尿路上皮肿瘤CK20和CK5/6免疫组化染色研究

摘要

细胞角蛋白属于中间纤维家族。它们在上皮细胞中以高度特异性的方式表达，在细胞的完整性和机械稳定性中起着至关重要的作用。几种类型的细胞角蛋白已被描述在正常和肿瘤尿路上皮。在尿路上皮肿瘤的情况下，CK20和CK5/6的表达已在几项研究中显示具有诊断和预后意义。因此，低级别尿路上皮癌的CK表达仅限于伞状细胞，而高级别肿瘤通常在除基底层外的整个尿路上皮厚度均有表达。而CK5/6在所有低级别和部分高级别尿路上皮癌基底细胞中均有表达。弥漫性CK20染色伴ck5 /6阳性基底层缺失通常与侵袭性临床行为相关。对这些细胞角蛋白进行切片双染色可以促进正确的解释和相关性。

1.简介

细胞角蛋白属于所有细胞中都存在的10 nm中间纤维细胞骨架家族。中间纤维蛋白以高度细胞类型特异性的方式表达，因此角蛋白代表了上皮细胞中存在的典型中间纤维类型。这些细丝是一组复杂的不溶于水的多肽，大小从40000到68000个Mr。在上皮细胞中，角蛋白丝可能被捆扎成张力丝，编织成细胞核，横跨细胞质，并附着在典型的上皮细胞-细胞连接的细胞质斑块上，即桥粒。因此，角蛋白在单个上皮细胞和上皮组织的完整性和机械稳定性中都起着重要的功能作用，是从单个细胞到组织形成的稳定连续体的固有组成部分[1- - - - - -6］．

角蛋白蛋白可分为小的酸性I型角蛋白和大的碱性至中性II型角蛋白。角蛋白的一个独特性质是，与其他中间纤维蛋白相比，它们只能通过I型和II型分子(1:1)的成对形成来构成其丝状阶段。在人类角蛋白中，最近的共识命名包括I型角蛋白K9-K10, K12-K28和K31-K40和II型角蛋白K1-K8和K71-K86。在人类基因组中，角蛋白基因聚集在两个不同的染色体位点:染色体17q21.2 (I型角蛋白，K18除外)和染色体12q13.13 (II型角蛋白和K18)。据认为，这两个细胞角蛋白亚家族是通过CK8和CK18的基因复制和随后的分化而产生的[2- - - - - -6］．

每种类型的上皮细胞表达两到十种细胞角蛋白同型的特征组合。因此，在体内或体外的正常上皮细胞可以根据它们的细胞角蛋白同型特征进行鉴定。不同正常上皮细胞类型的特征性细胞角蛋白谱在肿瘤转化后倾向于保留，这一特征可用于肿瘤诊断。然而，上皮细胞角蛋白谱也可能反映功能分化，而不是组织起源。因此，化生细胞表达其形态的细胞角蛋白谱特征，而不是其正常对应物[1］．

2.胚胎发育过程中尿路细胞角蛋白的表达

细胞角蛋白是胚胎发生过程中出现的第一个中间纤维类型，在胎儿发育的某个阶段的所有细胞都是细胞角蛋白阳性。第一个表达的细胞角蛋白同型是CK8 + CK18对。在胚胎上皮-间充质转化过程中，细胞角蛋白的表达被某些细胞系丢失，这些细胞系要么保持细胞角蛋白阴性，发展成结缔组织，要么后来重新表达次级上皮细胞角蛋白[1］．膀胱的胚胎发育是从泄殖腔开始的，泄殖腔是一种后肠结构，是胃肠和排尿废物的常见腔室。在发育的第4 - 7周，泄殖腔被尿直肠隔分成两个部分:肛肠后管和泌尿生殖窦前。泌尿生殖窦的上部形成膀胱[7］．

在膀胱早期发育过程中，内衬上皮逐渐由单纯的内胚层上皮转变为多层的尿路上皮内衬。作为胃肠道内胚层的模式，正在发育的尿路上皮最初在各层均普遍呈CK20阳性。在随后的尿路上皮成熟过程中，形成基底层，可通过CK5和CK13阳性表现出来。尿路上皮的进一步成熟包括除伞状细胞外几乎所有层的CK20缺失。因此，尿路上皮的发育似乎有三个不同的阶段。第一阶段的特征是各层基底细胞和CK20表达的缺失。第二阶段由基底层的出现决定，但CK20的表达模式仍然是弥漫性的。在第三阶段和最后阶段，CK20表达模式成熟，其特征是CK20仅在伞层。基底层发育良好，可通过CK5/6或CK13免疫染色显示[8，9］．

