超嗜热nadh依赖过硫还原酶的结构和动力学表征archaeoglobus fulgidus.

摘要

依赖于nadh的过硫还原酶(Npsr)通过将过硫或含硫底物还原为H来促进异化硫呼吸₂S.硫酸盐中存在该基因和硫代硫酸盐还原archaeoglobus fulgidus.帝斯曼4304等嗜热型archaeoglobales.出现异常,答:fulgidus无法呼吸S^0.并在单质硫的存在下生长。评价Npsr在硫代谢中的作用答:fulgidusDSM 4304, Npsr来自答:fulgidus为特征。AfNpsr特异于作为氧化半反应底物的过硫和多硫，表现为 大约是10^4.m¹S.¹，这与观察到的嗜热辅酶a过硫还原酶的动力学参数相似。与细菌Npsr相比，AfNpsr对DTNB表现出较低的二硫键还原酶活性;然而，与细菌酶类似，它没有显示辅酶a -二硫醚、氧化谷胱甘肽或胱氨酸的可检测活性。AfNpsr的3.1 Å x射线结构揭示了紧密结合的催化辅酶a的通路，活性位点Cys 42被一个灵活的环(残基60-66)所限制，这在细菌同源物中是不可见的Shewanella loihica PV-4和炭疽杆菌。与细菌酶不同，AfNpsr表现出NADH氧化酶活性，同时对NADPH也没有明显的活性。模型表明NADPH 2的空间和静电排斥 -磷酸盐占NADH的强烈偏好。NPSR在非漏洞中存在答:fulgidus表明该酶可能对S^0.或者在另一种尚未确定的代谢作用中发挥作用。

1.介绍

吡啶核苷酸二硫基氧化还原酶(PNDORs)是一大类同二聚体NADH-和fad依赖的酶，一般作用是还原位于异氧嘧啶环si面催化半胱氨酸上的小分子底物。底物的选择性和反应活性很大程度上取决于周围的催化残基和附加的结构元素，但一般来说，每个亚基都对活性位点贡献催化残基。辅酶a -二硫还原酶(CoADR)和NAD(P) h依赖型过硫还原酶(Npsr)是两种密切相关的PNDORs^0.通过催化单质硫、过硫化物或多硫化物还原为硫化氢，促进原核生物和古细菌的异化硫呼吸。

通常情况下，这些蛋白质基因的存在与细菌和古细菌通过执行呼吸的能力之间有很强的相关性在活的有机体内S.^0.减少。含这些酶的硫还原原核生物经常参与在缺氧环境中硫和碳的循环。CoADR和Npsr之间的主要结构差异是在Npsr的c端添加了一个~100个氨基酸类罗丹斯结构域[1那2]。该结构域的表面可达半胱氨酸作为初始的硫接受位点，然后辅酶A分子结合到含FAD的结构域，伴随硫到FAD附近的活性位点半胱氨酸(方案1)。CoADR广泛分布于嗜热和嗜热古菌，已知减少和/或呼吸S^0.。相比之下，除了在archaeglobes基因组中发现的Npsr同源物之外，在古细菌中通常没有发现Npsr，这些archaeglobes是异化的硫酸盐还原(超)嗜热菌[3.]。最近，微生物群落分析和测序发现了一些携带Npsr同源基因的新古物种。这些成员包括Crenarchaeota, Bathyarchaeota, Heimdallarchaeota, Haloarculaceae, Lokiarchaeota, Thermoplasmata, Methanomicrobiales, Verstraetearchaeota和methanomassilicoccales。

与其他含CoADR和npsr的生物体不同，“考古球”不能呼吸S^0.实际上是被抑制的[4.]。向细菌NPSR序列同源性Shewanella oneidensisPv4和炭疽杆菌表明archaeglobales中的同源物可能是per/ poly硫化物还原酶;然而，不同物种间缺乏硫还原表型表明该酶可能具有新的功能、不同的底物偏好和/或催化特性的改变[1那5.]。

考虑到古全球虫不耐硫，基因组中Npsr的存在是一件怪事。了解这种特殊酶在硫代谢中的功能答:fulgidus采集了重组蛋白的DSM 4303和生物地球化学硫循环、动力学和结构数据。在这篇文章中，我们发现该酶更倾向于过硫和多硫底物，而不是二硫化物，并且具有不同寻常的NADH氧化酶活性和独特的结构特征，这表明该酶在硫酸盐还原的异源太古宙的代谢过程中发挥了尚未确认的新作用。

