聚(3-羟基丁酸)的合成Haloarcula，Halorubrum,Natrinema以淀粉为碳源的盐生菌属

摘要

由聚(3-羟基丁酸酯)(PHB)衍生的微生物生产生物塑料，为解决塑料污染提供了一种有前景的选择。与其他极端微生物相比，嗜盐古菌被认为是利用可再生、廉价的碳源生产PHB的细胞工厂，从而降低了发酵成本。本研究以淀粉为唯一碳源，通过尼罗红/苏丹黑染色，从突尼斯高盐湖Chott El Jerid的3个富集培养物中分离得到33个嗜盐古菌，并通过PCR扩增进一步证实phaC而且阶段聚合酶基因。14株分离株已被确认为产生PHA的阳性候选株，并在两个季节都被检测到。16S rRNA基因分析表明，这些菌株属于Halorubrum，Natrinema,Haloarcula属。其中3株phb产生株CEJ34-14、CEJ5-14和CEJ48-10与Halorubrum chaoviator，Natrinema螺旋体,Haloarcula tradensis细胞干重(CDW)分别为9.25、7.11和1.42%。我们的研究结果强调了Halorubrum，Natrinema,Haloarcula以可溶性淀粉为碳源，在高盐度条件下(250 g L^－1氯化钠)。

1.简介

塑料是一种非常有用的材料，其产量正在增长。每年有数百万吨不可降解塑料最终进入我们的自然环境，影响我们的健康、野生动物、陆地和海洋栖息地[1］．因此，聚羟基烷烃(PHAs)是生物可降解和生物相容的聚合物，已被推广为传统油基塑料的替代品[2，3.］．多环芳烃由各种各样的细菌和古菌从不同的碳源合成，作为细胞内储存化合物，在不平衡的条件下生存[4，5］．极端嗜盐古菌，生活在高盐环境，含高盐浓度，是各种潜在应用的首选，包括合成多羟基烷酸盐。聚3-羟基丁酸酯(PHB)是第一个在死海物种中发现的生物塑料Halobacterium描述于1972年[6］．此后，微生物包括极嗜盐古菌属Haloquadratum，Halorubrum，Halobacterium，Haloterrigena，Haloferax，Natronococcus，Natronobacterium，Haloarcula，Natrinema，Halogeometricum，Halopiger，Halobiforma,Halococcus也可累积相当数量的PHB [7- - - - - -9]使用菌落/细胞染色法、以PHA合酶基因为靶标的分子工具和分析技术，如傅里叶变换红外光谱法、克罗东酸分析、气相色谱法和液相色谱法[10］．

这些生物可以利用各种可再生碳源，在蒸馏水中通过细胞裂解容易释放PHB，从而降低了其较高的生产成本[11］．最近的几项研究表明，以葡萄糖为唯一碳源的古菌菌株获得PHB的生产力[9，12，13与其他基质(废物和预处理的酒糟)相比[14，15］．然而，基于利用淀粉探索古菌种生产PHB的研究报道很少，尽管它的广泛可用性[16，17］．因此，选择能够利用淀粉基质进行PHB生物合成的菌株具有重要意义。

最大的盐湖Chott El Jerid位于突尼斯南部。此外，这个湖是非洲北部最大的湖(5360公里)²)，盐浓度高于33% NaCl [18］．尽管它来自大陆，但它有盐盐组成。它可能在冬天被洪水淹没，在旱季蒸发成沙漠。这些气候条件使肖特成为短暂的极端环境。我们之前的研究利用培养和分子方法描述了肖特埃尔杰里德在雨季和旱季的微生物多样性。从表层沉积物中分离得到嗜盐厌氧发酵菌[19，20.］．不依赖培养的技术，以16S rRNA和编码异化亚硫酸盐还原酶β亚基基因的功能标记为目标(dsrB)，甲基辅酶M还原酶(mcrA)，分别显示了丰富多样的原核生物群落、硫酸盐还原菌(SRB)和产甲烷菌[20.，21］．此外，在Chott El Jerid已经分离出嗜盐好氧细菌和产生胞外水解酶的古菌菌株[22］．由于古菌在研究样本中数量超过细菌，我们的目的是扩大Chott El Jerid的古菌合成PHA的可能性。本研究的目的是:(1)利用表型和分子生物学方法对肖特埃尔杰里德(Chott El Jerid)两个季节的水体或水/沉积物混合样品中嗜盐古菌进行富集、分离和筛选;(2)以淀粉为碳源的产pha菌株的鉴定与表征;(3)对所制备聚合物的鉴定和定量。

