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Vincent T. Ramaekers, Jeffrey M. Sequeira, Beat Thöny, Edward V. Quadros, "重度自闭症儿童的氧化应激、叶酸受体自身免疫和脑脊液的发现”,自闭症研究与治疗, 卷。2020, 文章的ID9095284, 14 页面, 2020. https://doi.org/10.1155/2020/9095284
重度自闭症儿童的氧化应激、叶酸受体自身免疫和脑脊液的发现
摘要
背景.生物标志物如氧化应激,叶酸受体α (FRα)自身免疫,以及异常的脑血清素周转在自闭症中很常见。方法.氧化应激生物标记物与亲和抗氧化剂在严重形式的婴儿自闭症(n= 38)和对照(n= 24)。儿童和父母重复测试血清FR自身抗体,脊髓液多巴胺和血清素代谢物,翼蛋白和N5-methyltetrahydrofolate (MTHF)。统计分析评估变量之间的相关性。遗传分析包括编码突触血清素再摄取蛋白的SLC6A4和SLC29A4基因。结果.与对照组相比,自闭症组的淋巴细胞中氧化DNA损伤、血浆铜蓝蛋白和铜水平显著增加,铜/锌比、硫醇蛋白和超氧化物歧化酶(SOD)活性较高。维生素C水平显著降低。在大多数自闭症患者中,维生素A(64%)和D(70%)水平较低。68%的自闭症儿童、41%的父母和3.3%的对照组儿童及其父母的血清FR自身抗体在5-7周内波动。脑脊液显示血清素5-羟吲哚乙酸(5HIAA)代谢物降低13例(34%),5HIAA与HVA(多巴胺代谢物)比值降低5例(13%),5HIAA和MTHF低2例(5%),MTHF低8例(21%)。已知的SLC6A4突变仅在1名CSF 5HIAA低的自闭症儿童中发现,而在同卵双胞胎中发现了一种新的SLC29A4突变。只有26%的受试者脑脊液MTHF水平低可以由波动的FR抗体滴度来解释。两种或两种以上异常的促氧化和/或抗氧化因子倾向于低脑脊液血清素代谢产物。三名CSF 5HIAA低和氧化应激升高的自闭症儿童接受抗氧化剂补充,随后CSF 5HIAA恢复正常。结论.在自闭症中,我们发现了FR自身免疫和/或氧化应激的不同组合,两者都可以治疗。父母和出生后的FR自身抗体倾向于阻断叶酸进入大脑,影响叶酸治疗恢复的叶酸依赖通路,而异常的氧化还原状态倾向于诱导血清素周转减少,通过抗氧化治疗纠正。试验注册.该病例对照研究于2008年由Liège大学的IRB批准。B70720083916).把总结.患有严重婴儿自闭症的儿童通常有血清叶酸受体自身抗体,这种抗体会阻止必需维生素叶酸通过血脑屏障进入大脑。父母通常是这些血清叶酸受体自身抗体的无症状携带者,母亲可以阻止叶酸通过胎盘到达未出生的孩子。在儿童宫内发育期间叶酸缺乏可能导致神经管缺陷和自闭症。氧化应激是一种存在毒性氧衍生物升高的情况,这是由于这些毒性活性氧衍生物的形成和保护之间的不平衡造成的。研究发现,自闭症儿童存在氧化应激,这些活性氧衍生物会对DNA造成损伤,从而改变DNA功能和基因表达的调节。此外,过量的这些有毒氧衍生物可能会破坏大脑中产生神经信使血清素的酶,在大约1/3的自闭症儿童中减少。必威2490测试自闭症儿童的氧化应激及其来源,以及测试血清叶酸受体自身抗体,可以为更有效的治疗开辟新的途径。
1.简介
对自闭症双胞胎的研究表明遗传和环境因素都有影响。然而,除了罕见的单基因、感染、中毒或环境原因外,还没有确定导致自闭症谱系障碍的共同最终途径[1,2].表观遗传因素的可能归因来自死后脑组织的发现,支持microRNA失调在自闭症病理生理学中的作用[3.].最近的研究已经确定了自闭症患者唾液microRNA谱图水平的改变,将自闭症谱系障碍与正常发育和非自闭症发育迟缓的同龄人区分开来[4].