2.材料和方法

2.1。基因的表达与纯化答:fulgidusNpsr

密码子优化版本答:fulgidus用GenScript合成Npsr基因(WP_010877907.1)，并利用NdeI和XhoI酶切位点将其亚克隆到pET21b+载体上。最后一个结构引入了c端His_6.标签。优化后的基因序列可以在辅助信息中找到(图)S1)。

转化BL21 (DE3)的发酵剂大肠杆菌细胞在100 mL极好的肉汤(TB)培养基中培养过夜(12 g/L色氨酸，24 g/L酵母提取物，4 mL/L甘油，9.4 g/L KH₂阿宝_4.， 2.2 g/L K₂HPO._4.)和100μg/mL氨苄青霉素在37°C, 200 rpm振荡。第二天，1l TB培养基含100μg/mL氨苄青霉素接种孵育。在一个OD₆₀₀在0.6 ~ 0.8之间，添加200个即可诱导表达μM IPTG。在37°C下摇晃3-4小时后，离心使细胞成球 并在-80°C下保存，待进一步使用。

为了纯化蛋白，细胞在50 mM N的洗涤缓冲液中解冻并重悬₂HPO._4.， pH 7.4, 200mm NaCl和20mm咪唑)添加1mm氯化镁₂、DNase和PMSF。将细胞置于冰中，在400 W下用20 s脉冲超声裂解，然后休息10 s，时间超过8-10分钟。将裂解的细胞离心 然后将50 mg FAD加入上清中，在70°C水浴中加热10分钟以重组蛋白质。4万g再次离心45分钟。上清液被移除，通过0。22μm过滤器，并加载到一个Ni^{2 +}-亲和柱预处理在洗缓冲。用10柱体积的洗脱缓冲液和4柱体积的50 mM N洗脱缓冲液清洗色谱柱₂HPO._4.，pH 7.5,200mM NaCl和300mM咪唑，pH 7.4。使用旋转过滤器将蛋白质浓缩至〜2ml，用100kDa mw截止，并进一步用Superdex 200尺寸排除纯化，在25mM Tris中，pH 7.5,100mM NaCl，1mmβ- 巯基乙醇和5％甘油。SDS-PAGE用于评估纯度。使用Millipore旋转浓缩器浓缩至10-30mg / ml，闪蒸在液氮中闪蒸，并在-80℃下储存直至进一步使用。消光系数 用紫外-可见光谱法测定蛋白质浓度。

2.2。结晶，数据收集和结构确定

AF.使用离心浓缩器将NPSR解冻并交换成25mm Tris，pH 7.5,25mM NaCl。通过组合2，通过在室温下使用悬挂和坐落蒸汽扩散方法结晶蛋白质 μ7毫克/毫升含2μL由100-200 mM醋酸钙、15-20% PEG 3350 ( ),和1mm DTT。长方形的盘子在2-5天内出现。在收集数据之前，将晶体转移到含有200mm醋酸钙、20% PEG 3350 ( ),还有20%甘油和速冻在液氮里。数据收集于NE-CAT 24-ID-E波束上的高级光子源(APS)，时间为100 K。

这些晶体属于P12空间组₁1有单元尺寸 那 那 和 那 那 。数据通过使用XDS进行集成，然后使用来自CCP4程序套件的aims - less进行合并和缩放(表1)[6.那7.]。初始相位通过使用BALBES进行分子替代来确定[8.]。使用3NT6作为起始模型获得最佳解决方案。非对称单元（ASU）包含两个AFNPSR二聚体或四个总亚基。模型AF.NPSR采用傻瓜构建，使用NCS约束和TLS参数使用Phenix进行改进（表1)[9.那10]。Ramachandran小区计算表明，94.2%和5.5%的残留分别占据最有利和额外允许的区域。

2.3。过硫化物底物的合成

氧化谷胱甘肽、胱氨酸、coa -二硫醚和硫化钠购自Sigma-Aldrich公司(St. Louis, MO)，在100 mM磷酸钠缓冲液中溶化，pH值为8，并通过向灌装瓶中喷洒N使其厌氧₂在Schlenk线上。使用注射器，将2倍过量的硫化钠加入到每个氧化二硫化物中，产生5mM半胱氨酸过硫化钠，10mM谷胱甘肽过硫化物和2mM CoS-过硫化物的最终储备溶液。每天都会发出有过硫化物基材的股票。

