产甲烷电生物阴极嗜热微生物群落中甲烷菌和放线菌的分析

摘要

电甲烷发生是指CO生物电化学合成甲烷₂biocathodes。在使用嗜热微生物的产甲烷电系统中，宏基因组分析以及定量实时聚合酶链反应和荧光原位杂交结果表明，生物阴极菌群以产甲烷菌为主Methanothermobactersp.菌株EMTCatA1和放线菌Coriobacteriaceaesp.菌株EMTCatB1。RNA测序用于比较每个菌株在产甲烷生物阴极、开路生物阴极和产甲烷抑制剂2-溴乙烷磺酸(BrES)下的转录组谱。对于产甲烷菌，与氢化产甲烷相关的基因高度表达，其表达方式与H₂召集条件。对于放线菌，编码多血红素c型细胞色素和膜结合氧化还原酶的基因表达谱表明，放线菌直接从电极上获取电子。在两株菌株中，在开路生物阴极和带有BrES的生物阴极中普遍诱导了各种胁迫相关基因。这项研究提供了产甲烷电生物阴极的优势物种的分子清单，具有功能见解，因此代表了产甲烷电生物阴极的第一个多组学特征。

1.简介

电甲烷发生是指甲烷(CH₄)从二氧化碳(CO₂)在生物电化学系统的生物阴极上[1］．在这种系统中，存在于阴极表面的催化微生物通常利用电极上的电子并减少CO₂．由于这些生物阴极能够高效地将电能转换为甲烷，因此在可再生电力转换(电力转换为气体)和CO方面具有广阔的应用前景₂已提出利用[2，3.］．

产氢产甲烷菌，特别是那些属于甲烷杆菌科的产氢产甲烷菌，似乎在电产甲烷中起主要作用，通常在生物阴极中被检测到是主要的产甲烷菌[1，4，5］．最近对纯培养和共培养的生物阴极的研究揭示了从电极到产甲烷菌的电子转移途径。例如，在甲烷杆菌科的甲烷菌中，即铁腐蚀菌中，从负极化电极直接摄取电子甲烷细菌属类太古菌菌株IM1 [6］．而一些产甲烷菌，包括产甲烷球菌属maripaludis，缺乏这种能力[7]，酶，如氢化酶和异二硫还原酶复合物m . maripaludis［7- - - - - -9]吸附在阴极表面已被证明催化产生可溶性电子介质，如H₂并利用电极上的电子来形成甲酸，这反过来又可以被产甲烷菌利用。这种介质也可以由其他能够直接吸收电子的微生物产生，如腐蚀铁的硫酸盐还原剂Desulfopila corrodens菌株IS4 [10，11］．

尽管从确定的培养体系中获得了基本知识，但对于实际应用来说，了解在生物阴极上富集的多物种微生物群中的甲烷电生成机制是重要的。描述这些组成物种的功能有望导致识别新的催化剂，包括产甲烷菌和其他能够吸收电子的物种，以及具有辅助功能的微生物(例如，氧气清除剂)和有害物种(例如，不良产物的生产者)。这些微生物可能是生物阴极功能工程的潜在目标，以获得更好的性能和鲁棒性。在两种类型的生物阴极，即CO₂-固定好氧生物阴极和一个主要生产醋酸盐的生物阴极，宏基因组分析揭示了表面微生物群的组成和代谢能力[12- - - - - -15］．此外，活跃的代谢途径，包括参与CO₂固定和电子转移，以及可能的种间相互作用已通过元转录组学和元蛋白质组学分析推断[12，15]，提供了重要的见解原位各种社区成员在这些生物阴极的功能。

我们之前报道了一种嗜热微生物群落，与标准氢电极(SHE)相比，它能够在- 0.35 V的阴极下催化55°C的电甲烷生成[16］．结果表明，生物阴极的产甲烷和电子消耗都依赖于CO的存在₂并被产甲烷抑制剂2-溴乙烷磺酸(BrES)强烈抑制。这些结果表明，阴极的电子主要被甲烷生成所消耗。初步评价相关16S rRNA克隆文库提示与甲烷菌有关Methanothermobacter与其他几种细菌一起，在生物阴极表面富集。因此，在本研究中，我们的目标是描述这个联盟的主要成分，并打算深入了解它们在电甲烷生成过程中的各自作用。