2.材料和方法

2.1.样品收集

样品(S1-10)和(S6M-14;S6W-14)分别在干季(2010年10月)和湿季(2014年1月)从大陆短暂湖泊Chott El Jerid收集。高盐水或水/沉积物混合样品在距离地表约0-10厘米的不同位置采集。样本收集于无菌瓶中，在3小时内送到实验室，并在4°C无菌保存直至分析。采样点的环境参数见表1如前所述[20.］．

2.2.产聚羟基烷酸(PHA)古菌的富集与分离

样品在聚pha培养基(每升NaCl, 250 g;MgCl₂6 H₂哦,10 g;MgSO₄7小时₂啊,15克;氯化钾,4 g;CaCl₂2 H₂啊,1 g;NaHCO_3., 0.5克;酵母抽提物，1 g)，添加1%可溶性淀粉，37℃，180转/分，7天。

为分离产pha的盐生菌，将样品连续稀释100倍μ每种稀释各取L，分别涂于琼脂培养基(20 g L^－1)。孵育后，根据着色和/或形态从培养皿中挑选33个菌落，多次转移到新鲜培养皿中，直到获得纯培养。菌落根据颜色、形状和边缘外观进行分化。在100x物镜(Optika, B-500 ERGO模型，意大利)下使用油浸法检测细胞的形态特征。

2.3.基因组DNA的提取

当古菌生长达到指数期时，根据制造商的说明，使用GF-1核酸提取试剂盒(Vivantis Technologies Sdn Bhd, Selangor DE, Malaysia)提取基因组DNA。

2.4.古菌菌株的鉴定

引物集21F (5 -TTCCGGTTGATCCYGCCGGA-3 ）［23和1492R (5 -GGTTACCTTGTTACGACTT-3 ）［24］．PCR反应在50分钟内完成μL含1.25 U Taq聚合酶(Fermentas)的混合液，1x PCR缓冲液，200μM (dNTP)， 0.2μ每个引物M，基因组DNA 50ng。30次循环(1分钟94°C;1分钟55°C;2分钟72°C)使用热循环器(Applied Biosystems, USA)进行。扩增产物大小为1500bp，用1%琼脂糖凝胶电泳分析，并用Bio-Rad凝胶x射线成像系统(Gel Doc XR Imaging system, Bio-Rad)拍照。将10个酶切片段进行酶切分析μ限制性内切酶10u的PCR产物运算器我和Mbo我虽然有三世(8 Uμl^－1)和适当的限制缓冲器，最后的容量为20μ在37°C的条件下加热3小时。这些酶(Life Technologies)常用于限制性分析，在物种间具有最显著的差异。酶解后获得的16S rRNA片段，在50 V的3%琼脂糖凝胶上分离4小时，并用Gel Doc系统拍照。通过比较酶切模式筛选出的阳性分离株的原始PCR产物和下文描述的产生pha的分离株，使用PureLink®快速凝胶提取和PCR纯化组合试剂盒(Cat。不。K220001, Invitrogen公司，卡尔斯巴德，美国)在克隆前按照制造商的说明进行。将纯化的PCR产物连接成pGEM-T容易(Promega Corporation, Madison, WI)系统的制造商推荐。结扎混合液转化为DH5α主管细胞。重组质粒经生态RI消化并选择用于测序。测序和系统发育分析如先前报道[25］．

