丹参酮IIA联合阿霉素对BALB/C裸鼠人肝癌移植瘤的协同抗肿瘤作用及其对细胞色素P450 CYP3A4的影响在活的有机体内

摘要

客观的．肝细胞癌是严重威胁人类生命健康的常见疾病之一。在本研究中，我们评价了丹参酮IIA (Tan IIA)联合阿霉素(ADM)对人肝细胞癌的抑制作用，并建立了一个评估中草药成分联合化疗药物是否具有协同抗肿瘤作用的平台在活的有机体内．方法．建立裸鼠人肝癌HepG2细胞动物模型。将小鼠分为模型对照组、Tan IIA组、ADM组和Tan IIA + ADM组。观察其一般情况、重量、肿瘤体积和抑制率的变化。数据来源于血清AST水平和组织病理改变。用分光光度法测定细胞色素P450的含量和活性。western blotting分析CYP3A4蛋白表达。利用Discovery Studio 2.1评估Tan IIA和ADM与孕烷X受体(PXR)结合的模型晶体结构。结果．Tan IIA联合ADM可通过减轻ADM毒性、减小肿瘤体积、降低血清AST水平、改善荷瘤小鼠腹腔病理切片来改善小鼠生活质量。Tan IIA、ADM和联合处理的抑制率分别为32.77%、60.96%和73.18%。Tan IIA组细胞色素b5、P450、红霉素-含量明显升高N-demethylase活动。Tan IIA + ADM组CYP3A4蛋白表达明显增强。虚拟分子对接结果表明，Tan IIA和ADM均能稳定对接，PXR的结合位点相同，但相互作用不同。结论．Tan IIA联合ADM可改善荷瘤小鼠的生活质量，增强抗肿瘤作用。Tan IIA组可提高细胞色素P450酶的浓度和活性。Tan IIA联合ADM可上调CYP3A4蛋白表达，并通过虚拟对接与蛋白PXR相互作用。

1.简介

肝细胞癌(HCC)是人类最恶性的肿瘤类型之一，具有高死亡率和侵袭性转移潜力[1，2］．手术切除是HCC的一线治疗方法;然而，对于手术不可行的晚期HCC患者，全身化疗起着不可或缺的作用[3.］．然而，化疗药物有许多副作用，如骨髓抑制、胃肠道毒性和免疫系统紊乱。所以预防HCC治疗是一个重要的问题。此外，耐药性也在很大程度上限制了HCC化疗的进展[4］．许多草药已被证明含有大量的抗癌成分，但当草药单独使用时，它们的抗癌活性不如抗肿瘤药物[5- - - - - -7］．

目前，在许多治疗领域，越来越多的中草药被视为与抗肿瘤药物联合使用的辅助药物[8，9］．我们的初步工作[10，11]的研究结果显示，在化疗过程中，中草药可能具有增强疗效和降低毒性的优势。阿霉素(ADM)是一种治疗多种癌症的知名化疗药物。然而，ADM有许多副作用，包括骨髓抑制、心脏毒性、血液系统损害等不良反应。此外，耐药性的出现和这些潜在的副作用突出了目前临床应用中单独使用ADM的主要局限性[12，13］．

丹参酮IIA (Tan IIA: 1,6,6-三甲基-6,7,8,9-四氢phenanthro[1,2-b] furan-10,11-dione)是从中国最常用的中草药“丹参”中分离出来的菲醌的主要抗肿瘤生物活性成分。近年研究表明，Tan IIA可抑制肿瘤细胞增殖，诱导凋亡和细胞周期阻滞，扰乱肿瘤细胞周期，抑制肿瘤细胞侵袭或转移[10，14- - - - - -17］．有研究报道Tan IIA还能保护阿霉素诱导的细胞凋亡[18，19］．不幸的是，与草药中的其他抗肿瘤活性成分一样，Tan IIA被证实与目前使用的化疗药物相比具有较弱的抗肿瘤活性。在前期工作中，谢等。[10]发现Tan IIA和ADM对A549细胞均有抗增殖作用，但ADM的抗肿瘤作用强于Tan IIA。在接下来的研究中，Xie等[13]也发现Tan IIA和ADM对NSCLC A549、PC9和HLF细胞的增殖具有时间和剂量依赖性，而Tan IIA对细胞的增殖抑制作用远弱于ADM。

