镁和精选多酚预防血管钙化

抽象的

动脉血管钙化(VC)代表在动脉内部形成的磷酸钙沉积，这可能会限制血液流动，导致心脏健康问题，包括发病率和死亡率。VC是一个复杂且严密调控的过程，涉及血管平滑肌细胞(vsmc)转化为骨样细胞和随后的羟基磷灰石钙沉积。据报道，槲皮素(Q)、姜黄素(C)、白藜芦醇(R)和镁(Mg)等天然生物活性物质可以抑制VC。因此，我们利用大鼠血管平滑肌细胞(rVSMCs)进行了体外研究，以评价OptiCel中发现的天然生物活性，即Mg与多酚(PPs)、Q、C和r结合的保护作用，在高磷(HP)培养基中培养rVSMCs诱导钙化。Mg和Q + C + R的加入分别降低了hp诱导的钙沉积37.55%和42.78%。Mg与Q、C、R联合使用时，对钙沉积的抑制作用降低了92.88%，大于其计算的添加剂抑制作用(80.33%)。这些结果表明，Mg与选定的PPs (Q、C和R)联合使用比单独使用更有效。研究结果还表明，该药对心血管疾病的危险因素VC具有协同抑制作用。因此，经常食用这些天然生物活性物质对减少心脏病的发生有好处。

1.介绍

尽管有许多药物和干预程序，心血管疾病(CVD)仍然是发病率和死亡率的主要原因。事实上，心血管疾病是世界上最常见的死亡原因，约占所有死亡的三分之一[1]．2017年，美国有近65万人死于心血管疾病，占死亡总人数的23% [2]．

心脏病的主要原因是动脉的硬化，称为动脉粥样硬化[3.，4]．在这种情况下，脂肪和钙会在动脉壁中堆积，形成一种叫做斑块的硬结构[3.]．得到的钙化斑块导致动脉变窄并静置并降低和/或阻断血流对各种器官，随后导致心脏病发作和中风。血管平滑肌细胞（VSMC）中的血管钙化（VC），其特征在于羟基磷灰石形式的磷酸钙，被认为是心脏病发展和进展的主要危险因素之一[3.- - - - - -6]．

VC的发展已被证明是一个严格调节的代谢过程[5，6]．它涉及到正常收缩表型vsmc向成骨/骨样细胞的分化和钙作为羟基磷灰石的沉积[5，6]．VC的开发涉及多个触发器。这包括氧化应激、炎症、高血压、糖尿病、高磷血症、肾脏疾病、血脂异常、高钙和高维生素D [5，6]．这些触发器通过上调各种转录因子、信号通路和生长因子的表达来诱导VC，从而促进vsmc向骨样细胞分化，并随后形成钙化羟基磷灰石[5- - - - - -9]．

目前，尽管VC是心脏病发展的主要危险因素之一，但还没有可用的治疗方法。水果、蔬菜、香料和草药中常见的天然化合物已被证明通过抑制vsmc向成骨/骨样细胞的分化和羟基磷灰石钙的形成来抑制VC的发展[10- - - - - -14]．镁(Mg)和槲皮素(Q)通常存在于水果和蔬菜中[15，16]，葡萄和浆果中含有白藜芦醇(R) [17]和从香料姜黄中提取的姜黄素(C) [18已被证明在许多研究中抑制VC [10- - - - - -14]．

到目前为止，还没有关于Mg联合所选的PPs (Q、C、R)对VC的影响的报道。因此，我们的研究目的是评价Mg和联合C、Q、R对rvsmc中VC的影响，即OptiCel心脏健康膳食补充剂中目前使用的生物活性。具体来说，本研究的目的是评估生物活性物质在预防血管钙化方面的添加剂和潜在的协同效益。