2.5.潜在嗜盐PHA产生菌的筛选

所有分离株经苏丹黑B (Sudan Black B, SBB)筛选PHA，并经尼罗红(Nile Red, NR)染色(Sigma)确证。用0.3%的苏丹黑B.酒精溶液对菌落进行染色，产pha菌落呈黑色[26］．尼罗红染色(25% (w/v)原液二甲亚砜(DMSO))直接接种重复(0.5μ克毫升^－1(w/v))在含有1% (w/v)淀粉的琼脂培养基中，在染料的存在下生长细胞。压力大肠杆菌作为阴性对照。Natrinema altunense在我们之前的工作中，菌株CEJGTEA101 [KY129977]被鉴定为产pha的菌株[9]，并作为阳性对照。37°C孵育15天后，选择平板紫外线照射后显示橙色荧光的分离株作为PHA积累器[27］．利用荧光显微镜(Olympus BX51) [28］．

同时，对所有分离株进行了聚羟基烷酸生产的遗传潜力筛选。盐生菌中负责PHA产生的基因聚集在III类合成酶中，该合成酶由两个亚基(阶段而且PhaC)．利用PCR技术，根据基因中高度保守的区域，利用两对编码片段(codehopEF/codehopER)和(codehopCF/codehopCR)筛选古细菌多羟基烷烃产生者阶段而且PhaC分别为(29，30.］．引物代码hopef (5 -CGACCGAGTTCCGCGAYATHTGGYT-3 ）和codehopER (5 -GCGTGCTGGCGGCKYTCNAVYTC-3 ）被用来放大阶段聚合酶基因。放大PhaC利用引物codehopCF (5 -ACCGACGTCGTCTACAAGGARAAYAARYT-3 ）和codehopCR (5 -GGTCGCGGACGACGTCNACRCARTT-3 ）［30.］．PCR条件为:初始变性(94°C 5 min)后，94°C 30 s、55°C 45 s、72°C 45 s循环30次，最后延伸(10 min, 72°C)。PCR扩增在热循环仪(Applied Biosystems)上进行，使用1.25 U的Taq DNA聚合酶(Fermentas)， 1x PCR缓冲液，0.2μ每个引物的M是200μM的DNTP，和50 ng的DNA模板。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳。

2.6.潜在PHA产生菌的生长动力学

菌株在50ml经10g L改性的pha产生培养基中培养^－1淀粉。在Erlenmeyer烧瓶中培养，37°C, 180转/分。使用紫外可见分光光度计(日本岛津UV-1800)测定每个pha产生菌株在600 nm处的吸光度，每24小时测定一次。

2.7.电池干重(CDW)的测定

培养至对数期后期，6000 rpm离心30 min;然后，用蒸馏水洗涤细胞两次。丢弃上清液，待颗粒冻干后称重。

2.8.气相色谱法测定潜在嗜盐PHA生产者中PHB的含量

在甲醇水解后，聚合物的细胞含量及其组成通过使用安捷伦7890A色谱分析(GC)，配备毛细管柱( ）以及先前报道的火焰电离检测器(FID) [31］．样品进行重复分析。使用标准PHB (Sigma-Aldrich, USA)进行校准。测定细胞中PHB含量为 ．4.4分钟的峰值代表3-羟基丁酸甲酯。

3.结果

3.1.用染色法筛选产pha菌株

通过重复传代，采集大量橙色、红色、粉色菌落并纯化。从三个试验的富集培养物中共分离到33株极嗜盐菌株，筛选PHA积累(表)2)．样品S1-10、样品S6M-14和样品S6W-14的高盐水中分别分离出11个、20个和2个菌株。苏丹黑B染色后，选择14株阳性分离株(图S1 (a))．此外，在紫外线照射下，它们用尼罗红显示出高荧光强度(图S1 (b))．阳性对照菌株在紫外光照射下呈现橙色荧光。

3.2.应用退化聚合酶链反应筛选PHA合酶基因

结果筛选出33株，其中14株为PHA产生株。同样的菌株，用表型方法显示阳性结果(苏丹黑和尼罗红)，得到约230 bp的条带(阶段)及280 bp (phaC)(表2；数字S2)．