为了研究中药抗肿瘤活性成分与化疗药物之间的相互作用，我们的研究已经建立了一个结合的平台在体外以往研究中虚拟实验室工作的实验室实验[10，11，13，20.］．在本研究中，我们进一步开发了基于在活的有机体内Tan IIA的研究和虚拟计算，之前已被证明具有明显的抗肿瘤作用。同时选择经典抗肿瘤药物ADM作为本次研究的主要对象。为探讨中草药抗肿瘤机制及与化疗药物的相互作用，本实验检测了Tan IIA联合ADM对荷瘤动物、药物代谢酶、蛋白表达及药物虚拟筛选的影响。

2.材料与方法

2.1.细胞系，细胞培养和试剂

人肝肝细胞癌HepG2细胞购自中国科学院细胞库(CAS，中国上海)，保存于DMEM (Gibco，纽约，美国)，添加10%胎牛血清(Utah, Hyclone，美国)，在37°C, 5% CO的湿化培养箱中₂的气氛。Tan IIA(磺丹参酮钠注射液，5 mg/mL)由中国上海生化制药有限公司市售。盐酸阿霉素注射液由中国深圳美乐药业提供。冻干粉纯度99.99%，如Na₂年代₂O₄(Thermo, Waltham, USA)、红霉素和NADPH (Solarbio, Beijing, China)和Ba(OH)₂(Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)用于研究。99.99%一氧化碳气体来自中国广州岳都。所有化学品均为分析级，纯度均为最高。

2.2.动物模型和实验方案

从中国广州市广东省实验动物中心(动物证号:44007200004290)购买4-6周龄BALB/c雄性裸鼠20只，在标准饲养条件下(温度25-27℃，相对湿度45-50%)，在特定病原(SPF)室中饲养。的在活的有机体内研究方案经中国广州中山大学附属第一医院动物伦理委员会批准，所有实验均符合相关法规和伦理规范。实验进行时非常小心，避免给老鼠带来压力。

HepG2细胞在指数期收集，消化成单细胞悬液。饲养1周后，裸鼠皮下接种1 × 10⁷将细胞置于0.2 mL磷酸盐缓冲盐水中，置于右背近端上肢。对小鼠进行消毒，并将其放置在层流空气架上，同时监测它们的身体体征。当肿瘤大小达到100毫米时^3.在体积上，将荷瘤小鼠随机分为4组:模型对照组(0.2 mL生理盐水，第1 ~ 7天，第17 ~ 23天)、Tan IIA组(15 mg/kg体重，第1 ~ 7天，第17 ~ 23天)、ADM组(4 mg/kg体重，第1 ~ 3天，第17 ~ 19天)和联合治疗组(Tan IIA 15 mg/kg + ADM 4 mg/kg)。各制剂均采用尾部静脉注射。实验设计示意图如图所示1．

在整个过程中，每5天测量一次小鼠体重和肿瘤大小(长度和宽度)。第23天处死小鼠，完全剥去肿瘤，解剖小鼠肝脏作进一步检查。实验结束时计算肿瘤大小(肿瘤重量和肿瘤体积)，计算公式如下[21]:肿瘤体积(V,毫米^3.= 0.5 ×长×宽[2］．我们计算肿瘤生长抑制率为:抑制率(IR， %) =(模型组肿瘤平均重量-治疗组肿瘤平均重量)/模型组肿瘤平均重量× 100%。

2.3.小鼠肝脏微粒体的制备

第23天，在手术切除后立即处死小鼠，收集肝脏并转移到冰中。在4°C下将肝脏切成块，并在- 80°C保存，直到制备微粒体。如前所述，通过差速离心制备肝微粒体[22］．将肝脏样品解冻并称重，然后加入3体积的冰冷均质培养基(50 mM Tris-HCl缓冲液，pH 7.4, 4℃，含0.25 M蔗糖)。用剪刀将组织剪碎，用玻璃杵将组织充分均质30分钟。将得到的匀浆转移到清洁的离心管中，使用Beckman离心机(Beckman Coulter, Inc.， Fullerton, CA, USA)在4°C下以15000 g离心20分钟。收集上清液，使用Optimal L-100 XP Beckman超离心机在4°C下，100,000 g离心60分钟。微粒体颗粒用均质介质重悬。将肝微粒体悬液液化(1 mL)到1.5 mL试管中，在80°C保存，直到使用。采用Lowry法测定微粒体的蛋白质浓度[23］．