2.材料与方法

2.1.反应堆设计及运作

本研究中使用的反应堆的具体特性和操作条件与我们先前研究中描述的基本相同[16］．单室反应器是用250毫升玻璃瓶建造的。两室反应器包括两个相同的300毫升玻璃瓶，由预处理的质子交换膜(12.5厘米)隔开²， Nafion 117，杜邦公司，威尔明顿，DE，美国)也被建造。阳极和阴极由普通碳布( ，tmill有限公司，茨城，日本)。每个电极通过一根钛丝(直径0.5毫米，Alfa Aesar, Ward Hill, MA, USA)连接到电路上，直接固定在电极的末端，不使用胶水。电极与钛丝之间的内阻小于3.0Ω．所有反应器均采用丁基橡胶塞和铝密封，顶部充氮₂/公司₂(80: 20)。接种反应器在55°C的进料批式模式下运行，在这种模式下，当电流产量衰减到背景水平时，介质与新鲜介质交换。在每个室中连续使用一个磁力搅拌器，以在孵育期间提供足够的混合。

2.1.1.单室反应堆的运行

活性生物阴极的构造最初是在单室反应器中开始的。微生物的最初来源是预先存在的生物电化学反应器的流出物，该反应器最初与来自石油油藏的地层水接种[16］．然后，接种物25 mL，含0.136 g/L KH的无菌厌氧培养基125 mL₂阿宝₄， NH 0.54 g/L₄Cl, 0.2 g/L MgCl₂h·6₂O, 0.147 g/L氯化钙₂h·2₂O, 2.5 g/L NaHCO_3.，向反应器中加入添加了0.8 g/L乙酸钠的沃尔夫矿液10 mL/L。使用数字电源施加0.7 V恒定电压(Array 3645A, Array Electronics，南京，中国)。固定外阻1.0Ω连接到电路上。使用万用表每5分钟记录电阻上的电压(34970A，安捷伦科技，圣克拉拉，加州，美国)。

2.1.2.双室反应堆的运行

生物阴极在单室反应器中经过三次补批循环后，用无菌厌氧介质轻轻漂洗，然后转移到双室反应器的阴极室进行进一步分析。在这个设置中，每个阳极和阴极室都充满了200毫升的厌氧介质(不含乙酸钠)。阳极采用了一种新的非生物电极。一个银/AgCl参比电极(1 M KCl)在55°C下与SHE电位为+0.20 V插入阴极室。生物阴极、阳极和Ag/AgCl电极分别连接到恒电位器(HSV-110, Hokuto Denko, Japan)作为工作电极、计数电极和参比电极。与SHE相比，生物阴极稳定在−0.5 V的恒定电位。反应器以加料批式方式运行。在研究中，生物阴极在两室反应器中经过三次进给间歇循环后被牺牲用于核酸提取和显微分析。

2.2.分析测量

使用气相色谱仪(配备ShinCarbon ST柱的GC-2014;Shimadzu，京都，日本)。用数字压力传感器(AP-C40;凯恩斯，大阪，日本)。在双室反应器中，循环伏安法(CV)使用标准的三电极系统进行。恒电位器(HSV-110)与以下参数结合使用:平衡时间为99 s，扫描速率为1 Mv/s，扫描范围为−0.7至−0.2 V。

2.3.Metagenome分析

生物阴极相关微生物群落的全基因组霰弹枪测序、宏基因组的组装和注释已在先前的报道中描述[17，18］．使用DNeasy PowerMax Soil Kit (Qiagen, Hilden, Germany)从两个独立的生物阴极中提取DNA，分别在−0.5 V和SHE条件下产生甲烷。提取的DNA在Illumina HiSeq 2000测序仪中测序(150 bp对端测序)。读取的适配器和质量微调使用Cutadapt(版本1.8.3)[19］．如前所述，以提取的dna为模板，对生物阴极相关群落的16S rRNA基因扩增子进行测序[20.］．