3.3.潜在PHA产生菌的形态特征

所有分离株的细胞均为杆状、球菌状和多形体(见表)2)．所有被选菌株作为生产者都是圆形的。细胞的尺寸约为1 ~ 2μm(图S3)．

3.4.系统发育分析

对33株盐古菌进行ARDRA分析。三种酶的比较有3运算器我和MboI与分离物的消化模式显示了六种不同的古菌模式的发生(表2)．聚羟基烷烃产生菌株分为三组。菌株CEJ3-14、CEJ5-14、CEJ6-14、CEJ7-14、CEJ8-14、CEJ9-14、CEJ10-14、CEJ11-14、cej1 -14、CEJ24-14、CEJ25-14和CEJ28-14聚为剖面III。菌株CEJ34-14被分组到剖面i。ARDRA模式V代表分离株CEJ48-10(图5)S4)．对分离株的16S rRNA基因进行系统发育分析，结果表明该属为Natrinema，Haloarcula,Halorubrum．分离株CEJ34-14与Halorubrum chaoviatorDSM 19316。分离株CEJ3-14、CEJ5-14、CEJ6-14、CEJ7-14、CEJ8-14、CEJ9-14、CEJ10-14、CEJ11-14、cej1 -14、CEJ24-14、CEJ25-14和CEJ28-14的亲缘关系最为密切Natrinema．最终确定菌株CEJ48-10属于该属Haloarcula(图1)．

3.5.盐生菌阳性分离株生产PHB的定量估计

表中数据3.PHB含量在CDW的0.07% ~ 9.25%之间。研究菌株中，分离株CEJ34-14、CEJ5-14和CEJ48-10隶属于Halorubrum chaoviator相似(99.7%),Natrinema螺旋体(相似度99.33%)，以及Haloarcula tradensis以相似度为97.72%为最佳。在荧光显微镜下观察它们的细胞2)．分离株CEJ34-14在培养48 h后表现出较高的PHB产量和较高的生长速度，因此需要重点介绍。其生长以2天为对数期，稳定期较长。然而，菌株CEJ5-14和CEJ48-10的生长需要3或4天才能达到对数期(图4)3.)．值得注意的是，菌株CEJ8-14、CEJ9-14和CEJ28-14表现出较高的生物量(1150-3620 mg L)^－1)，但PHB产量较低(表3.)．与标准PHB相比，分离株CEJ34-14、CEJ5-14和CEJ48-10得到的PHA GC谱在保留时间分别为4.17、4.11和4.43分钟时表现出优势峰(图3-羟基丁酸)4)．PHB含量分别约为细胞干重的9.25、7.11和1.42%。必威2490其他菌株的生长曲线和色谱图在补充材料中展示(图S5而且S6)．

4.讨论

生物可降解塑料的发展代表了应对塑料垃圾相关问题的另一种方式。聚羟基烷酸盐被认为是生物降解塑料的优秀候选人。极端嗜盐古菌有能力在其细胞中合成和积累PHA作为内含物[11，32］．在这项研究中，研究人员利用淀粉基质从高盐湖Chott El Jerid中分离出产生phb的古菌。从3种培养基中分离得到33株菌株。分为3个盐生菌属的14株菌株中检出PHBHaloarcula，Halorubrum,Natrinema并在门内簇生Euryarchaeota包括Haloarculaceae，Halorubraceae,Natrialbaceae家庭,分别。它们通过染色方法(苏丹黑B和尼罗红)筛选，这是广泛用于嗜盐细菌，但也成功地用于Halococci，Haloarcula，Haloferax，Halorubrum，Natronococcus，Halogeometricum，Halobacterium属和其他盐生菌菌株[8，13］．与此同时，很明显，检测phaC而且阶段用染色法在14个古菌细胞中显示了上述基因，证实了PHB的生物合成。据我们所知，对古菌领域中参与PHB合成的基因进行分子鉴定的研究很少[33］．其中，有一类极嗜盐古菌具有重要的生物技术意义Haloarcula这在基因上得到了很好的理解。Han等[12发现了两个相邻的基因阶段_嗯而且phaC_嗯编码两个PHA合成酶亚基(III类)，表明这些基因是PHB合成所必需的Haloarcula marismortui(在2%葡萄糖培养基上培养，产生21% PHB的CDW) [12］．后来，Han等人[30.确认检测到phaEC18个PHB或聚(3-羟基丁酸-co-羟基戊酸)PHBV产生者的基因，包括Haloarcula，Halorubrum，Natrinema，和其他属通过利用碳水化合物葡萄糖或果糖[30.］．最近，有报道称，这两个基因被检测到的基因组Natrinema altunenseCEJGTEA101，分离自Chott El Jerid [9］．