2.4.光谱分析

在日立(Danbury, CT) U3300双束分光光度计上记录还原一氧化碳(CO)差谱，并使用UV Solutions 1.2软件(日立)分析数据。简而言之，在5.7 mL 0.1 M磷酸钾缓冲液(pH 7.4)中制备0.3 mL孵育(含1 g/mL肝微粒体)，在37°C孵育2 min后，通过添加40来减少等分μ然后将L 10%的二亚硫酸钠均匀地分成两个1毫升，径长1厘米的比色皿。记录基线值，然后将一氧化碳轻轻吹入样品试管(大约每秒1个气泡，持续1分钟)。然后在400 ~ 500 nm范围内扫描吸光度，确定450 nm和490 nm处的峰值吸光度。

2.5.肝微粒体中酶活性的测定

测定小鼠肝微粒体中CYP3A酶的活性，测定CYP3A相关红霉素的活性N-去甲基酶(ERND)在37℃下用分光光度法测定。通过测定甲醛的生成来测定ERND酶活性。为分析ERND活性，将0.1 mL的1 g/mL肝微粒体、1.7 mL的0.1 mol/L磷酸盐缓冲盐水(PBS)和0.1 mL的4 mmol/L红霉素混合在0.1 mL的10 mmol/L NADPH中，使其总量为2 mL。37℃30 min后，加入1ml甲醇停止反应。在5000 g离心10分钟后，用荧光法测定上盐中的反应产物间苯二酚。ERND活性的测定是基于先前的研究，在420 nm处检测甲醛的形成[24，25］．

2.6.Western Blotting分析

western blotting法测定小鼠肝微粒体中CYP3A4活性水平。将蛋白质样品与等体积的5 × SDS-PAGE加载缓冲液混合，在95°C加热4分钟后使用SDS-PAGE凝胶分离，然后转移到PVDF膜上(Millipore, Bedford, MA, USA)。用5%脱脂牛奶在Tween 20 (0.05%)-PBS (pH 7.4)中在室温下阻断膜2小时，并在4℃下与兔CYP3A4多克隆抗体(1:800,ab克隆，美国波士顿)孵育过夜。接下来，用TBST缓冲液冲洗膜三次，并用辣根过氧化物酶(HRP-)偶联二抗(1:10 0;Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)在室温下放置2小时，并在检测前大量清洗。膜采用增强化学发光技术(Millipore, Bedford, MA, USA)制备，膜暴露于柯达XAR-5薄膜(Sigma-Aldrich)。GAPDH (1: 1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA)作为内部参考。利用美国国立卫生研究院(National Institutes of Health, NIH)图像软件(image J1.36b)定量各印迹带的相对光密度(与GAPDH的比值)。

2.7.分子对接研究

为了预测被测药物(Tan IIA, ADM)与靶蛋白(pregnane X receptor, PXR)之间潜在的蛋白-配体相互作用，经过准确性测试，本研究将Discovery Studio (DS) 2.1 (Accelrys Software Inc.， San Diego, USA)中的两个模块(CDOCKER和LibDock)应用于分子对接算法。通过均方根偏差(RMSD)的计算，验证ds2.1中分子对接模块选择的准确性。PXR的三维晶体结构是从PDB (http://www.rcsb.org/pdb/)，编号为4NY9。Tan IIA和ADM的3D结构从PubChem Project下载(http://www.pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，其cid分别为164676及123097261。DS 2.1程序在本地主机9943服务器上运行。基本对接流程如下。

首先，去除蛋白质中的水分子，向蛋白质中加入氢原子。用CHARMM对小分子和选定的蛋白质进行精制。其次，我们通过两种方法定义PXR的活性位点，一种是根据内部配体的结合位点，另一种是通过ds2.1自动定义。第三，经CHARMM精制后，Tan IIA和ADM分别停靠在4NY9 (PXR蛋白的PDBID)的活性位点上，该活性位点考虑静电能和范德华力(vdW)。