2.材料和方法

2．1．细胞培养

rVSMC原代细胞(龙沙R-ASM-580;3001900115)按照其他人所描述的程序进行培养，但稍加修改[12，14]．细胞在37℃的潮湿环境中培养^∘C和5% CO₂．标准培养基由DMEM (Gibco 1 1966- 500)、链霉素/青霉素(Gibco 1 5630-080)和0.3% DSMO (Sigma-Aldrich D2650)组成，添加20%胎牛血清(FBS, SERADIGM 1 500-500)。用0.05%胰蛋白酶/0.02% EDTA溶液(GIBCO 25200)分离细胞层。细胞按需通过，保持70-80%的合流。部分rvsmc使用90% FBS (Seradigm 1 500-500)和10% DMSO (Sigma D2650)储存在冷冻条件下供以后使用。

2.2。实验设计

对照组(CL)在标准培养基中培养rvsmc，标准培养基中含有生理镁浓度(0.8 mM)和磷酸盐浓度(0.9 mM)。rvsmc在高磷酸盐(HP)培养基(5.0 mM)中孵育诱导钙化。为了增加磷酸浓度，磷酸氢二钠(Na₂HPO₄EMD SX0720-1)和磷酸二氢钠(NaH₂阿宝₄EMD SX0710-1）在1：2的比率下加入。通过生物术，Q（Tocris 1125）评估VC的抑制 µM, R (Tocris 1418/100))在100µM和C (Sigma-Aldrich, C7727)在5µ将m添加到HP培养基中。将Mg加入氯化镁（Sigma R0971）中，以将最终镁浓度增加至1.4mm（mg）。研究中的治疗组包括以下：（a）cl，（b）Hp，（c）mg，（d）q + c + r，和（e）mg + q + c + r.溶解所有生物术在0.3％DMSO媒体中。选择每种生物活性活性的浓度，基于先前的体外研究，细微修饰[10- - - - - -13]．

2．3.rvsmc的钙化诱导及Mg、Q + C + R及Mg + Q + C + R联合治疗

细胞被解冻并在生长培养基中生长9天^°C, 5%股份有限公司₂孵化器。然后，将它们以每孔2万到6万个细胞的速度分配到96孔板中。细胞黏附过夜后，将培养液替换为CL组单独生长培养基或钙化培养基、添加或不添加生物活性物质的5 mM磷酸盐。不同处理的rvsmc用新鲜培养基培养9天，每3 ~ 4天交换一次。每个处理设4个重复。

2．4．血管平滑肌钙化分析

孵育9天后，移除培养基，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗单层细胞两次。然后，细胞在2-8浓度下用0.6 N HCl脱钙过夜^°使用QuantiChrom™钙分析试剂盒(BioAssay Systems, CA, USA)，按照制造商提供的说明分析上清液中的钙含量。

2．5．统计分析

数据用平均值±SD表示。的T-检验采用Microsoft Excel来确定处理方法之间的差异。一个P值<0.5认为有统计学意义。

3.结果

3．1．HP在rvsmc中诱导钙化

为了诱导钙化，HP组的磷酸盐浓度从0.9 mM增加到5 mM。孵育9 d后，HP组钙含量为8.49±2.57µg / 100µL和0.29±0.16µg / 100µl表示CL组(< 0.001)(表1）.

3．2．Mg和Q + C + R对rVSMC钙化的抑制作用

孵育9天后，将Mg的浓度从8.49±2.57增加到1.4 mm的钙化降低至1.4 mm µg / 100µl在HP组为5.30±0.78µg / 100µl（ < 0.05) (Table1）.类似地，添加多酚组合，Q + C + R，从8.49±2.57降低HP诱导的钙化 µg / 100µL至4.86±0.28µg / 100µl（< 0.01)(表1）.Mg和Q + C + R的加入使高磷酸盐诱导的钙沉积分别降低了37.55%和42.78%(图5)1）.