目前的研究是我们以前工作的延续[9]，提出了通过大量来自Chott El Jerid的盐生菌菌株来扩大我们对PHB分泌的认识的可能性，因为它们必威2490有以下几个优点:首先，它们在高盐度下生长，最小化了微生物污染。其次，细胞内的高渗透压促进了PHB的恢复。最后，他们的能力消耗广泛的低成本碳源，降低了PHB的生产成本。3株菌株CEJ34-14、CEJ5-14和CEJ48-10隶属于Halorubrum chaoviator相似(99.7%),Natrinema螺旋体(相似度99.33%)，以及Haloarcula tradensis(相似度为97.72%)为PHB的最佳产率，分别为其CDW的9.25%、7.11%和1.42%。值得注意的是，这三个属在其他高盐环境中也被发现为PHA蓄能器[7]，但只有少数物种能够利用淀粉分泌大量PHB。关于Haloarcula调查时，并无PHB累积Haloarcula使用淀粉的物种Haloarcula．sp. IRU1可产生57% PHB/CDW [17］．这种从乌尔米亚湖分离的物种已被证明可以从石化废水中产生大量的PHB(占CDW的63%)，作为含有多种碳氢化合物(如线性烷基苯)的碳源[34］．其他Haloarcula物种如Haloarcula粳稻，Haloarcula amylolytica,Haloarcula argentinensis可积累PHB，从葡萄糖中获得的PHB分别为CDW的0.5、4.4和6.5% [30.，35］．虽然已报道从淀粉，葡萄糖和废物生产PHB，成员Haloarcula在突尼斯南部盐湖首次发现PHB生产者[15］．目前，没有证据表明PHB的积累Halorubrum淀粉用作碳源时的物种[11］．如前所述，两个物种隶属于Halorubrum产生PHB或PHBV(占CDW的2.1-12.7%)的植物能以葡萄糖为唯一碳源[30.］．另一方面，大多数的成员Natrinema在含葡萄糖的培养基上培养时发现是PHBV的生产者[30.或淀粉[36作为碳源。

在我们之前的工作中[9]， 20个极嗜盐古菌属Halorubrum(17株),Natrinema(2株)Haloterrigena从旱季肖特埃尔杰里德(Chott El Jerid)的S1-10样品中分离的1株菌株进行筛选，利用与本研究相同的聚PHA培养基生产PHA。其中，只有两个品系属于Natrinema而且Haloterrigena研究表明，在添加2%葡萄糖的培养基中，该菌可分别积累7%的PHB和3.6%的聚(3-羟戊酸)(PHV)。在本研究中，用相同的样品(S1-10)富集培养并添加淀粉表明，只有一个PHB产生者与该属相关Haloarcula．然而，在潮湿季节收集的样品和补充相同的碳源富集培养显示了一个物种的存在Halorubrum大量的NatrinemaS6W-14和S6M-14中分别有12株具有产phb能力的菌株。这些结果表明，分离方法、碳源、季节和取样地点都可能影响产phb古菌的选择。

5.结论

根据获得的数据，在突尼斯沙漠的纯培养中获得了不同的古菌分离株，它们能够消耗淀粉作为PHB生物合成的唯一碳源。然而，与其他最近的亲缘关系相比，细胞内烧瓶批量培养产生PHB的产量较低。因此，未来将研究淀粉等低成本原料的分批、补料和连续发酵的发酵优化，以及代谢工程策略，以提高PHB的质量和产量。