大约3.95亿个修剪过的reads(约60千兆酶对)被用于宏基因组的分类。MetaPhlAn2工具(版本2.2.0)[21]用于从未组装的宏基因组reads中揭示生物阴极相关联盟的组成。为了组装，reads首先被采样到400兆对(Mbp);结果，来自相对较小的物种的序列减少了。然后，使用Velvet包(版本1.2.10)组装读取文件[22]，然后使用Sealer工具填充缝隙(2.0.2节)[23]以及使用REAPR工具(1.0.18版本)进行质量检查[24］．使用Prokka(版本1.13)注释脚手架[25］．为了进行代谢途径分析，使用KEGG Mapper将基因组草案中编码的蛋白质映射到京都基因和基因组百科全书路径数据库[26］．淡紫色用于线性化基因组的比对[27］．

2.4.实时定量聚合酶链反应(qPCR)

在LightCycler 480系统中(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)， qPCR分析使用了猎枪测序DNA和从其他六个独立生物电极中提取的DNA样本作为模板。Yu等人设计的群体特异性引物和探针[28]被用于甲烷菌纲的甲烷菌(即，Methanothermobactersp. strain EMTCatA1)、总古菌和总细菌(列于表S1)．引物和探针特定于Coriobacteriaceae根据sp.菌株EMTCatB1 16S rRNA基因序列及其三个密切相关序列(FJ638596、KM819482和AY753404)，利用ARB程序[29］．DNA浓度使用Qubit 3.0荧光计(赛默飞世尔科学公司)和Qubit dsDNA HS测定试剂盒(赛默飞世尔科学公司)进行定量。每10μL反应混合物由1μL模板DNA, 300 nM特异性引物，200 nM TaqMan探针，5μL的Premix Ex Taq (TaKaRa，京都，日本)和pcr级消毒水。PCR扩增过程如下:95℃孵育30 s, 95℃变性40次，每次5 s, 60℃退火/延伸30 s。引物探针组扩增效率为1.80 ~ 1.86。每个样本分别进行了三次试验。每个实验的标准曲线是使用合成的928 bp DNA片段构建的，该DNA片段包含黄曲霉16S rRNA基因的靶区Methanothermobactersp.菌株EMTCatA1(古细菌和甲烷细菌测定)和Coriobacteriaceaesp.菌株EMTCatB1(用于细菌和Coriobacteriaceae物种化验)。

2.5.微观分析

荧光原位进行杂交(FISH)和扫描电镜(SEM)。采用FISH法进行鉴别Methanothermobacter使用特定于甲烷杆菌目16S rRNA的探针(MB311，表S1) [30.］．为了提高探针对具有假脲酶细胞壁的产甲烷菌的渗透力，FISH程序被修改为包括4%的酶预处理( ）重组假脲素内肽酶(rPeiW)固定多甲醛样品，如前所述[31］．特异性的16S rRNA探针Coriobacteriaceaesp. strain EMTCatB1 (B1_648, TableS1)采用ARB程序设计[28］．对探针的特异性和有效性进行了预评价在网上使用SILVA TestProbe(3.0版本)[32]和mathFISH工具[33］．为了使放线菌革兰氏阳性细胞壁渗透，样品在96%乙醇中固定(不含甲醛固定)，用10 mg/mL溶菌酶(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)预处理60分钟，然后用10 U/mL染色肽酶(Sigma-Aldrich)消化30分钟，然后进行杂交[34］．两种探针都标有Alexa Fluor 488(赛默飞世尔科学公司，Waltham, MA, USA)和5μ用M SYTO59(赛默飞世尔科学公司)进行反染色。显微图像分析使用Fiji [35]来估计阴极表面微生物细胞的大小分布。为了进行SEM分析，电极首先用2.5% ( ）戊二醛和2% ( ）多聚甲醛在0.1 M磷酸盐缓冲溶液(PBS, pH 7.4)中，并按上述方法处理[16］．