在产前期间,为防止神经管缺陷(NTDs)和自闭症谱系障碍(ASDs),必须向发育中的胚胎提供足够的叶酸[5- - - - - -7].尽管妊娠期间母体叶酸状态正常,但母体血清FRα自身抗体会损害叶酸通过胎盘,使胎儿易患NTD或自闭症[8,9].母亲FR的患病率α自闭症家族的自身抗体在26-59%之间变化,而父亲FR的患病率α抗体在18-69%之间变化[9,10].产后FR的获得α自身抗体可引起婴儿起病性脑叶酸缺乏综合征和自闭症谱系障碍[11,12].FR的患病率α自闭症儿童的自身抗体在47-76%之间变化[9,10].FR的患病率α在西班牙,健康成年女性的抗体估计为4-7%,爱尔兰为9-13%,美国为10-15%。这种抗体低滴度在一小部分成年人群中似乎是非病理性的[9].
脑叶酸缺乏症(CFD)被定义为任何脑脊液氮含量低的神经精神疾病5-甲基四氢叶酸(MTHF),其中FRα在大多数病例中发现了抗体,而FOLR1基因突变或线粒体疾病仍然是罕见的替代原因[12- - - - - -15].
根据线粒体脑病、卡恩斯-塞尔综合征和阿尔珀氏病的研究结果,活性氧(ROS)和低ATP产量被怀疑降低了甲基四氢呋喃的稳定性,损害了叶酸向大脑的运输。体外研究表明,在KB细胞(普遍存在的角蛋白形成肿瘤细胞系HeLa)中,表达FRα叶酸载体(RFC1)减少,MTHF摄取在暴露于活性氧(ROS)后受损。这可以通过自由基清除剂抗坏血酸作为抗氧化剂来预防。16].在线粒体脑病患者中,ROS形成和抗氧化防御之间的不平衡导致氧化应激和对还原叶酸和叶酸转运蛋白的损伤[16],解释了叶酸减少的不稳定性和叶酸通过血- csf屏障转移的破坏。尽管自闭症的证据有限,但先前的研究表明,其发病机制中氧化应激的脆弱性增加,甲基化能力下降[17- - - - - -19].ROS和一氧化氮(NO)衍生的过亚硝酸盐自由基(亚硝化应激)对单碳代谢和MTHF通过胎盘和血脑屏障以及DNA损伤的不同影响由图解释1.ROS抑制蛋氨酸合酶活性和再甲基化循环。同时,ROS刺激胱胱甘肽β合酶活性,将同型半胱氨酸从蛋氨酸循环转移到转硫途径,从而增加谷胱甘肽的产生。ROS的增加有利于DNA氧化,而超氧自由基促进过亚硝酸盐的形成,随之而来的是亚硝化应激。图中描述了阻断叶酸进入中枢神经系统的后果,ROS和亚硝化应激对单碳代谢、DNA稳定性、神经递质合成和NO产生的影响1.
使用放射性血清素前体进行脑部PET扫描研究α[11C]-甲基- l-色氨酸表明与对照组相比,自闭症儿童的全脑或局部血清素水平降低[21].然而,受损的大脑血清素状态仍然是一个谜。在氨基酸前体l -色氨酸(Trp)通过血脑屏障运输并被特定的产生血清素的中缝神经元摄取后,血清素合成的第一个限速步骤由神经元酶色氨酸羟化酶2 (TPH2)介导。5-羟色氨酸(5OH-Trp)将被维生素b6依赖的芳香族氨基酸脱羧酶脱羧为5-羟色胺(5HT;5-hydroxytryptamin)。然后,5 -羟色胺通过囊泡单胺转运蛋白异构体2 (VMAT-2)的作用被包装起来。囊状5 -羟色胺在轴突末梢被释放到突触,随后在突触后5 -羟色胺受体上发挥作用。血清素通过血清素再摄取转运体(SERT)进入突触前空间,部分通过位于突触周围的神经元和胶质细胞中的另外两种血清素再摄取转运体(血浆单胺转运体(PMAT)和有机阳离子转运体(OCT))从突触间隙清除。2).