3.正常尿路上皮细胞角蛋白表达

膀胱由尿路上皮排列，其功能是作为尿液的屏障，并适应腔内容量的变化。尿路上皮为多层上皮，有三个细胞区:(1)基底细胞层，由与基底膜平面接触并垂直于基底膜平面的细胞组成;(2)由2 - 5层细胞组成的中间细胞区;(3)腔内或浅表细胞层，由晚期中间细胞和大的、常为双核的“伞形”细胞组成，其顶端表面面向腔内。伞状细胞的特征是闭塞带类型的细胞连接，并在顶端细胞膜和细胞内梭状泡内存在不对称单位膜的特化斑块[10］．这种现象是由于细胞膜内存在大量的尿凝蛋白[11］．

在正常成人尿路上皮中，CK7、CK8、CK18和CK19在所有尿路上皮细胞层中表达，CK5在基性表达，CK20与伞状细胞相关(图1）.

一些正常标本的中间细胞层也可能存在少量ck20阳性细胞[1］．

4.细胞角蛋白在乳头状尿路上皮瘤中的表达

尿路上皮细胞的肿瘤转化引起尿路上皮癌，这是大多数国家最常见的膀胱癌。许多患者表现为非侵袭性(pTa)或仅侵犯固有层(pT1)的浅表肿瘤。虽然复发很常见(50-70%)，但通常可以通过局部治疗控制。然而，10-15%的浅表疾病患者最终发展为肌肉侵袭性和转移性疾病。以分化丧失为特征的分级增加和发育不良改变的存在都是预后不良的决定因素。此外，一些尿路上皮癌显示基底/鳞状分化，这与较差的预后有关[12- - - - - -14］．

细胞角蛋白20和CK5/6的免疫组化染色模式因尿路上皮肿瘤的类型和性质而异。例如，恶性潜能有限的乳头状尿路上皮肿瘤(PUNLMP)和低级别乳头状癌显示CK20局限于伞状细胞，CK5/6染色局限于基底层，与这些角蛋白在正常尿路上皮中的分布相同(图2）.

另一方面，高级别尿路上皮癌往往对CK20具有弥漫性免疫反应，包括伞状细胞和中间层。此外，基底层可通过CK5/6阳性表达(图5 - 1)3.）.

另一方面，在高级别尿路上皮乳头状癌中，CK20在整个尿路上皮厚度中表达，基底层缺失，CK5/6染色阴性(图4）.

这种无基底层染色的弥漫全层CK20染色模式也是固有层或肌肉侵犯的高级别尿路上皮癌的特征[15- - - - - -18)(图5）.

有研究表明，CK20染色模式在诊断尿路上皮癌时是一种有用的形态学辅助。也有研究表明，CK20的表达可以预测低级别尿路上皮肿瘤的恶性潜能，因此，CK20可以用于确定这些肿瘤患者的治疗策略。大多数纯尿路上皮癌保留了CK20的表达，在一些分化良好的乳头状肿瘤中保留了正常的浅表定位模式，或在所有细胞层中表现出不均匀或均匀的阳性反应。部分鳞状分化癌显示CK20表达减少。然而，这些区域对CK5/6反应积极(图6(一)而且6 (b))，其分布模式与基底层的基本分布不同[19- - - - - -22］．

在某些病例中，整个癌可表现为基底鳞特征。这些病例对CK5/6表现出强烈的反应性，而CK20则表现出很少或没有阳性反应6 (c)而且6 (d)）.

最近发表的两项研究为CK20和CK5/6的各种免疫染色模式的临床意义提供了额外的证据。在其中一项研究中，研究人员分析了222例接受根治性肾输尿管切除术的上尿路上皮癌患者的肿瘤样本，以检测7种基础/腔内免疫组织化学标记物(CK5、EGFR、CD44、CK20、p63、GATA3和FOXA)的表达。通过CK5和CK20，他们定义了四种上路尿路上皮癌亚型:(我)仅CK20阳性和CK5阴性(CK20+/CK5−)(2)仅CK5阳性和CK20阴性(CK20−/CK5+)(3)两项指标均阳性(CK20+/CK5+)(iv)两个标记均为阴性(CK20−/CK5−)