数据可用性

这些序列已提交至GenBank数据库，注册号为:MN516817至MN516830。

的利益冲突

作者声明不存在利益冲突。

作者的贡献

Fatma Karray和Manel Ben Abdallah对这项工作做出了同样的贡献。

致谢

这项工作得到了突尼斯高等教育和科学研究部的支持。我们也感谢审稿人对本文的有益评论。

补充材料

补充1．图S1:用苏丹黑B (a)和尼罗红(B)在琼脂平板上聚羟基烷酸染色的细胞。的菌株大肠杆菌而且Natrinema altunense菌株CEJGTEA101分别为阴性和阳性对照。

补充2．图S2: PCR扩增PhaC(一)和阶段(b)产生阳性菌株的PHA合酶(III类)基因编码。Lane M1表示分子大小标记(100bp DNA ladder)， Lane M表示分子大小标记(1kb DNA ladder)。

补充3．图S3:相位对比显微图显示产生pha的菌株在25% (w/v) NaCl的pha积累培养基中生长的细胞;酒吧,10μm。

补充4．图S4:(A) pcr扩增的16S rRNA的限制性消化运算器我(一个),Mbo我和(b)有III (c)来自样品S1-10， (B)来自样品S6M-14和S6W-14。Lane M代表分子大小标记1kb DNA阶梯。

补充5．图S5:分离株随时间的生长曲线。在600 nm波长下，每24 h取一次光密度。显示了来自重复测试的平均值。

补充6．图S6:分离株培养得到的PHB图谱(a) CEJ3-14， (b) CEJ6-14， (c) CEJ7-14， (d) CEJ8-14， (e) CEJ9-14， (f) CEJ10-14， (g) CEJ11-14， (h) CEJ21-14， (i) CEJ24-14， (j) CEJ25-14， (k) CEJ28-14，和(l) PHB标准(Sigma)。