2.4。聚硫化物的合成

等摩尔浓度的硫(56.4 g)和硫化钠(54.1 g)(西格玛)加入到100毫升沸腾的H₂然后搅拌反应~15分钟，形成2.25 M的聚硫溶液。当反应变为暗橙色时，冷却溶液并转移到顶部空间最小的无菌瓶中。

2.5。稳态动力学测定

实验在安捷伦紫外-可见分光光度计上有氧进行，该分光光度计配有Peltier温度控制，并在总容量为1ml的石英试管中进行。每次检测在70°C下进行，在50 mM磷酸钠缓冲液中加入100-200 nM的酶，pH 7.5, 100μM NAD(P)H除非另有说明。多硫化物测定在pH 8.7的1m Tris中进行，以稳定底物并防止碱性多硫化物溶液的加入导致pH的变化[1那11]。所有缓冲液均在室温下制备。通过观察NAD(P)H在340 nm处的氧化作用来监测DTNB以外底物的活性( )。DTNB (5 52-硝基苯甲酸二硫代铋)(Sigma)还原酶活性在412 nm (TNB(5-硫代-2-硝基苯甲酸) )。

每次实验开始前，硫醇底物和酶在比色皿中70°C预孵育。每次测定都以添加NAD(P)H开始。记录各条件下背景NAD(P)H氧化的速率，并在适当的时候减去。对于监测DTNB减少的反应，从观察的速率中减去缓冲液中TNB形成的背景速率。通过对Michaelis-Menten方程进行非线性拟合，确定了动力学常数。

2.6。厌氧比活性测定

比活性测定在Coy厌氧室中进行。所有的原液都通过喷淋氮使其厌氧₂在Schlenk线上。每1 mL反应组成0.1μ酶,160μM NADH和200μ在70℃的热嵌段中进行，在1M Tris中，在1M Tris中，在1M Tris中，pH8.7中的多硫化物衬底进行。通过加入NADH引发反应，并通过将反应放入冷却器块中的1分钟后停止。通过将340nm样品的吸光度与存在的酶进行比较来评估活性。每次反应一次进行。

3.结果

3.1。稳态动力学

在稳态条件下，AfNpsr表现出对过硫化物和多硫化物底物的偏好，表现出10到230秒之间¹特异性常数是 (表2)。在测试的硫底物中，半胱氨酸过硫和多硫比谷胱甘肽和辅酶a过硫更受青睐，其转化率更高，~3倍 。AfNpsr对DTNB的活性最低，与二硫基底物胱氨酸、氧化谷胱甘肽和辅酶a -二硫基均无明显反应。这些观察表明，二硫化物限制了AfNpsr活性位点的进入。CoADR从海床horikoshii与AfNpsr序列同源性为40%，相似度为56%，对per- and poly硫化物具有类似的底物偏好[12]。

对该酶NADH氧化酶化学性质的评估显示，AfNpsr对NADH具有特异性，对NADPH没有可检测到的活性，这表明AfNpsr通过选择2来限制NADPH的结合磷酸(见下页)。在好氧条件下，AfNpsr表现出合理的NADH氧化酶活性这是CoA Persulfide的一半以上，基板具有最低的营业额数（图1和表2)。通常，当在有氧条件下评估PNDOR酶的活性时，背景NADH氧化酶活性的速率从底物还原的速率中减去。然而，对于AfNpsr，在底物浓度较低时(通过监测NADH消耗测量)，di、per和多硫化物的还原速率低于没有底物时NADH氧化酶的反应速率(图)1)。例如，160μM NADH, NADH氧化酶反应的周转数为~6 s¹。在添加50 - 100μM谷胱甘肽过硫化物测定含160μM NADH，营业额下降到〜1秒¹。假设在70°C时100％空气饱和度，估计的溶解O浓度₂在每个测定中是120 μ米(13]。在测定条件下，O₂浓度高于每/多硫化物底物的浓度时，NADH消耗的速率低于没有底物时观察到的速率(即NADH氧化酶反应)。因为NADH的消耗速率减少在每个/多硫化物底物存在的情况下，我们推断这些底物有效地竞争O₂用于访问活动站点。因此，对于这些测定，背景氧化酶率不被减去，因为产生的率将是负的。不能排除，然而，观察到的速率与底物包括一些NADH氧化酶活性。

