的培养基,每井进一步装入150μL二甲基亚砜充分溶解结晶紫罗兰。然后,使用microplate阅读器(Varioskan LUX, Thermo Fisher Scientific)确定每口井570 nm处的光密度。对所得数据进行分析,得到MTT增殖曲线。

2.8.5-Ethynyl-2 -脱氧尿苷(EdU)标记法

指数生长的细胞被分成6孔板。当细胞融合度达到80%时,10μM EdU溶液(Genecopoeia, USA)加载到每口井中。细胞孵育2小时,PBS洗涤,4%多聚甲醛固定30分钟,甘氨酸溶液孵育,用含0.5% TritonX-100的PBS漂洗。随后,细胞用Andy Fluor™555叠氮化物(A004, Genecopoeia, USA)在黑暗中孵育30分钟,在甲醇和PBS中洗涤,并进一步用4 6-二氨基苯基吲哚(DAPI) 20分钟。荧光显微镜下观察标记(XSP-BM13C,上海CSOIF。有限公司,上海,中国)在×400放大,包括3个随机场。edu -阳性细胞用DAPI染色为红色,所有细胞用DAPI染色为蓝色:

2.9.Transwell化验

24孔板用于跨井分析。将Matrigel凝胶(Corning, Corning, NY, USA)以5:1的比例稀释在无血清rmi -1640中,然后加载到根尖腔(80μL),维持1-2小时,同时每个底外侧腔充填500μL 10% fbs - rpm -1640。将细胞接种到24孔板中,孵育24小时。侵入下膜的细胞用4%多聚甲醛固定,结晶紫染色液(C0121,百时生物科技有限公司,中国上海)染色10分钟。染色在显微镜下观察(BX53, Olympus Optical Co., Ltd, Tokyo, Japan),放大率为×400,包括5个随机场。除了在根尖室预涂基质凝胶外,用类似的方法检查细胞迁移。计数入侵和迁移细胞数量,并计算3个重复孔的平均值。

2.10.流式细胞术

采用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(15342-54,Nacalai, Tesque, Japan)检测细胞凋亡。转染后,细胞在37℃、5% CO下培养248小时,以1000转/分的速度离心3分钟,在PBS中清洗,然后再次离心。然后,20μ200中增加了L Annexin V Binding Buffer (×10)μL PBS。细胞在PBS中重悬,然后与10μL膜联蛋白V-FITC共轭和5μL PI溶液在室温黑暗中静置15分钟。然后,细胞中加入300μL结合缓冲液,激发波长488 nm用流式细胞仪测定(6028651,Beckman Coulter, USA)。

2.11.双荧光素酶报告基因检测

3 -将含有推测与miR-520a结合序列的RRM2、SDC1和YWHAZ mrna的UTR序列插入pGL3载体(kl-zl-1031,中国上海科磊生物科技有限公司),构建基于pGL3的宽型(WT)载体。利用突变结合序列构建相应的突变型(MT)载体。利用Lipofectamine 2000试剂盒将构建良好的载体与miR-520a模拟物或模拟对照共转染HEK293T细胞。48小时后,收集并裂解细胞,使用荧光素酶报告检测试剂盒(K801-200, Biovision)和双荧光素酶报告检测系统(E1910, Promega, Madison, WI, USA)评估细胞中的相对荧光素酶活性。

2.12.Western Blot分析

细胞在PBS中离心和洗涤,并在含有蛋白酶抑制剂的Tris (50 mM Tris- hcl, 150 mM NaCl)中重悬。使用Pierce™BCA蛋白检测试剂盒(23225,赛默飞世尔科学公司)测定蛋白质浓度。然后,用8%-12%的SDS-PAGE分离适当体积的蛋白质,转移到PVDF膜上(LM-937D, LMAI Bio, Shanghai, China)。膜被阻塞,在5%的脱脂牛奶中洗涤1小时,然后与b细胞淋巴瘤-2 (Bcl-2, 1:10 00, sc-7382, SANTA CRUZ, USA)、Bcl-2相关x (Bax, 1:5 00, sc-7480, SANTA CRUZ)、caspase-3 (1:10 00, ab208161, Abcam, Inc., Cambridge, MA, USA)、裂解的caspase-3 (1:5 00, ab2302, Abcam)孵育1小时,β-catenin (1: 1000, ab208161, Abcam), cyclin D1 (1: 500, sc-8396, SANTA CRUZ),和β-肌动蛋白(1:1000,#3700,细胞信号技术)在4°C 16小时。清洗后,用IgG二抗(1:5 0,ab205719, Abcam)和cleaved caspase (1:10 0, ab205718, Abcam)在20℃下孵育2小时。使用增强化学发光蛋白印迹底物(PE0010, Solarbio)开发蛋白条带,并使用western Blot成像系统(FluorChem M, ProteinSimple)捕获和分析图像。