CDOCKER的对接流程如下:网格原点位于PXR活性位点的中心，边长取21.0 Å中的最小值或配体尺寸最大的+5.0 Å。网格间距为0.5 Å。每个vdW或静电探头都放置在这些格点上。用三线性插值法计算配体原子在格点间的能量。在网格边界外施加力常数为300千卡/摩尔的谐波电位。利用新配体的Tan IIA和ADM构型，随机生成了一组十个不同取向的配体。这些方向与PXR蛋白(4NY9)对接，并通过执行一系列随机旋转移动到网格的中心。一旦随机配体在活性位点对接，MD模拟运行包括从300到700k的加热阶段2000步，然后冷却阶段回到300k(5000步)。vdW力的能量阈值设置为300 K。最后，当MD结束时，用于优化模拟对接结果的短期能量最小化包括50个陡坡下降步骤，然后使用之前描述的0.001 kcal/mol的能量公差进行高达200个共轭梯度[13，20.］．

2.8.统计分析

数据以均数±标准差(SD)表示，采用SPSS 13.0软件进行分析。采用方差分析评价连续变量组间的差异。对照组和实验动物组使用未配对的学生模型进行分析t以及。一个值小于等于0.05被认为是显著的。

3.结果

3.1.HepG2荷瘤小鼠一般情况和体重的变化

实验开始时，所有小鼠总体情况良好，无死亡和厌食现象，体重稳步增加，毛色保持光泽，食欲好转，活动正常，排泄正常。但在第15天，小鼠体重增长缓慢。四组比较有差异:模型对照组和Tan IIA组小鼠基本保持正常状态，行为活泼，饮食增加。ADM组和Tan IIA + ADM组精神状态较差，食欲较差，大便呈液体状，活动稍迟钝。其中，ADM组是最糟糕的状态之一，包括皮肤最暗沉，蜷缩和沮丧。Tan IIA加ADM组的正常状态较ADM组好，但重量较轻。第20天，ADM组和Tan IIA + ADM组出现恶病质状态，明显消瘦、嗜睡、畏光、怕光、胆怯，甚至出现肿瘤组织溃烂、破裂(图2)．

在前15天，小鼠生长迅速，为0.22 g - 0.36 g/天。有趣的是，在第15天之后，各组小鼠的体重开始减缓。第23天，实验动物体重增加10%以上。与模型对照组比较，ADM组和Tan IIA + ADM组的权重变化明显，差异有统计学意义( )，但是两者之间没有区别W₀而且W₂₃在其他组中( )．由相关公式可知，模型对照组的增重率最高，为27.24%，Tan IIA组和ADM组的增重率较低，分别为22.12%和21.78%。Tan IIA + ADM组的情况较好，最低水平为17.30%(图3(一个))．

3.2.肿瘤体积、肿瘤重量、抑制率的变化问在荷瘤小鼠中的价值

结果表明(图3 (b)- - - - - -3 (d))治疗组肿瘤起初生长较快，但比模型对照组慢。第15天后，Tan IIA + ADM组肿瘤生长较其他各组缓慢。第20和23天，小鼠自行抓挠部分肿瘤组织;在ADM组(1只小鼠样本)和Tan IIA + ADM组(2只小鼠样本)观察到肿瘤组织出现溃疡破裂的现象，尤其是Tan IIA + ADM组，可见图3 (b)在第20-23天急剧下降。因此，我们推测肿瘤体积变小可能与裸鼠肿瘤组织溃烂有关。分析统计学数据时，ADM组和联合组切除肿瘤溃烂小鼠样本(图3 (b)- - - - - -3 (d))．

结果显示，与模型对照组相比，各治疗组肿瘤体积大小明显减小，差异有统计学意义( )．Tan IIA + ADM组最小。同时，Tan IIA + ADM组肿瘤重量最轻。与模型对照组相比，Tan IIA组的抑制率为32.77%;其次为ADM组(60.96%)，最后为Tan IIA + ADM组(73.18%)，见表1．根据金氏修改后的Bürgi公式，我们计算了问值约为0.988，用于评价药物的必威2490联合疗效。

3.3.HepG2荷瘤裸鼠血清AST水平的测定

实验结束时取小鼠腹主动脉采血，检测血清AST水平。组织学异常与AST活性增加同时发生(图4各组AST水平均明显升高，并可诱发小鼠肝毒性。模型对照组小鼠血清AST水平较低，而ADM组血清AST水平明显升高，与模型对照组、Tan IIA组、Tan IIA + ADM组相比，可使AST值分别提高约1 / 3。给药后小鼠的AST有一定程度的降低;Tan IIA联合ADM治疗可使AST平均水平较Tan IIA组降低约6.75%，差异无统计学意义。必威2490