3.2。厌氧比活性测定

作为对照，评估无氧条件下的底物周转₂为了确认在有氧条件下进行的实验是酶与底物反应的合理表征，在70°C厌氧条件下测量了酶与不同per和多硫化物底物的比活性(表3.)。在此条件下，没有观察到NADH氧化酶活性，所有4种过硫/多硫底物均表现出显著的活性。虽然我们已经报告了从这些分析中获得的值，由于分析的性质(特别是不是最优但技术上必要的方法，在冷水块上停止反应)，这些速率是非常不准确的，直接将它们与标准分析进行比较可能会导致结果的过度解释——它们更多的是作为定性分析来确认在厌氧条件下NADH氧化酶活性的缺乏和每/多硫化物还原酶活性的存在。

3.3。AfNpsr的全球结构

AFCoadr的最终模型被精制到3.1Å并拥有和分别为19.0%和25.8%(表1)。正如预期的那样，该酶是一种二聚体，其n端fad结合域(残基1-448)与相关Npsr和CoADR蛋白具有几乎相同的拓扑结构(图)2)。之间的r.m.s.d.答:fulgidus和Shewanella loihica35%相同，54%相似的NPSR是1.66 Ų。相比之下，AfNpsr和海床horikoshiiCoADR有40%相同，55%相似，为1.81 Ų。残基449到550组成c端罗丹斯结构域，通过一个氨基酸链连接到FAD结构域。在所有四个非对称单元中发现的AfNpsr亚基上，由于无序，包含465-472和483-488残基的两个罗丹斯结构域环缺失。

3.4。衬底对活性部位的访问

每个AfNpsr亚基和一部分罗丹斯结构域有助于CoA结合袋的形成(图2和3.)。在AfNpsr中，辅酶a被深埋，在这种蛋白质结构中，辅酶a除了泛酸臂上方有一个小开口外，几乎无法进入溶剂(图)3(一个)和3 (b))。位于此开口附近的是rhodanese结构域的Cys 519，它被认为有助于将硫化物底物穿梭到CoA。相比之下，辅酶a结合袋在Shewanella loihica和炭疽杆菌Npsr结构更开放，可能更容易使还原性辅酶a荡出并抓住与罗丹斯结构域半胱氨酸结合的潜在底物(图)3 (c)和方案1)[1那5.]。

在AFNPSR中，来自蛋白质表面的COA的看似低可达性来自较大的环路，由残留物60-66（TTYGAVR）组成，其粘合在COA结合口袋上（图3(一个))。在不对称单元中的一个二聚体上，这个环在两个亚基中有序(提供emental图3)。在第二个二聚体上，两个亚基中的62-65残基是无序的，不能建模(补充图)3 b)。需要注意的是，对于有序环的二聚体，环的平均b因子为67 Ų相比47 Ų对于fad结合域的其余部分，表明酶结合辅酶a的环的开启和关闭具有一定的灵活性。在CoADRs和其他PNDOR酶如NADH氧化酶(Nox)、过氧化物酶(Npx)和谷胱甘肽还原酶(GR)的结构中，这个回路不存在[14-17]。

3.5。NADH优先于NADPH的结构基础

稳态动力学表明，只有当NADH为共底物时，AfNpsr才具有活性。解释对NAD的强烈偏好⁺在辅酶ii⁺，这两个辅助因子在PNDOR蛋白现有晶体结构的帮助下手动连接到酶上，这些化合物在其中结合。绑定NAD的模型⁺显示辅助因子与nadh结合袋紧密契合，提示是核糖2和3 -部分羟基与E183形成氢键(图4.)。为辅酶ii⁺，磷酸化2核糖的羟基引入了与E183，M184和M185的空间冲突以及具有E183的强静电排斥。该模型建议静电和静电排斥可能不喜欢NADPH结合，并用AFNPSR用作辅因子。