2.6.RNA提取及转录组分析

RNA样本从6个独立的生物阴极中提取，这些生物阴极在−0.5 V和SHE下活跃地产生甲烷。在本实验设置中，通过建立闭路(CC)、开路(OC)和BrES三种实验条件，将生物阴极聚为两个。为此，两个生物阴极直接进行RNA提取(CC条件)，而另外两个生物阴极在RNA提取(OC条件)前在开路中放置5小时。对于接下来的两个生物阴极，以12 mM的最终浓度将BrES缺氧注入阴极室，在RNA提取之前(BrES条件)，生物阴极在−0.5 V与SHE的平衡电位下孵育5小时。在无菌粉碎之前，将生物阴极浸泡在LifeGuard土壤保存溶液(Qiagen)中以稳定rna。然后使用RNeasy PowerSoil总RNA试剂盒(Qiagen)提取总RNA。使用TURBO DNA free Kit(赛默飞世尔科学公司)，通过DNase处理去除残留DNA。从提取的总RNA中，通过使用Ribo-Zero Kit (Illumina, San Diego, CA, USA)去除rRNA来富集mRNA。然后使用MessageAmp II-Bacteria RNA Amplification Kit(赛默飞世尔科学公司)扩增富集的mRNA，并使用SuperScript双链cDNA Synthesis Kit(赛默飞世尔科学公司)进一步转化为cDNA。然后使用TruSeq搁浅mRNA文库准备试剂盒(Illumina)制备cDNA测序文库。 Metatranscriptome sequencing was performed by using an Illumina HiSeq 2500 system (Illumina), which yielded 100 bp pair-end reads totaling 51.7–108.3 million reads (TableS2)．Eurofins Scientific Co.建立了相关的文库并进行了所有的测序反应。

RNA-seq读取使用Trimmomatic(0.36版本)进行质量过滤[36]，并与Methanothermobactersp. strain EMTCatA1和Coriobacteriaceaesp. strain EMTCatB1 (DDBJ/EMBL/GenBank数据库中的AP018336和BDLO01000001)使用BWA (version 0.7.17) [37］．使用SAMtools计算映射到各自参考基因组上的reads的数量[38]，如表所示S3．怪兽(1.7.2版本)[39]用于未映射reads的分类学分配。StringTie(版本1.3.4d) [40]用于将映射的reads组装成转录本，并计算组装的转录本的相对丰度。使用edgeR包(3.16.1版本)进行统计分析[41］．使用每百万转录本(TPM)来规范化读取计数，以比较从相同条件下获得的转录组的基因表达水平(表2)S4而且S5)．的修剪后的均值 -值(TMM)用于归一化不同条件下各基因在转录组间的表达水平(表2)S6而且S7)．采用似然比检验检验基因表达差异的统计学意义。采用Benjamini-Hochberg调整控制多重假设检验的错误发现率(FDR)。因此，如果基因表达水平改变两倍以上( ）FDR <0.05。使用Pearson相关不相似度度量进行具有平均链接的层次聚类，其中截止距离或不相似度为0.25。

3.结果与讨论

3.1.生物阴极微生物群落的宏基因组分析

对生物阴极进行宏基因组分析，以表征表面微生物群落的微生物组成和代谢潜力。为了尽量减少样品变化带来的任何潜在影响，从两个独立的生物阴极中分离出DNA，这些生物阴极在−0.5 V与SHE的平衡电位下运行了60天以上。随后的甲烷产量(20.2和24.2 mmol CH₄/天/厘米²)和CV扫描显示，两种生物阴极的产甲烷电活性相似(图S1A)．此外，16S rRNA测序结果表明，两种生物阴极的微生物组成也相似(图印地)．因此，来自两个生物阴极的DNA在文库准备步骤进行全宏基因组鸟枪测序。