2.13.裸鼠异种移植瘤的生长

雌性裸鼠12只(品系:BALB/c;3-4周大, 均购自中国北京Vital River实验动物科技有限公司。小鼠被喂食在恒定的25°C, 45%的湿度,自由获得食物和水。小鼠被随机分为4组:miR-520a对照组( 每只小鼠注射转染miR-520a对照的A549细胞,miR-520a模拟组( 每只小鼠注射转染miR-520a mimic的A549细胞),对照组( 每只小鼠注射转染miR-520a对照的H460细胞),miR-520a模拟组( 每只小鼠注射转染miR-520a mimic的H460细胞)。对于细胞植入,将稳定转染miR-520a mimic或mimic对照的指数生长的A549/H460细胞调整为 细胞/毫升。然后,每只小鼠移植20个μ腋下注射L细胞悬浮液,然后拍照记录肿瘤在体内的生长情况。肿瘤体积( 每7天记录一次,如下: (其中“a”为长直径,“b”为短直径),生成生长曲线。28天后,用过量1%戊巴比妥钠(150 mg/kg)对小鼠实施安乐死,并收集肿瘤并称重[16].所有手术均按照山东省胸科医院动物伦理委员会的指导方针进行。人们做出了巨大的努力来减少动物的使用和痛苦。

2.14.裸鼠肿瘤转移

另取12只裸鼠按体重编号,按上述方法再次分为4组( 在每组中)。为了测量肿瘤转移,通过尾静脉将稳定转染miR-520a模拟物或模拟对照的A549/H460细胞注射到小鼠体内。45只老鼠被以类似的方式安乐死th注射后一天。然后,采集小鼠肺、肝组织,石蜡包埋,切片HE染色。显微镜下观察组织中转移结节的形成,包括5个不重叠的野区。

2.15.统计分析

采用SPSS 22.0 (IBM公司Armonk, NY, USA)进行数据分析。测量数据采集自三个独立的实验,表示为 (SD)。对每两组间的数据进行分析 -多组间采用单因素或双因素方差分析(ANOVA),然后采用Tukey多重比较检验。的 值从双尾测试中获得,并且 认为具有统计学意义。

3.结果

3.1.miR-520a在NSCLC组织和细胞中低表达

收集3例NSCLC患者的组织样本进行HE染色和miRNA芯片分析。染色结果显示NSCLC组织中细胞结构破坏,细胞核缩小,提示肺损伤严重(图1(一)).然后,从三对组织中提取的RNA样本用于微阵列分析。重要的是,与邻近组织相比,miR-520a在NSCLC肿瘤组织中被发现显著下调(图1 (b)).为了验证这一点,所有24例患者的组织都被用于RT-qPCR。因此,与配对的相邻组织相比,在NSCLC组织中发现miR-520a表达较差(图1 (c)).随访研究结果显示,miR-520a水平较高的患者预后较好,生存期较长(图1 (d)).此外,RT-qPCR还检测了miR-520a在NSCLC细胞株H273、H23、A549和H460以及正常肺上皮细胞16HBE中的表达。结果发现,与16种HBE细胞相比,所有NSCLC细胞系的miR-520a表达均有所下降(图1 (e)).其中,miR-520a表达最低的A549和H460细胞转染miR-520a mimic或mimic对照供后续使用(图1 (f)).此外,根据TCGA数据库的数据,miR-520a在NSCLC中低表达(图1 (g)), miR-520a低表达提示NSCLC患者预后不良(图1 (h)).这些结果表明miR-520a可能在NSCLC中具有预后价值。