3.6。FAD附近的金属结合位点

一个金属离子结合位点位于FAD的5.2 Å(图2,补充图2)。该位点从活性位点中移除，似乎是AfNpsr独有的，因为它从未在PNDOR家族成员中被观察到。目前，结合金属的身份还不清楚，但几行证据表明锌^{2 +}是一个适当的暂定任务。首先，紫外-可见光谱没有显示任何额外的吸收波段，除了属于FAD，排除顺磁性金属离子。其次，利用x射线衍射束线12-2在AfNpsr晶体上对Fe、Ni、Co、Cu和Zn的k边进行荧光扫描，发现Zn有一个小的荧光峰。尽管进行了多次尝试，但由于晶体质量较差，未能获得锌k边的异常衍射数据。建模锌^{2 +}与与更轻的原子如Ca相匹配相反，在金属部位的密度差异占了大部分^{2 +}和毫克^{2 +}。Zn的赋值^{2 +}也符合富氧配位球和伪八面体几何。虽然配位数看起来很低(4)，但可能会有额外的溶剂衍生配体与金属配合，由于结构的低分辨率不能观察到。为了找到这种金属结合位点，我们用不同浓度的金属离子(0.5-5 mM)进行了活性测定。在所有病例中，没有检测到活性的明显增加(数据未显示)。鉴于AfNpsr与其他Npsr和CoADR同源物具有相同的催化成分，而且这些成分都没有显示出任何金属依赖性，很可能AfNpsr中结合的金属离子起着结构作用。

4.讨论

archaeoglobus fulgidus.是一种从热液喷口和油田中分离出来的嗜热古菌，可以在接近95°C的厌氧环境中生存。尽管这个属与产甲烷菌关系最密切，并且携带大多数允许产甲烷的酶，但它缺乏甲烷生物合成的末端步骤和必要的辅助因子。相反，“考古球”使用硫酸盐和亚硫酸盐作为末端电子受体[4.]。虽然培养研究表明答:fulgidus对单质硫的不耐受，上述动力学数据表明答:fulgidus携带一个功能性Npsr基因，可以促进异化S^0.通过将每硫化物和聚硫化物还原为H₂此外，两个假定的coadr基因编码在答:fulgidus基因组，和初步工作在我们的实验室已经确认，至少其中一种具有二硫还原酶活性(未发表的结果)。因此，S^0.-还原蛋白在古全球提供了一个谜，关于他们的生物学功能在这些古细菌。

转录组分析答:fulgidus乳酸异养生长与岩石自养生长的比较₂/CO使用硫代硫酸盐和硫酸盐作为末端电子受体，揭示了Npsr的一般代谢作用[18]。在所有生长条件下，包括在增长的日志和晚记录阶段所采取的样品，AFNPSR的平均转录丰度比所有转录物的平均值大。均为2.2-至3.4倍。在岩性营养生长条件下，AFNPSR的转录物差异几乎高出2倍。这些发现表明蛋白质被翻译并定期为维持某种方式贡献答:fulgidus不论成长阶段。AfNpsr的一个可能作用可能是在S^0.可以在代谢过程中形成，如S^0.厌氧超热生物还原硫代硫酸盐过程中出现的球状物以前已被观察到[19那20.]。因为答:fulgidus不能在高浓度的S^0.，这种酶可能在预防细胞中或附近形成硫球的作用。

答:fulgidusNpsr表现出显著的谷胱甘肽过硫化物、半胱氨酸过硫化物、辅酶a过硫化物和多硫化物还原酶活性 价值约为10^4.米¹S.¹，这足以表明AfNpsr的生理底物可能是过硫化物或多硫化物化合物。虽然该酶能够降低DTNB，但它对辅酶a和谷胱甘肽二硫醚或胱氨酸没有催化活性，这表明这些底物太大，无法接近位于表面附近的罗丹斯半胱氨酸(C519)或酶结合的辅酶a。AfNpsr对过硫化物和多硫化物的底物偏好高于二硫化物，这与Npsr同源物的底物偏好一致S. Loihica[1]。与SlNpsr和BaNpsr相比，AfNpsr对活性位点结合CoA的获取受限，这可能表明AfNpsr对较小的代谢物更具选择性[1那5.]。虽然还不清楚AfNpsr的生理底物是什么，答:fulgidus不太可能包含谷胱甘肽，因为它的基因组不包含谷胱甘肽合成酶(谷氨酰胺-胱氨酸连接酶或谷胱甘肽合成酶)或谷胱甘肽还原酶(由BLAST确定)。此外，由于半胱氨酸的细胞毒性，预计其水平将保持在较低水平[21]。酶对它们的使用表明辅酶a过硫化物和多硫化物可能是一个更可行的底物候选者。