3.4.Tan IIA改善了adm诱导的HepG2荷瘤小鼠肝脏组织病理学改变

H&E染色观察肝组织病理变化(图5)．与模型对照组比较，Tan IIA组肝小叶充血，肝小叶中央静脉周围炎性细胞浸润，局部肝细胞坏死少。adm处理的小鼠肝脏显示出严重的组织损伤，包括一些坏死的肝细胞，正常隐窝结构的丧失和肝细胞肿胀。此外，ADM组的充血比Tan IIA组和联合组稍明显。Tan IIA组肝小叶不清、充血。然而，给药Tan IIA显著改善了adm诱导的荷瘤小鼠肝损伤。Tan IIA + ADM组肝小叶结构紊乱程度低于其他各组。

3.5.小鼠肝微粒体细胞色素P450含量及活性的影响

HepG2荷瘤小鼠肝脏中微粒体蛋白含量无统计学差异(图2)6(一))．然而，细胞色素b5 (Cyt b5)、细胞色素P450含量和红霉素-N-去甲基化酶(ERND)活性在四组间有差异。Tan IIA组中Cyt b5和P450含量均显著最高，ADM组含量最低。四组细胞色素P450/Cyt b5的比值分别为1.855:1、1.236:1、1.598:1、1.572:1。与对照组比较，Tan IIA组、ADM组、联合组均有统计学意义( ，数据6 (b)而且6 (c))．与Tan IIA组比较，ADM组和联合组均有统计学意义。其中ADM加Tan IIA组联合治疗与ADM组比较有统计学意义。

ERND结果显示，Tan IIA治疗组CYP3A活性高于其他各组，与ADM组比较有统计学意义，ADM组活性结果最低。与模型对照组比较，Tan IIA组、ADM组差异均有统计学意义。Tan IIA + ADM共治疗组与Tan IIA组比较有统计学差异，但Tan IIA组与Tan IIA + ADM在ERND结果上无统计学差异(图6 (d))．

3.6.Tan IIA和ADM对小鼠肝微粒体CYP450 3A4蛋白表达的影响

如图所示7(一)，联合组CYP3A4蛋白表达较其他组上调，提示Tan IIA联合ADM可促进CYP3A4通路的表达。通过Image Pro-Plus软件分析灰度值，联合组与对照组蛋白表达差异有统计学意义( )．ADM组、Tan IIA组、联合组与对照组比较，差异均有统计学意义( )．Tan IIA + ADM组与ADM组比较，差异有统计学意义(图7)．

3.7.试验药物与PXR蛋白的相互作用

CDOCKER和LibDock的RMSD分别为0.6 Å和6.7 Å。因此，选择CDOCKER模块作为对接方式(表2)．结果表明，PXR从PDB数据库中获得的晶体结构的分辨率为2.8 Å，其肽链由316个氨基酸残基组成，在PXR的活性位点内发现了内源配体(图8(一个))．

经过自动搜索，总共显示了11个合适的活性位点。其中site 1与内源性配体结合区有较大重叠。因此，我们选择site 1和内源性配体结合区域作为我们的靶结合位点(图8 (b))．其次，Tan IIA可以稳定停靠在两个相互作用相似的位点上，例如与相同残基Ser247形成氢键(图8 (c)而且8 (d))．第三，ADM也可以稳定对接到两个站点，但交互方式不同(图)8 (e)而且8 (f))．综上所述，我们可以推测Tan IIA和ADM都可以稳定地停靠在PXR分子的内部配体结合区域，但具有不同的分子相互作用。

4.讨论

多年来，我们课题组一直致力于研究中药复方有效成分与传统抗癌药物之间的相互作用。目前，我们正在开发一个有效的平台来评估中药与化疗药物可能的抗肿瘤作用，为寻找新的有效的增敏剂提供实验依据和理论参考。在我们之前的在体外在研究中，我们探索了Tan IIA联合ADM对多种癌细胞的作用机制，发现Tan IIA可抑制A549增殖，诱导凋亡和S期细胞周期阻滞[10］．我们还发现Tan IIA和ADM均能抑制A549、PC9和HLF细胞的生长，且均呈剂量依赖性和时间依赖性，其中ADM的增殖抑制作用强于Tan IIA [13］．