Illumina测序reads的组装和分箱表明，该联盟的宏基因组几乎完全由来自两个优势种的序列所支配(图2)1(一))．进一步组装contigs，然后填充缝隙，结果重建了两个物种的环状草图基因组(图S2) [17，18］．标记基因的系统发育分析表明，其中一个物种是与该属产甲烷菌密切相关的太古菌Methanothermobacter(这样命名Methanothermobactersp. strain EMTCatA1)。该物种的基因组被确定为编码所需的氢化产甲烷酶以及CO₂通过不完全柠檬酸还原循环进行的固定途径。该基因组没有编码甲酸转运蛋白或细胞色素的任何明显同源物。特别是Methanothermobactersp.菌株EMTCatA1与大肠杆菌密切相关m . thermautotrophicus菌株∆H是一种嗜热产甲烷菌的模式生物，16S rRNA和16S rRNA的序列一致性分别为99%和98%mcrA基因,分别。此外，基因组Methanothermobactersp.菌株EMTCatA1的基因组高度相似m . thermautotrophicus∆H，与m . thermautotrophicus菌株∆H的基因顺序几乎相同(图S3)．另一个被鉴定的物种是一种与科科里杆菌科放线菌(命名为科科里杆菌科放线菌)有远缘关系的细菌Coriobacteriaceaesp. strain EMTCatB1)(图S4)．基因组草图Coriobacteriaceaesp.菌株EMTCatB1被发现编码厌氧呼吸(亚硝酸盐还原)所需的酶的同源物，以及许多假定的氧化还原蛋白(例如，18 c型细胞色素)。这些结果在很大程度上是出乎意料的，因为16S rRNA基因扩增测序表明，尽管Methanothermobacter相关甲烷菌被证明是一种主要的古菌成分，细菌种群由更多样化的细菌组成(图印地)．的确，在16S rRNA基因扩增子中，放线菌种仅占序列中相对较小的比例(图印地)．此前有报道称，16S rRNA基因扩增子中的放线菌种类被低估，这可能是由于这些基因组的高GC含量[42，43］．例如，GC含量为67.2%Coriobacteriaceaesp.菌株EMTCatB1。

3.2.生物阴极微生物群的qPCR分析

为了检测这两个物种在生物阴极表面的丰度，使用qPCR和群体特异性引物估计16S rRNA基因拷贝数(图1 (b))．除了猎枪测序的DNA (MG在图中1 (b))，从6个独立的产甲烷电反应器(命名为C1~C6)的生物阴极中提取DNA样本并进行分析(C1-C6如图所示)1 (b))．CV证实了六个生物阴极催化电化学反应的能力(图S5)，与先前报道的结果一致[16］．通过扫描电镜确认表面微生物定殖(图S6)．在20 pg的DNA中，古生菌16S rRNA基因的拷贝数从 来 ．甲烷杆菌目(包括属)16S rRNA基因的拷贝数Methanothermobacter)范围从 来 ，这相当于古细菌16S rRNA基因拷贝数的平均51%。细菌16S rRNA基因拷贝数从 来 ．为Coriobacteriaceae相关物种，基因拷贝数从 来 ，这相当于细菌16S rRNA基因拷贝总数的52%。值得注意的是，16S rRNA基因的引物可能高估了甲烷杆菌的丰度，因此，古生菌的基因组草图Methanothermobactersp.菌株EMTCatA1含有两个16S rRNA基因拷贝。尽管如此，16S rRNA基因拷贝数的绝对量化支持了两种物种在生物阴极表面的优势。

3.3.生物阴极表面微生物细胞的FISH分析

FISH分析进一步证实，这两个物种是生物阴极表面微生物种群的主要成分(图2)．荧光显微照片显示，大约26%的微生物被探针标记为甲烷杆菌科的产甲烷菌，从而针对菌株EMTCatA1(图)2(一)-2(c))， 68%的阴极相关微生物被靶向探针标记Coriobacteriaceaesp. strain EMTCatB1(图2(e) -2(g))。特别是，以EMTCatA1为靶标的探针标记的细胞是相对较长的丝状细胞或棒状细胞，中位长度为2.8μM，与未标记的细胞相比，其中位长度为1.5μm(图2(d))。这一发现与之前的其他报告一致Methanothermobacter物种(44，45］．相比之下，探针标记的细胞靶向emtcatb1标记的杆状细胞的中位长度为1.2μM大多比未标记的细胞短，中位长度为2.5μm(图2(h))。因此，可以得出结论，生物阴极的表面群落主要由两种类型的细胞组成:长杆细胞或丝状细胞(通常长于1.6)μ故答案为c。Methanothermobactersp.菌株EMTCatA1和相对较短的棒(通常短于1.6μ故答案为c。Coriobacteriaceaesp. strain EMTCatB1(图2(d)和2(h))。