因为一个fulgidusNPSR存在于具有多种功能和基材的蛋白质家族内，因此其自身的作用可能因每种/多硫化物或二硫化物的简单减少而变化。AFNPSR的每/多硫化物还原酶活性可能表明酶具有保护作用，以抗氧化剂或排毒能力作用。在增长的日志和晚记录阶段的大多数其他成绩单中，AFNPSR成绩单在更高的程度上与成长的日志和后期日志阶段的同意是同意的管理功能[18]。同样，NADH氧化酶反应也表明Npsr可能有助于机体缓解O₂压力;然而，尚不清楚NADH氧化酶的活性是否是该酶真正的兼职功能。这样的功能不是没有先例的，如删除编码CoADR的基因Thermococcus kodakarensis证明了在有硫的情况下，它对氧的敏感性增强，而在没有硫的情况下，它对氧的敏感性保持不变[22]。虽然Afnpsr有在体外多硫化物还原酶活性差，在S^0.清楚地表明在活的有机体内活性不足以使archaeglobbales抵抗大量的S^0.或者呼吸它的能力。

5.结论

答:fulgidusNpsr与其他CoADR/ Npsr蛋白结构相似，具有保守的活性位点和辅助因子。它的罗丹斯尾巴类似于在S. LoihicaNpsr，但CoADRs中没有。这和在活性位点CoA上闭环的差异可能解释了底物特异性的差异。答:fulgidusNpsr对过硫和多硫底物的还原表现出亲和力，并且对NADH的选择性高于NADPH作为还原剂，这可能提供了它作为NAD的生物生产者的作用⁺维持代谢的电子受体池。进一步研究AfCoADR相关蛋白的功能和古全球对S的响应^0.需要阐明“考古球”是如何处理这种代谢压力的，或者是如何将这些酶重新利用以实现一种尚未被确认的功能。

缩写

AfNpsr:	archaeoglobus fulgidus.NAD (P) H-dependent过硫化物还原酶
科德尔：	辅酶a-二硫化物还原酶
phcoadr：	海床horikoshii辅酶A-disulfide还原酶
DTNB:	5,5. -Dithiobis-2-nitrobenzoic酸
PNDOR:	吡啶核苷酸二硫化物氧化还原酶
Npsr:	NAD (P) H-dependent过硫化物还原酶。

数据可用性

坐标和结构因子archaeoglobus fulgidus.NPSR已存放在蛋白质数据库中（http://www.rcsb.org)作为第6PFZ (https://www.rcsb.org/structure/6pfz.)。

的利益冲突

作者声明在本手稿中讨论的主题或材料中没有利益冲突。

致谢

美国国家科学基金会ID 1518306资助了E.J.C.和M.H.S.。这项工作是基于东北协同访问团队光束线进行的研究，该团队由国家卫生研究院的国家普通医学科学研究所资助(P41 GM103403)。该研究使用了先进光子源的资源，美国能源部科学办公室用户设施由阿贡国家实验室的能源部科学办公室根据合同编号。DE-AC02-06CH11357。

补充材料

图S1:优化密码子答:fulgidusWP_010877907.1 Npsr基因。图S2: FAD附近的金属结合位点。图S3:复合材料省略辅酶A上方有序和无序活性位点表面环的电子密度图。（补充材料）