因此，要做出成绩在体外更有效的是，我们继续研究中药有效成分与化疗药物联合抗肿瘤治疗是否具有协同作用在体外而且在活的有机体内研究。我们建立裸鼠人肝癌HepG2异种移植瘤模型，观察Tan IIA联合ADM可能的抗癌机制，前期研究发现Tan IIA联合ADM可降低小鼠异种移植瘤体积(数据未显示)。本研究提示Tan IIA可缓解adm的毒副作用，同时联合组肿瘤体积和重量均低于其他各组。因此，我们认为Tan IIA联合ADM不仅改善了荷瘤小鼠的一般状况，而且减小了肿瘤体积，提高了抗肿瘤率。

在本研究中，我们还发现Tan IIA的抑制率(IR = 32.77%)低于ADM的抑制率(IR = 60.96%)，说明Tan IIA的抗肿瘤作用弱于ADM，这一发现与其他研究一致[26- - - - - -30.]包括我们以前的研究[11］．虽然其活性成分的抗癌活性不如中草药中的抗肿瘤药物，但临床上普遍认为中草药中起抗肿瘤作用的活性成分毒性较小[9］．考虑到这一点，我们假设Tan IIA联合ADM可能协同作用，提高抗癌效果，并减少必要的药物剂量，防止不良副作用，提高患者的生活质量。

在我们前期工作的基础上，我们的研究强调了Tan IIA和ADM的联合作用在活的有机体内．结果表明，该组合不仅能影响肿瘤体积和抑制率，还能改善荷瘤裸鼠的外观变化。这表明，由于这两种药物的抗肿瘤作用，低剂量的ADM联合中药可减少副作用的发生。因此，作为草药中的活性成分之一，Tan IIA作为联合治疗的一部分增强了肿瘤的治疗，并提高了我们使用草药活性化合物作为抗肿瘤成分的知识。但是，我们的研究还不够充分。由于药物干预的方法是基于我们之前的研究(数据未显示在这里)，谭IIA组和ADM组在治疗时间上的差异是没有说服力的。此外，如果有药物浓度实验，就会更合理，就像Tan IIA组有不同的剂量浓度:低、中、高浓度在活的有机体内尽管涉及到药物浓度实验在体外［13］．所以我们打算在下一阶段改进工作。

过去几十年的研究表明，中药联合化疗药物可以减少不良反应，克服肿瘤多药耐药，提高免疫功能，与大剂量化疗药物相比，对患者的疗效接近甚至更好[31］．Tai等。[32]的结果表明，具有顺铂抗增殖活性的迷迭香提取物对人卵巢癌A2780具有显著的抗增殖活性。冈本等人[33]表明在顺铂存在下培养人外周血单个核细胞(0-1.0μg/mL)或5-FU (0-5.0μg/mL)导致自然杀伤细胞和淋巴因子激活的杀伤细胞活性显著增加，以及干扰素γ、肿瘤坏死因子α、β白介素(IL)-1 β、IL-6和IL-12的产生在体外．我们的研究结果发现，Tan IIA不仅与ADM具有协同抗肿瘤作用，而且降低了ADM的毒性，提高了荷瘤小鼠的生活质量，这与我们之前的假设是一致的。

药物与临床实践结合使用是非常常见的，特别是在癌症管理中。在中国，中西医结合较为普遍，可能会增加药物代谢酶代谢药物相互作用的机会。因此，我们研究了Tan IIA和ADM联合药物代谢酶对BALB/c裸鼠人肝细胞癌移植瘤的影响。细胞色素P450酶是参与药物代谢的关键酶。P450酶是一个超家族，在肝微粒体中含有许多同工酶。据记载，P450酶中有57个功能基因和58个假基因，它们代谢许多内源性底物，如类固醇、类二十烷酸和异种生物[34- - - - - -36］．同时，CYP1、CYP2和CYP3是参与95%以上临床药物氧化代谢的主要亚家族酶，肝脏CYP浓度和活性存在较大差异，这有助于临床药物的氧化代谢在活的有机体内药物反应的差异[37- - - - - -40］．CYP3A亚家族是所有CYP亚型中最丰富的，并催化各种临床药物的氧化代谢。因此，评估肝脏CYP3A的代谢功能具有至关重要的意义[41］．近年来，人们发现P450酶参与了多种代谢激活，包括致癌前原和原毒素，并与肿瘤形成密切相关。许多在体外研究表明丹参酮IIA和丹参酮IIA磺酸钠可抑制细胞色素P450酶的活性[42- - - - - -47]，但更多的是诱导作用，而不是抑制作用在活的有机体内［48- - - - - -50］．