3.4.生物阴极表面优势种的转录组分析

分析了CC、OC和BrES条件下生物阴极的元转录组，以了解优势种在电甲烷发生中的各自作用。正如我们之前观察到的[16]，除BrES条件外，OC条件下生物阴极的甲烷生成停止，BrES条件下生物阴极的甲烷生成和电子消耗过程都受到抑制(图S7)．对于所有的元转录组，69%-92%的reads被映射到两个物种的基因组上(表2)S2)，进一步表明它们是生物阴极上代谢活跃的主要物种。未映射的reads被分配到不同的taxa(图S8)．在未映射的读本中，没有一个分类单元表现出普遍的过度代表。因此，由于本研究的重点是优势种，未映射的reads被排除在进一步的分析中。

分析了CC条件下的转录组谱，重点分析了与能量代谢和电子转移相关的高转录基因，以确定参与电甲烷发生的候选基因。差异表达基因的层次聚类(显著性标准: ， ）在这些条件中，用来估计阴极电子供应和产甲烷活性对优势种生理的影响。

3.4.1.转录组分析Methanothermobacter sp。应变EMTCatA

为Methanothermobactersp.菌株EMTCatA1在CC条件下，与加氢产甲烷相关的mrna是最丰富的，46个产甲烷相关基因中有15个在丰富的转录本的前10%(表2)S4)．值得注意的是,mcrA(tca_01121),mtd(tca_01413),海洋博物馆(tca_01698)，编码甲基辅酶M还原酶I (MRI)的一个亚基和两个辅因子F的同源物₄₂₀-依赖酶，分别被发现比其同功能酶的基因(如MRII和H₂依赖酶)(图3.)．密切相关m . thermautotrophicus菌株、核磁共振成像和参与辅酶F的酶的表达₄₂₀H₂-有限条件(例如，共培养)[46- - - - - -54］．

在转录组中Methanothermobactersp.菌株EMTCatA1中有146个基因存在差异表达(表2)S6)．基于差异表达模式的层次聚类，确定了6个差异表达基因簇(图4、表S8)．最大的基因簇(A1-I)由49个基因组成，CC条件下的表达水平高于BrES或OC条件下的表达水平。总的来说，A1-I簇中的28个基因编码了功能未知的假设蛋白质。第二大聚类A1-IV由42个基因组成，在BrES和OC条件下表达水平均高于CC条件。A1-IV簇中的8个基因编码了各种应激相关蛋白的同源物，如伴侣蛋白和蛋白酶体(tca_00660、tca_00698和tca_00826)、抗氧化酶和替代氧化还原蛋白(tca_00140、tca_00141、tca_00142、tca_00723和tca_00821)(图中红色箭头标记)4)(表S8)．这可能反映了OC和BrES条件下由于缺乏甲烷生成而导致的细胞能量消耗过程。未发现编码与直接电子摄取相关的明显同源基因。

虽然在OC和BrES条件下甲烷生成停止，但与甲烷生成相关的基因不符合我们的差异表达标准。其他产甲烷菌的产甲烷基因表达均受H₂可用性，且不受抑制甲烷生成的处理的显著影响[46，55］．这也与产甲烷菌中产甲烷作用的重要作用相一致。一个例外是mrtG(tca_01086)，编码MRI γ -亚单位同源物。尽管该基因在OC条件下表现出高于其他条件下的表达(在图中的A1-III簇中)4)，相关的转录本丰度几乎检测不到，因此不太可能具有生物学意义(表S8)．

3.4.2.转录组分析Coriobacteriaceaesp.菌株EMTCatB1

为Coriobacteriaceaesp.菌株EMTCatB1、编码假定的多血红素c型细胞色素的基因(1d0125、1c0363、1c0406、1d0898和1c0642)、NiFe氢化酶(1c0061、1c0060和1c0059)和甲酸脱氢酶(1c0408和1c0407以及上述1c0406)在CC条件下被发现高表达(在丰度最高的10%转录本中:表S5而且S9)．多血红素c型细胞色素和膜结合的氧化还原酶都被认为可以构成细胞外电子转移导管Thermincola potens，一种外电性革兰氏阳性细菌[56，57］．此外，编码v型atp酶亚基的基因簇(1d0031-37，表S5)被高度转录。