参考文献

1. J. H. Song, R. J. Murphy, R. Narayan和G. B. H. Davies，“传统塑料的可生物降解和可堆肥替代品，”英国皇家学会哲学学报B第364卷第1期。1526, pp. 2127-2139, 2009。视图:出版商的网站|谷歌学者
2. R. C. Thompson、C. J. Moore、F. S. Vom Saal和S. H. Swan，“塑料、环境和人类健康:当前共识和未来趋势”，英国皇家学会哲学学报B:生物科学第364卷第1期。1526, pp. 2153-2166, 2009。视图:出版商的网站|谷歌学者
3. J. M. Luengo, B. García, A. Sandoval, G. Naharro，和E. R. Olivera，“微生物中的生物塑料，”微生物学的最新观点第6卷，没有。3，第251-260页，2003年。视图:出版商的网站|谷歌学者
4. A. Steinbüchel和H. G. Schlegel，“poly(β-羟基烷酸)合成产碱杆菌属eutrophus”,分子微生物学第5卷，no。3，第535-542页，1991。视图:出版商的网站|谷歌学者
5. A. J. Anderson和E. A. Dawes，“细菌多羟基烷酸的发生、代谢、代谢作用和工业用途，”微生物学检查第54卷，no。4，第450-472页，1990。视图:出版商的网站|谷歌学者
6. R. G. Kirk和M. Ginzburg，“两种盐杆菌的超微结构，”超微结构研究杂志第41卷，no。1-2, 80 - 94,1972年。视图:出版商的网站|谷歌学者
7. A. Poli, P. Di Donato, G. R. Abbamondi，和B. Nicolaus，“古菌胞外多糖和多羟基烷烃的合成、生产和生物技术应用”，古生菌， vol. 2011，文章ID 693253, 13页，2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
8. A. Legat, C. Gruber, K. Zangger, G. Wanner和H. Stan-Lotter，“在Halococcus以及其他盐古菌物种。”应用微生物学及生物科技第87卷第1期。3, pp. 1119-1127, 2010。视图:出版商的网站|谷歌学者
9. M. Ben Abdallah, F. Karray和S. Sayadi，“利用廉价的碳源，从Chott El Jerid的两种嗜盐古菌分离物生产多羟基烷烃，”生物分子第10卷，no。1, 2020。视图:出版商的网站|谷歌学者
10. G.-Y。棕褐色,C.-L。Chen, L. Li等，“启动生物聚合物聚羟基烷烃(PHA)的研究:综述，”聚合物第6卷，没有。3, pp. 706-754, 2014。视图:出版商的网站|谷歌学者
11. M. Koller，“水活性边缘的聚羟基烷酸生物合成——盐生菌作为生物聚酯工厂，”生物工程第6卷，没有。2、2019。视图:出版商的网站|谷歌学者
12. 韩杰，陆强，周莉，周杰，向海，“phaEC的分子表征_嗯在极端嗜盐古菌Haloarcula marismortui中合成聚(3-羟基丁酸)所需的基因。”应用与环境微生物学第73卷，no。19，第6058-6065页，2007。视图:出版商的网站|谷歌学者
13. B. B. Salgaonkar, K. Mani，和J. M. Bragança，“从印度传统太阳盐湖分离的嗜盐古菌积累多羟基烷烃，”极端微生物第17卷，no。5, pp. 787-795, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学者
14. A. Pramanik, A. Mitra, M. Arumugam等人，“利用酒糟生产聚羟基丁酸Haloarcula marismortui”,叶形线Microbiologica第57卷，no。1, pp. 71-79, 2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
15. R. Mitra, T. Xu, H. Xiang和J. Han，“利用嗜盐菌合成聚羟基烷烃作为一个有前途的细胞工厂的最新进展，”微生物细胞工厂第19卷，no。86, pp. 1-30, 2020。视图:出版商的网站|谷歌学者
16. J. G. Lillo和F. Rodriguez-Valera，“培养条件对poly(β-羟基丁酸)生产的地中海Haloferax，”应用与环境微生物学第56卷，no。8，第2517-2521页，1990。视图:出版商的网站|谷歌学者
17. M. Taran，“从不同的碳源合成聚(3-羟基丁酸)通过Haloarculasp, IRU1。”高分子塑料技术与工程第50卷，没有。5, pp. 530-532, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
18. N. kbirl - ariguib, D. B. H. Chehimi和L. Zayani，“利用溶解度相图处理突尼斯盐湖，”纯化学与应用化学第73卷，no。5，第761-770页，2001。视图:出版商的网站|谷歌学者
19. M. Ben Abdallah, F. Karray, N. Mhiri等人，“从高盐湖中分离出的一种厌氧、嗜盐、发酵细菌的芽孢halobacter salinus sp. nov.的特性描述”国际系统和进化微生物学杂志， vol. 65, Part 2, pp. 543-548, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
20. M. B. Abdallah, F. Karray, N. Mhiri等人，“突尼斯高盐湖Chott El Jerid的原核生物多样性，”极端微生物第20卷，no。2, pp. 125-138, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学者