3.2.人工上调miR-520a抑制NSCLC进展

随后,我们发现miRNA mimic过表达miR-520a导致edu -阳性A549和H460细胞数量显著下降(图2(一个)).MTT实验结果表明,miR-520a过表达后,增殖的A549和H460细胞数量减少(图520a过表达后A549和H460细胞数量减少)2 (b)).在细胞迁移和侵袭方面,transwell实验结果表明,过表达miR-520a后,A549和H460细胞的迁移和侵袭能力均降低(图2 (c)而且2 (d)).此外,流式细胞术结果显示,miR-520过表达增加了Annexin V-和pi阳性细胞的数量,即增加了A549和H460细胞的凋亡(图2 (e)).从分子角度来看,发现miR-520a mimic降低了Bcl-2的水平,但增加了Bax和cleaved - caspase-3的水平(图2 (f)).总的来说,这些结果表明miR-520a可以抑制NSCLC细胞的恶性行为。

3.3.miR-520a直接结合RRM2介导Wnt信号通路

为了进一步识别潜在的下游分子,我们首先预测了miR-520a在几个生物信息学系统上的靶mrna,包括StarBase、TargetScan、miRDB和miRBase,发现219个mrna是交叉的(图3(一个)).然后,基于这些基因进行GO富集分析,发现Wnt信号高度富集(图3 (b)),该信号通路中富集了18个基因。然后,检测Wnt信号通路相关因子cyclin D1和β-catenin在A549和H460细胞系中的表达。western blot分析结果表明,细胞周期蛋白D1和β在miR-520a过表达后,两种细胞中的-catenin水平均下降(图3 (c)),表明miR-520a灭活了Wnt信号。随后,我们利用RT-qPCR检测组织中Wnt信号富集mrna的表达情况。结果发现,与配对的正常组织相比,SDC1、YWHAZ和RRM2在肿瘤组织中的表达明显增加(图3 (d)).然后,荧光素酶测定验证了只有RRM2与miR-520a存在结合关系(图3 (e)).相关性分析显示,在NSCLC肿瘤组织中,miR-520a的表达与RRM2 mRNA的表达呈负相关(图3 (f)).与上述结果一致,RRM2在NSCLC细胞系中的表达高于16HBE细胞(图3 (g)).此外,miR-520a mimic被发现可以降低A549和H460细胞中RRM2的表达(图3 (h)).此外,细胞中RRM2的过表达增加了cyclin D1和β-catenin在A549和H460细胞中的表达(图3(我)),提示miR-520a可能通过下调RRM2的表达使Wnt信号通路失活。

3.4.miR-520a抑制RRM2在NSCLC进展中的致癌作用

为了证实RRM2参与了miR-520a介导的事件,用RRM2 OE载体转染的A549和H460细胞进一步转染miR-520a mimic(图4(一)).结果发现,RRM2增加的细胞活力在进一步上调miR-520a后被逆转(图4 (b)).此外,与单独转染RRM2 OE载体相比,共转染miR-520a和RRM2 OE载体减少了迁移和入侵细胞的数量,增加了凋亡细胞的数量(图)4 (c)- - - - - -4 (e)).这些结果共同验证了miR-520a直接结合RRM2抑制NSCLC细胞的恶性行为。

3.5.miR-520a在体内抑制肿瘤生长和转移

稳定转染miR-520a mimic/对照的A549和H460细胞通过腋窝注射(用于生长测量)或尾静脉注射(用于转移测量)植入裸鼠。每7天测量小鼠肿瘤体积。研究发现,过表达miR-520a可显著降低小鼠肿瘤生长速率(图5(一个)).28天后,当小鼠被安乐死时,发现miR-520a模拟物也降低了裸鼠的肿瘤重量(图5 (b)).此外,HE染色结果显示肺转移结节的数量(图5 (c))和肝脏(图5 (d))组织被miR-520a mimic减少。

4.讨论

NSCLC仍然是世界范围内最普遍的癌症,因此也是癌症相关发病率的最大原因,这使得了解NSCLC的生物学和识别涉及发病机制的新分子变得非常紧迫[17].miRNA靶向治疗,包括miRNA替代和miRNA减少,其中寡核苷酸、基于病毒的结构物或小分子化合物被用于恢复抑制性miRNA的表达或抑制致癌miRNA的表达,已在LC治疗中引起越来越多的关注[18].本研究表明,miR-520a在细胞模型和动物模型中均通过下调RRM2和抑制Wnt信号通路在NSCLC中发挥了较强的抑瘤作用。