参考文献

1. M. D. Warner, V. Lukose, K. H. Lee, K. Lopez, M. H. Sazinsky, E. J. Crane，“Shewanella loihica PV-4中nadh依赖过硫还原酶的表征:通过fad依赖的酶对硫呼吸机制的影响”，生物化学第50卷，没有。2，pp。194-206，2011年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. D. R. Harris, D. E. Ward, J. M. Feasel等人，“从热越焦球菌中发现一种辅酶a二硫基还原酶并进行表征”，FEBS Journal.第272卷，no。5, pp. 1189-1200, 2005。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. H. P. Klenk, R. A. Clayton, J. F. Tomb等人，“嗜热、硫酸盐还原古生菌的全基因组序列”，自然第390卷第3期。6658，页364-370,1997。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. K. O. Stetter、G. Lauerer、M. Thomm和a . Neuner，“极嗜热硫酸盐还原剂的分离:古细菌一个新分支的证据”，科学第236卷第2期4803，第822-824页，1987。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. J. R. Wallen, C. Paige, T. C. Mallett, P. a . Karplus，和a . Claiborne，“吡啶核苷酸复合物与炭疽芽孢杆菌辅酶a -二硫还原酶:双NAD(P)H特异性的结构分析”生物化学(第47卷第40期)18, pp. 582 - 5193, 2008。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. 协同计算项目，第4期，“CCP4套件:蛋白质晶体学程序”Acta crystallographica。生物晶体学第50卷，没有。5，第760-763页，1994。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. w·Kabsch“XDS”,晶体学报D辑，生物晶体学，第66卷，第2期。2，页125-132,2010。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. F. Long, a . a . Vagin, P. Young, G. N. Murshudov，《巴尔贝斯:分子替代管道》晶体学报D辑，生物晶体学(第64卷)1，页125-132,2008。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. P. Emsley和K. Cowtan，“Coot:分子图形的建模工具”晶体学报D辑，生物晶体学，第60卷，不。12，页2126-2132,2004。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. P. D. Adams, R. W. gross - kunstleve, L. W. Hung等人，“PHENIX:构建自动晶体结构测定的新软件，”晶体学报D辑，生物晶体学，第58卷，第2期。第11页，1948-1954年，2002年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. A. Toth, M. Takacs, G. Groma, G. Rakhely, K. L. Kovacs，“在嗜热古菌中具有独特结构域的新型nadph依赖氧化还原酶，”《微生物学字母第282卷，不。1, pp. 8-14, 2008。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. K. Sea, J. Lee, D To, B. Chen, M. H. Sazinsky, E. J. Crane第三篇，“在火球菌horikoshii CoA二硫还原酶中，一个更广泛的活性位点可以容纳更大的底物，并揭示了亚基不对称的证据，”2月开放的生物第8卷第2期。7, pp. 1083-1092, 2018。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. S. D. Cramer，“从0到300°C的盐水中氧的溶解度，”工业与工程化学工艺设计与开发第19卷，没有。2, pp. 300-305, 1980。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. S. Herwald, a . Y. Liu, B. E. Zhu等，“焦球菌辅酶a二硫还原酶/多硫还原酶(CoADR/Psr)的结构和底物特异性:对焦球菌基于S(0)的呼吸和硫依赖的抗氧化系统的影响，”生物化学，卷。52，不。16，pp。2764-2773,2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. T. C. Mallett, J. R. Wallen, P. A. Karplus, H. Sakai, T. Tsukihara，和A. Claiborne，“1.54 A分辨率下辅酶A-二硫还原酶的结构”，生物化学，第45卷，第4期。38，页11278-11289,2006。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. P. A. Karplus和G. E. Schulz，“谷胱甘肽还原酶1.54的精细结构Å分辨率，”分子生物学杂志，第195卷，no。3, 701-729页，1987。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. H. J. Hecht, H. Erdmann, H. J. Park, M. Sprinzl, R. D. Schmid，“Thermus thermophilus NADH氧化酶的晶体结构”自然结构生物学，第2卷，第2卷。12，第1109-1114页，1995。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. W. P. Hocking, R. Stokke, I. Roalkvam, I. H. Steen，“通过转录组分析鉴定嗜热硫酸盐还原古生菌硫黄古生菌能量代谢的关键成分”，微生物学前沿，第5卷，第4卷。95年,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. Y. J. Lee, M. Dashti, A. Prange et al.，“thermoanaerobactersuligignens sp. nov.，一种厌氧嗜热细菌，能将1 M硫代硫酸盐还原为单质硫，并耐受90 mM的亚硫酸盐，”国际系统与进化微生物学杂志(第57卷)7，页1429-1434,2007。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. Y. J. Lee, A. Prange, H. Lichtenberg, M. Rohde, M. Dashti, J. Wiegel，“由硫代硫酸盐产生的硫球中硫物种的原位分析”，细菌学期刊第189卷第2期20，页7525-7529,2007。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. K. Takumi和G. Nonaka，“细菌半胱氨酸诱导的半胱氨酸抗性系统”，细菌学期刊，卷。198，否。9，pp。1384-1392,2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. H. Kobori, M. Ogino, I. Orita, S. Nakamura, T. Imanaka, T. Fukui，“NADH氧化酶/NADPH多硫化物氧化还原酶的特性及其在厌氧嗜热古菌中对氧敏感性的意外参与，”细菌学期刊，卷。192年，没有。19，PP。5192-5202，2010。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

betway赞助

betway赞助Sherwin Shabdar等人这是一篇开放获取的文章创意公共归因许可证，允许在任何媒介上不受限制地使用、分发和复制，只要原稿被适当引用。