3．3.Mg和Q + C + R联合抑制rvsmc钙化的作用

添加Mg和选择的多酚(Q + C + R)组合降低钙化从8.49±2.57µg / 100µHP组的l值降至0.60 + 0.21µg / 100µl（< 0.001)(表1）.Mg和Q + C + R组合降低了92.88%的钙化(图1）.Mg + Q + C + R组合降低钙化的效果大于Mg单独和Q + C + R单独相加的效果(80.33%)。

4.讨论

饮食，特别是富含水果、蔬菜和香料的饮食，已被证明与VC的减少有很强的关联[18]．这些食物的健康益处归因于各种生物活性，包括矿物质、维生素和植物营养素[15- - - - - -17，19]．

在这项研究中，我们使用rVSMCs进行了一项体外研究，评估了含和不含多酚(Q + C + R)的Mg的影响，多酚(Q + C + R)自然存在于水果、蔬菜和香料中。Mg单独降低了磷酸盐引起的钙化37.55%。这个值与之前其他人报告的结果一致[12，20.，21]．添加Q、C、R与高磷培养基结合，VC降低42.78%。Mg、Q + C + R联合治疗可抑制rVSMCs的钙化92.88%。Mg和多酚的联合效应大于Mg和Q + C + R的相加效应(80.33%)。结果表明，Mg与多酚Q、C、R组合具有协同预防VC的作用。据我们所知，当Mg和多酚、Q、C和R联合使用时，这是第一个显示出几乎完全抑制VC的研究。

多项研究表明，当单独测试时，Mg、Q、C和R可以有效抑制vsmc的钙化[10- - - - - -13]．体外研究结果显示，槲皮素通过抑制vsmc向成骨样细胞的表达，抑制vsmc向成骨样细胞的分化，从而有效抑制华法林诱导的VCβ-连环蛋白信号通路[11，22]．使用类似的体外研究，Mg已被证明通过抑制vsmc向骨样细胞的分化和羟基磷灰石的形成来抑制磷酸盐诱导的VC [12，20.，21]．通过抑制生长因子，骨形态发生蛋白质，骨质发生转录因子（Runt相关转录因子-2和Osterix [）的表达，显示Mg抑制mg介导的介导。12，20.，21]．已显示白藜芦醇通过激活Sirtuin 1（SIRT1），runx2的抑制剂抑制VSMC的钙化β连环蛋白信号(13，22，23]．罗马加西亚等人。[10]也证明了添加姜黄素可以通过抑制Runx2的表达来抑制vsmc向骨样细胞的分化，从而减少钙+磷酸诱导的VC [10]．

VC的形成是一个复杂的代谢过程。VC发展的两个重要步骤包括正常vsmc向成骨样细胞的转化和羟基磷灰石晶体形式的钙沉积[2，3.]．这些代谢过程由多种诱导剂调节，其包括转录因子，生长因子和信号通路[5- - - - - -9]，以及骨桥蛋白、骨保护素、基质Gla蛋白等抑制蛋白[2，3.]．尽管需要进一步研究，但数据清楚地表明Mg + C + Q + R的组合至少提供了额外的益处。这些数据还表明，该组合可能通过调制相同的诱导剂和抑制剂或涉及VC发展的其他其他人来提供协同效益[10- - - - - -13，20.- - - - - -23]．

结论

我们的研究结果表明，镁和Q、R、C组合的加入几乎完全抑制了磷酸盐诱导的rvsmc血管钙化的发展。Mg与多酚联合使用可能通过下调VC发育的多个触发、途径和机制来协同抑制VC。尽管这项研究的发现需要用临床数据加以证实，但它确实表明，镁、槲皮素、姜黄素和白藜芦醇一起摄入可以通过抑制血管钙化的发展和进展，更有效地有助于预防和治疗心脏病。

数据可用性

关键数据包含在文章中。关于类似的研究和结果的数据可从Gabe Tzeghai博士获得。

的利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。Gabe Tzeghai、Satya Majeti和Haile Mehansho就职于Summit Innovation Labs, LLC。

致谢

作者感谢查尔斯河实验室（俄亥俄州克利夫兰，美国）独立进行实验。该研究得到了Optimel制造商的峰会创新实验室，LLC。

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