在转录组中Coriobacteriaceaesp. strain EMTCatB1，鉴定出103个差异表达基因(图5、表S7)．差异表达基因的一般聚类组织类似于Methanothermobactersp. strain EMTCatA1(图5、表S10)．在CC条件下，由43个基因组成的最大聚类(B1-II)表达量较高，相反，由38个基因组成的第二大聚类(B1-V)在BrES和OC条件下表达量较高。簇B1-II包含上述基因，编码两个多血红素c型细胞色素(1d0898和1c0642)，一个甲酸脱氢酶的氢酶组分(1c0407)和两个v型atp酶亚基(1d0032和1d0037)(图中蓝色箭头所示)5)(表S10)．这些结果表明，这些基因在生物阴极表面的电子消耗中起作用。此外，与菌株EMTCatA1的A1-IV簇相似，B1-V簇由胁迫相关基因组成，编码伴侣蛋白同源物(1d0043、1d0806和1d0807)、抗氧化酶(1c0451、1c0554和1c0665)和一种替代氧化还原蛋白(1c0602)(图中红色箭头)5)(表S10)，表明该细菌在BrES和OC条件下都处于应激状态。

3.5.优势种在生物阴极表面可能的代谢功能

根据我们目前的研究结果和以往的研究结果[16]，研究了优势种在电甲烷生成过程中的可能作用。我们的结论是Methanothermobactersp.菌株EMTCatA1通过加氢产甲烷途径在生物阴极上进行产甲烷，其操作方式与H₂召集条件。这是可能的，这种甲烷菌单独催化电甲烷生成通过直接电子摄取从阴极，一个现象，先前报道的甲烷细菌属类太古菌菌株IM1 [6]各种各样的甲烷八叠球菌属物种(58］．但是，对于Methanothermobactersp.菌株EMTCatA1为纯培养物m . thermautotrophicus应变∆H，是Methanothermobactersp.菌株EMTCatA1，与SHE相比，在电位高于- 0.6 V的阴极上没有表现出催化能力[16］．只有14个基因Methanothermobactersp.菌株EMTCatA1，包括两个crispr相关基因tca_01044和tca_01045，在该菌株中无明显同源性m . thermautotrophicus应变∆HS11)．虽然这些基因中的一些可能赋予了甲烷菌直接电子摄取的能力，我们推测Methanothermobactersp.菌株EMTCatA1是一种氢化甲烷菌，与该菌株高度相似m . thermautotrophicus菌株∆H，可能无法单独催化甲烷电生成。

的角色Coriobacteriaceaesp菌株EMTCatB1在甲烷电生成中的作用仍有较多推测。根据其基因表达谱，可以推测Coriobacteriaceaesp.菌株EMTCatB1能够通过多血红素c型细胞色素(例如由1d0898和1c0642编码的细胞色素)从阴极直接摄取电子。然后电子可能被引导到相关的膜结合氧化还原酶，如氢化酶和甲酸脱氢酶。至少，部分来自电子流的电能可能被用来产生质子动力，通过v型ATP酶驱动ATP合成。此外，NADH:泛醌氧化还原酶(复合物I)可能参与质子动力的产生，因为有两个基因编码该酶的亚基(nuoCD: 1c0337和1c0336)在CC条件下高转录(表S5)．因此，OC条件下细胞能量可能被耗尽，这与应激相关基因的诱导是一致的。

3.6.生物阴极表面电产甲烷过程的一种可能模型

根据我们的结果和讨论，很容易推测，阴极的电子的很大一部分被引导到质子还原过程中Coriobacteriaceaesp.菌株EMTCatB1，导致H₂进化。的Methanothermobactersp.菌株EMTCatA1消耗释放的H₂用于氢化甲烷生成。在Coriobacteriaceae在BrES条件下，菌株EMTCatB1的胁迫相关基因表达量较高，说明BrES的添加对细菌的生理产生了影响。这可以解释为细菌在阴极上的代谢活动需要产甲烷作用。换句话说，甲烷菌的氢营养化产甲烷作用有助于降低H₂分压。因此，它的新陈代谢在热力学上是有利的。因此，两个优势种可能在生物阴极表面代谢相互依赖，进行专门的互惠代谢[59用来催化甲烷电生成。在另一个生物阴极中，已检测到与科里杆菌科有关的细菌为优势种[60]，支持放线菌在甲烷电生成中发挥作用的观点。