基于先前的P450酶研究[11，51- - - - - -54]，结果显示Tan IIA组细胞色素b5、P450酶含量降低，CYP3A活性降低。而ADM组有明显的抑制作用，Tan IIA加ADM组接近对照组水平。差异有统计学意义，提示Tan IIA可能是一种有前景的P450酶凋亡诱导因子。因此，我们推测Tan IIA联合ADM药物可能会增加hepg2小鼠P450酶的含量和活性。增加可能通过加快药物代谢速度和缩短药物在小鼠体内的作用时间来减轻弱反应。这可能部分解释了为什么单独使用Tan IIA时观察到较弱的抗肿瘤作用。另一方面，在本研究中，ADM对异种移植有抑制作用。研究人员发现ADM是P450酶的底物，并参与CYP3A代谢反应[41，55，56］．我们发现ADM对P450酶有一定程度的抑制作用，说明这种抑制作用可能通过增加ADM血药浓度来增强抗肿瘤活性，而血液中ADM浓度过高可能对小鼠健康有害。ADM组小鼠健康状态下降可能与ADM对P450酶的抑制作用有关。

此外，我们的结果表明，Tan IIA和ADM联合使用可诱导荷瘤小鼠P450酶活性。更有趣的是，我们发现细胞色素P450/b5的比例比其他组接近1:1(1.236:1)。细胞色素b5与细胞色素P450相互作用形成紧密的1:1配合物(Kd = 275 nM)，其中高自旋细胞色素P450的比例从7%增加到30%。提高P450酶浓度可以防止代谢引起的药物浓度快速下降，从而增强抗肿瘤活性，并降低化疗时间缩短引起的毒性。因此，Tan IIA可能作为化疗的辅助药物，以提高疗效，降低毒性。

CYP3A4是细胞色素P450酶最重要的亚群之一，是人类肝脏中表达的主要CYP，占肝脏CYP总蛋白的50% [57］．众所周知，PXR是与药物代谢的所有阶段相对应的大量且不断增长的药物靶向基因的关键调节因子。许多内源性和外源性物质都能激活参与CYP3A4活性的核受体，包括孕烷X受体(PXR)，它是CYP3A4基因表达的重要调节因子。PXR被许多配体激活，并引起药物相互作用的抑制或诱导[58，59］．许多药物通过调节PXR和影响CYP3A4底物的药物代谢来影响CYP3A4的表达。随后，PXR被认为是CYP3A4蛋白的关键调节因子[11，60- - - - - -62］．

此前，已有研究证实中药有效成分可以激活PXR/CYP3A4通路。例如，《武未子》、《干草》、紫锥菊紫竹，白杨当归素可激活PXR，诱导HepG2细胞CYP3A4转录表达[63- - - - - -65］．其他论文提供了令人信服的证据，证明Tan IIA是一种有效的PXR激动剂在体外．例如，Yu等人。60]的结果表明，丹参乙醇提取物可激活人PXR，诱导HepG2细胞CYP3A4报告基因构建，并鉴定Tan IIA为有效的PXR激动剂。张等。[66]表明，Tan IIA对lca诱导的肝毒性和胆汁淤积具有剂量依赖性在活的有机体内实验使用PXR siRNA。张等。[62]表明Tan IIA是一种有效的PXR激动剂，能够提高CYP3A4 mRNA水平，其蛋白表达通过炎症性肠病PXR的转激活介导。这些研究提示PXR可能在Tan IIA与CYP3A4的关系中起重要作用。