在多变量Cox 's回归分析中，CK20+/CK5−亚型是一个独立的阴性预后标志物，癌症特异性死亡风险增加3.83倍 与其他三种亚型相比[23］．

在第二项研究中，CK5/6和CK20的免疫组化染色与早期尿路上皮癌的预后相关。此外，我们还研究了CK5/6和CK20表达水平分类的非肌肉浸润性乳头状高级别上路尿路上皮癌(UTUC)亚组的基因表达谱，并与临床结果相关。这些亚组包括CK5/6-high/CK20-low、CK5/6-high/CK20-high和CK5/6-low/CK20-high。后者以CK5/6低表达、CK20高表达为特征，预示着非肌肉浸润性乳头状高级别尿路上皮癌预后较差。转录分析显示了308个不同亚组的差异表达基因。对这些基因的功能分析发现，与其他亚组相比，细胞粘附是该亚组中差异丰富的常见过程，这可以解释其高风险表型。晚期细胞周期/增殖特征也在该亚组中富集[24］．因此，在缺乏可证明的基底层的情况下，以CK20弥漫性染色为特征的尿路上皮肿瘤似乎是最具侵略性的乳头状尿路上皮癌亚型。

细胞角蛋白5/6存在于正常的角化表皮和鳞状粘膜上皮中，也存在于乳房、唾液腺和前列腺的基底细胞或肌上皮细胞中[25- - - - - -28］．在前列腺和乳腺活检中，CK5/6修饰基底细胞层，因此在诊断浸润性癌时有用，后者缺乏基底细胞。由于尿路上皮的结构不同于前列腺或乳腺导管上皮的结构，因此基底细胞的存在与否不能用来区分尿路上皮肿瘤的良恶性。然而，在尿路上皮肿瘤中基底细胞的缺失可能提示预后不良。因此，一个保留基底层的高级别尿路上皮癌与另一个失去基底层的高级别肿瘤相比，可能表现得不那么严重。在我们的实验室中，我们对这些细胞角蛋白使用双重染色，这对正确解释这些染色非常有帮助。

尿路上皮原位癌也可见类似的染色模式[29，30.］．这些病变通常对CK20有强烈反应，可能保留也可能不保留ck5 /6阳性基底细胞层。CK20阳性染色也可识别附着型尿路上皮原位癌和页状癌细胞扩展(图7）.

在少数病例中，原位癌可能对CK5/6有反应，表明基底样分化[31］．

5.胚胎学尿路上皮分化与去分化尿路上皮瘤

细胞角蛋白同型表达模式与上皮分化密切相关，提示细胞角蛋白对上皮组织结构和/或功能至关重要。然而，很难确定细胞角蛋白同型的个体或组合对正常和肿瘤上皮细胞表型和行为的确切贡献。因此，提示尿路上皮癌复发高风险的CK20免疫定位变化可能反映了癌变过程中与尿路上皮分化程序失调相关的继发变化，而不是表明CK20直接参与。可以推测，CK20和CK5/6在各种尿路上皮癌中的表达模式倾向于模拟尿路上皮的胚胎发育和分化阶段。因此，以CK20弥漫性表达而无基底层为特征的高级别尿路上皮癌(有或无浸润)可能代表尿路上皮分化的早期阶段，在尿生殖窦与泄殖腔分离后[7- - - - - -9］．在这一发育阶段，尿路上皮表现为弥漫性CK20染色，但缺乏基底层。在一些高级别尿路上皮癌中，CK20染色均匀，但CK5/6的表达也显示有一个形态良好的基底层。这可能相当于胚胎尿路上皮分化的中间阶段。分化良好的尿路上皮癌的特征是CK20的成熟表达模式，其表达主要局限于伞状细胞，同时也存在明确的基底细胞层CK5/6免疫反应(图)8而且9）.

这种模式可能相当于宫内尿路上皮发育和成熟的最后阶段。

总之，CK20和CK5/6的尿路上皮癌免疫组化染色可以为尿路上皮癌的性质及其临床行为提供有用的信息。

数据可用性

本研究没有数据支持。

利益冲突

作者声明，他们没有资金或利益冲突需要披露。

致谢

作者在此感谢我们免疫组化实验室以下主管和技术人员在执行双色免疫组化染色方面提供的宝贵帮助和技术专长:Rajaa Al Abdulla女士，主管;Huda Ahmed Al Hijji女士，主管;高级技术专家Zuhoor Ali女士。

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