然而，上述模型的推测性很强，需要进一步研究。一个相当大的限制是目前缺乏关于优势种的生理学知识。特别是Coriobacteriaceaesp.菌株EMTCatB1在培养种中没有近亲(图S4)，而其代谢特性大部分仍不为人所知。政府的回应Coriobacteriaceaesp.菌株EMTCatB1对BrES可能是由于直接效应;即，BrES对细菌有毒或被细菌代谢，从而改变其基因表达模式。此外，由于基因组不编码CO的保守酶₂目前还不清楚细菌是如何在阴极上生长的。在这方面，似乎是合理的Coriobacteriaceaesp.菌株EMTCatB1利用醋酸酯作为碳源，它只在生物阴极的初始发育阶段(在单室反应器中)存在于介质中，然后从介质中省略(在双室反应器中)。换句话说，细菌可能无法在生物阴极上繁殖(在没有醋酸盐的情况下)，但仍然具有代谢活性，并能够产生H₂．

因此，未来的研究应进行优势种的分离，并进行生化分析[56，57，61］．这种方法也将有助于检查相对较小的物种的可能贡献，这些物种被排除在本研究之外，以详细说明电甲烷生成过程。为了更全面地理解生物阴极的机制，还需要在不同条件下进行进一步的转录组/蛋白质组分析，例如使用不同的电势值。

4.结论

在本研究中，主要成分的一个新的嗜热财团富集在产甲烷电生物阴极。结果表明，该群落的宏基因组主要以黄曲霉为主Methanothermobactersp. strain EMTCatA1和Coriobacteriaceaesp.菌株EMTCatB1。通过qPCR和FISH进一步证实了这两个物种在生物阴极上的优势，我们分析了不同条件(CC、OC和BrES)下生物阴极中的转录组。根据甲烷菌加氢产甲烷相关基因及编码c型细胞色素和膜结合酶的基因表达谱，推测这些菌株在电产甲烷过程中分别具有产甲烷和吸电子的功能。因此，本研究首次对产甲烷电生物阴极进行了多组学表征，为以前对各种生物电化学系统的研究提供了补充信息。

数据可用性

宏基因组、元转录组和16S rRNA基因扩增子的原始读取分别保存在日本DNA数据库(DDBJ)的序列读取档案中，由BioProjects PRJDB8994、PRJDB8993和PRJDB8998负责。

利益冲突

作者与论文中提到的商业身份没有直接的经济关系，这可能导致利益冲突。

致谢

作者要感谢Hiroshi Sagara博士(东京大学医学科学研究所)的SEM分析。作者要感谢Enago (http://www.enago.jp)浏览英文语文复习。本研究由INPEX公司和日本科学促进协会(JSPS)科学研究资助基金(C) 17K07713(给Hajime Kobayashi)支持。

补充材料

补充图(宏基因组测序生物阴极的特征(图S1)，两个优势种的基因组图(图S2)，大蠊的全基因组比对Methanothermobactersp. strain EMTCatA1和m . thermautotrophicus菌株∆H(图S3)，为Coriobacteriaceaesp.菌株EMTCatB1等放线菌(图S4)，产甲烷电反应器C1~C6生物阴极的循环伏安图(图S5)，产甲烷电反应器C1~C6生物阴极表面的代表性扫描电镜图(图S6)，电流和CH₄用于转录组分析的生物阴极的生产配置(图S7)，以及未映射RNA-seq读取的分类分配(图S8))和表(探针和引物的详细信息(表S1)， RNA测序和映射(表S2和S3)， TPM-(表S4和S5)和TMM-(表S6和S7)的归一化读取计数和差异表达基因簇(表S8和S10)的优势种的转录组，c型细胞色素Coriobacteriaceaesp.菌株EMTCatB1(表S9)Methanothermobactersp.菌株EMTCatA1不存在于m . thermautotrophicus应变∆H(表S11))可在线获取。（补充材料）

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