miRNA的异常表达通常与包括癌症在内的疾病的发生和发展有关[19].在这里,miRNA芯片分析和RT-qPCR结果表明,miR-520a在NSCLC肿瘤样本中下调。高水平的miR-520a与NSCLC患者更好的预后相关,人工上调miR-520a抑制了NSCLC细胞系的增殖、迁移、侵袭和对死亡的抵抗。越来越多的证据强调了miRNAs在NSCLC发病机制中的核心功能,无论是致癌的还是反致癌的。例如,据报道,miR-218在NSCLC中是一种强抑瘤因子,它通过靶向白介素-6受体和JAK3抑制NSCLC细胞的恶性行为和肿瘤生长[20.].miR-421被发现是一种癌基因,通过靶向PCDC4促进NSCLC细胞的增殖和侵袭潜能[21].至于miR-520a,已被报道在许多肿瘤疾病中作为肿瘤抑制因子。例如,利多卡因上调miR-520a-3p被发现可以阻断结直肠癌细胞的增殖并引发细胞凋亡[22].miR-520a类似的肿瘤抑制功能已在骨肉瘤中得到证实[23]和乳癌[24].NSCLC也是如此。最近的研究指出,其他RNA转录物下调miR-520a会增加NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭[121325].同样,Lv X等先前的研究表明,miR-520a-3p通过介导PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制NSCLC细胞的生长和侵袭性[26].在这里,我们的研究验证了miR-520a在NSCLC细胞中的抗癌作用。此外,我们进一步进行了动物实验,在体内证实了上调miR-520a可以抑制NSCLC细胞形成的异种移植瘤的生长和转移。

随后,使用综合生物信息学分析预测了219个miR-520a的候选靶标mrna。然后,GO富集分析证实Wnt信号通路被这些mrna富集。Wnt信号通路是一种进化的高度保守的信号通路,对发展和稳态很重要,其异常激活是许多癌症发生、维持和发展的关键因素[27- - - - - -29].NSCLC也不例外,Wnt失活已被认为是NSCLC治疗的一种有前途的治疗选择[30.31].有趣的是,miR-520a已被证明是通过Wnt信号通路介导食管鳞癌细胞对新辅助放化疗敏感性的核心mirna之一[32].在这篇论文中,我们发现miR-520a降低了细胞周期蛋白D1和β-catenin在NSCLC细胞中的作用,表明Wnt缺陷在mir -520a介导的事件中的意义。此外,我们的研究发现SDC1、YWHAZ和RRM2在该信号通路上富集,而根据荧光素酶测定,只有RRM2被证实与miR-520a存在结合关系。RRM2是一种细胞周期依赖因子,被认为在许多癌症如肾上腺皮质癌中起致癌作用[33]、神经胶质瘤[34]及成神经细胞瘤[35].有趣的是,RRM2也参与了多个ceRNA网络,在NSCLC中,RRM2的上调被发现可引发细胞增殖、耐药和肿瘤生长[3637].重要的是,人工上调细胞中RRM2促进了细胞活力、迁移、侵袭和抗凋亡。因此,进一步的实验发现,过表达miR-520a阻断了上述事件,说明RRM2是miR-520a调控NSCLC进展过程中的下游靶点。有趣的是,RRM2沉默被认为可以使Wnt/失活β-catenin信号通路通过增强葡萄糖合酶激酶磷酸化3β38].总的来说,miR-520a可能抑制RRM2/Wnt/β-catenin轴阻断NSCLC进展。

5.结论

综上所述,本研究证明miR-520a在NSCLC中可以通过直接结合RRM2及随后的Wnt信号缺陷抑制细胞恶性行为和肿瘤生长。这些发现可以为NSCLC的基因治疗提供新的见解,miR-520a可能是一种潜在的工具,而RRM2可能是临床实践中的潜在治疗靶点。然而,本研究的样本量并不大,因为正在分析的样本量更大,但这些患者的三年随访研究尚未完成。我们利用Minitab软件进一步分析了本研究威力的评价。根据TCGA数据库的数据,我们可以得到 癌组织与正常组织之间miR-520表达的差值为0.18,标准差为0.25,我们定义的幂值为0.8(较大的效应量)。在这种情况下,样本量为18可以表明统计结果的显著性。我们希望在未来的研究中纳入更大样本量的数据。我们也希望在这一领域进行更多的研究,以提高NSCLC治疗的疗效。

数据可用性

用于支持这项研究结果的数据包含在文章中。

利益冲突

作者宣称他们没有利益冲突。

作者的贡献

谢毅和薛从宇对这项工作同样做出了贡献。

致谢

感谢山东省卫生科技发展规划(2018WS239)。

参考文献

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