21. M. B. Abdallah, F. Karray, N. k列奥等人，“利用Illumina Miseq测序、DGGE和qPCR分析短暂高盐湖Chott El Jerid原核生物的丰度和多样性，”极端微生物第22卷，no。5, pp. 811-823, 2018。视图:出版商的网站|谷歌学者
22. F. Karray, M. B. Abdallah, N. Kallel, M. Hamza, M. Fakhfakh和S. Sayadi，“从高盐湖分离的嗜盐细菌和古菌产生的胞外水解酶，”分子生物学报告第45卷，没有。5, pp. 1297-1309, 2018。视图:出版商的网站|谷歌学者
23. e.f. DeLong，“沿海海洋环境中的古细菌”，美国国家科学院学报第89卷第1期。12，第5685-5689页，1992年。视图:出版商的网站|谷歌学者
24. D. J. Lane，“16S/23S rRNA测序”，在Stackebrandt E， M. Goodfellow，编辑，细菌系统学中的核酸技术，115-175页，John Wiley & Sons，纽约，1991。视图:谷歌学者
25. F. Karray, M. Mezghani, N. Mhiri, B. Djelassi和S. Sayadi，“膜生物反应器降解阴离子表面活性剂废水的小规模研究:新型阴离子表面活性剂降解细菌的分离”，国际生物降解&生物降解， vol. 114, pp. 14-23, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学者
26. M. Liu, J. E. Gonzalez, L. B. Willis和G. C. Walker，“一种分离胞外多糖缺乏突变体的新筛选方法，”应用与环境微生物学第64卷，没有。11，第4600-4602页，1998年。视图:出版商的网站|谷歌学者
27. P. Spiekermann, B. H. A. Rehm, R. Kalscheuer, D. Baumeister和A. Steinbuchel，“一种灵敏的活菌落染色方法，使用尼罗红直接筛选积聚多羟基烷酸和其他脂类储存化合物的细菌，”档案的微生物学，第171卷，no。2，第73 - 80,1999年。视图:出版商的网站|谷歌学者
28. B. B. Salgaonkar, K. Mani和J. M. Braganca，“由中度嗜盐盐盆分离物积累的多羟基烷烃的表征芽孢杆菌megaterium应变H16。”应用微生物学杂志第114卷第1期。5, pp. 1347-1356, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学者
29. T. M. Rose, E. R. Schultz, J. G. Henikoff, S. Pietrokovski, C. M. McCallum和S. Henikoff，“用于扩增远亲序列的同源-退化杂交寡核苷酸引物”核酸的研究第26卷，没有。7，第1628-1635页，1998年。视图:出版商的网站|谷歌学者
30. J. Han, J. Hou, H. Liu等人，“广泛分布于嗜盐古菌的一种新型多羟基烷酸合酶亚型，与细菌型合酶同源，”应用与环境微生物学第76卷第1期。23, pp. 7811-7819, 2010。视图:出版商的网站|谷歌学者
31. H. Brandl, R. a . Gross, R. W. Lenz和R. C. Fuller，“oleovorans假单胞菌作为多聚(β-羟基烷酸酯)作为生物可降解聚酯的潜在应用。”应用与环境微生物学第54卷，no。8, 1977-1982年和1988年。视图:出版商的网站|谷歌学者
32. V. Kumar和S. K. Tiwari，“嗜盐古菌的Halocin多样性及其应用”，载微生物多样性在生态系统可持续性和生物技术中的应用，第497-532页，施普林格，新加坡，2019年。视图:出版商的网站|谷歌学者
33. 王磊，刘强，吴旭等，“古菌能量储备代谢途径的生物信息学分析”，科学报告第9卷，没有。1034, 2019年1-12页。视图:谷歌学者
34. M. Taran，“利用石化废水生产聚(3-羟基丁酸)由Haloarculasp, IRU1。”危险材料杂志第188卷第1期。1-3, pp. 26-28, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
35. B. Nicolaus, L. Lama, E. Esposito等人，”HaloarculaSPP能够生物合成外聚合物和内聚合物。”工业微生物学与生物技术杂志第23卷，没有。6，第489-496页，1999年。视图:出版商的网站|谷歌学者
36. O. Danis, A. Ogan, P. Tatlican等人，“从嗜盐古菌制备聚(3-羟基丁酸酯-co-羟基戊酸酯)薄膜及其在药物输送中的潜在用途，”极端微生物第19卷，no。2, pp. 515-524, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
37. R. Mahansaria, A. Dhara, A. Saha, S. Haldar和J. Mukherjee，“由Natrinema ajinwuensis(同义词)≡Natrinema altunense应变RM-G10。”国际生物大分子杂志第107卷，no。B部分，1480-1490页，2018年。视图:出版商的网站|谷歌学者

betway赞助

betway赞助版权所有©2021 Fatma Karray等人。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可，允许不受限制地在任何媒介上使用、分发和复制，前提是正确引用原作品。