此前已有研究表明，物理作用、原茶水醛、丹酚酸B、丹参素钠等均可显著诱导LS174T细胞中PXR mRNA的表达，而Tan IIA可显著下调LS174T细胞中PXR mRNA的表达，提示中药可显著调节PXR和CYP3A4，这在中药与药物的相互作用中具有重要意义[11］．我们的结果显示，联合用药组CYP3A4蛋白表达明显上调。我们的成员还发现Tan IIA可以诱导HepG2荷瘤小鼠PXR重组蛋白的表达(数据未显示)。然后，我们假设Tan IIA作为有效的PXR激动剂之一，可能与PXR联合增强ADM底物，改善HepG2细胞异种移植瘤小鼠CYP3A4蛋白表达。

PXR是与CYP3A4肝酶相对应的大量且不断增长的药物靶向基因的关键调节因子。它具有大而灵活的配体结合域(LBD)，允许PXR被各种各样的化合物激活。我们之前的研究表明，Tan IIA和其他被测试的草本化合物主要通过与Ser247、Gln285、His407和Arg401的氢键和芳香相互作用，可以很容易地停靠到PXR的配体结合腔中[11］．但ADM与PXR蛋白虚拟对接的研究和应用尚未见报道。结合前面的研究，我们推测Tan IIA联合ADM可能作为PXR的激活剂，与PXR形成复合物，诱导下游蛋白CYP3A4的产生，进而抑制肿瘤的进展。

考虑到我们之前的研究[11，20.，51，52]，通过虚拟筛选研究了中药配方与人细胞色素P450的相互作用。我们还探讨了与Tan IIA的互动。谢等。[10]发现Tan IIA可以稳定地停靠在VEGFR2蛋白的激酶结构域，与Cys917和Cys917形成氢键π- - - - - -π与Val848的堆叠相互作用。Xie等推测Tan IIA可能作为VEGFR2的竞争性抑制剂，进而抑制肿瘤血管生成、细胞迁移和致瘤性。在进一步的研究中，Xie等。[13]发现与ADM相比，Tan IIA可以停靠在所有被测蛋白质的具有氢键和芳香族相互作用的活性位点上。

在研究的最后阶段，我们通过虚拟对接研究平台模拟了靶向药物与PXR蛋白的相互作用。利用分子生物学实验结果对方法进行优化后，我们重点分析了Tan IIA和adm可能的结合模型，在PDB数据库中，我们的分子对接分析结果通过ds2.1自动搜索，发现了PXR的三维结构(PDB- id: 4NY9)，包括PXR蛋白激酶结构域(分辨率为2.80 Å)。我们发现site 1可以覆盖内源性配体所包含的结构域。经过两种方式的分子对接，Tan IIA和ADM都可以靶向PXR的蛋白激酶结构域。在结构域上，Tan IIA是一种有效的PXR激动剂，因此我们认为Tan IIA与PXR的对接位点可以定义为内源性配体结合位点的结构域。在激酶结构域，ADM与PXR内源配体的对接高于Tan IIA，表明ADM与PXR可能有更稳定的对接。而且，在分子对接的相互作用/结合位点上存在互补性，最近的研究也证实了这一点[13］．我们的研究结果表明，这些对接位点的结构可能影响协同抗肿瘤作用，有待进一步研究。

我们的研究表明，Tan IIA联合ADM是一种有前景的有效的癌症治疗方法。这种新的潜在联合疗法需要进一步开发，因为它可以最大限度地减少不良副作用，显著提高癌症患者的生活质量。

5.结论

本研究发现Tan IIA联合ADM可改善荷瘤小鼠的生活质量，增强抗肿瘤作用。Tan IIA增加细胞色素P450酶的浓度和活性。Tan IIA联合ADM可上调CYP3A4蛋白表达。Tan IIA和ADM与PXR蛋白的结合位点相同，均有稳定的虚拟对接。本研究为评价中草药与化疗药物的联合抗肿瘤作用提供了一个可行的平台在活的有机体内研究。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据可根据要求从通讯作者(Xin-Lin Wu和Sui-Lin Mo)获得。

信息披露

资助机构在研究设计、数据收集、分析和解释以及撰写手稿方面没有发挥任何作用。研究的设计，数据的收集，分析，解释和报告，以及手稿的写作是作者的唯一责任。

利益冲突

作者宣称他们没有利益冲突。

作者的贡献

刘桃莉和张丽娜对这项工作做出了同样的贡献。

致谢

本研究由国家自然科学基金资助项目(no.;81274135)。

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