ASD的临床轶事报告、动物和遗传研究已经解开了血清素的谜团。与年龄匹配的健康对照组相比,先前对97名ASD患者进行的脊髓液研究证实,31%的患者脑脊液中血清素终代谢物5-羟吲哚乙酸(5HIAA)水平较低,21%的患者脑脊液中MTHF水平较低,而48%的所有患者脑脊液表现正常[22].一项对248名ASD患者(包括97名进行CSF分析的患者)的遗传研究发现,SLC6A4基因中有p.Gly56Ala突变,在ASD和对照组人群中,SERT蛋白的功能以相同的频率增加。相比之下,在248名ASD患者中,在SLC29A4血浆单胺转运体基因(PMAT)中检测到三种新型杂合非同义突变的流行率(3.2%),揭示了对各种底物(包括血清素、多巴胺和1-甲基-4-苯基吡啶)的再摄取活性显著降低+).然而,这些将编码PMAT的SLC29A4基因突变与ASD人群联系起来的遗传学研究并不总是与CSF 5HIAA低代谢物相一致。据推测,ASD受试者的PMAT功能障碍会提高产前血清素水平,通过血清素受体对血清素网络的发展和局部血清素合成施加负反馈抑制。
尽管已知SLC6A4基因中存在杂合p.Gly56Ala突变,在ASD和对照人群中发现,最近在小鼠模型中进行的一项研究表明,母体SLC6A4 (SERT)纯合p.Gly56Ala基因型对早期胎盘血清素水平、前脑血清素水平和神经发育有重大影响[23].
大脑低血清素和自闭症之间的联系也得到了神经元TPH2基因敲除小鼠模型的支持,该模型易于降低大脑血清素的产生[24].然而,遗传因素对ASD中血清素的影响仍然很弱。25,26].因此,缺乏维生素D会导致血清素的产生降低,大脑中血清素的再摄取和分解代谢增加。支持由于母体摄入选择性血清素再摄取抑制剂而导致后代自闭症风险增加的数据仍未确定[27].
为了解决这些尚未解决的5 -羟色胺代谢问题,这项儿童自闭症病例对照研究的目的是同时分析脑脊液神经递质、叶酸代谢物和血清FRα儿童及其父母体内的抗体,并确定氧化应激的作用与升高的促氧化剂或失败的抗氧化防御。此外,我们分析了维生素A和D的水平,因为这些维生素被认为是抗氧化剂,维生素D在维持血清素稳态和叶酸通过血脑屏障运输中发挥作用[28].本研究的数据分析检验了FR之间的假定联系α一方面,自身抗体和氧化应激使叶酸转移到大脑,另一方面,大脑神经递质代谢紊乱,特别是血清素周转紊乱(见图)2).
2.患者与方法
2.1.参与者
这项研究招募的参与者是我们自闭症诊断和治疗中心的儿童。调查包括ADI-R和ADOS测试,儿童自闭症评定量表(CARS),发育和语言评估,心理和精神评估,以及在学校或家庭情况下的观察性评估。对38名自闭症患者进行的CARS基线评估显示,34名患者中的大多数患有严重的婴儿自闭症(CARS在37 - 60之间;mean±SD: 43.76±7.11)和4例轻、中度自闭症患者(CARS在30 ~ 36.5之间)。
每位患者均有完整的病史、体格和神经系统检查、脑MRI和长时间脑电图记录。其他调查包括代谢筛选和测量尿氨基酸和有机酸、肌酸和胍乙酸排泄。基因检测包括Angelman综合征、脆性x综合征、MECP2基因突变、染色体分析和阵列CGH检测微缺失或微重复。总的来说,我们只招募了38名年龄大于3岁半的患者,在排除大脑异常、顽固性癫痫、代谢和可识别的遗传异常或综合征后,诊断为非综合征性婴儿自闭症。在自闭症组,所有父母都很健康,没有神经或精神病史。自闭症儿童的其他入选标准包括没有特殊饮食、任何药物或补充剂,最后在研究开始时没有特定的行为干预。对照组由24名年龄匹配的健康儿童和父母组成。
2.2.氧化应激、FR自身免疫和脑脊液代谢产物的病例对照研究设计
这项研究得到了大学医院Liège伦理委员会和纽约州立大学下州医疗中心的IRB的批准。患有婴儿自闭症的儿童(n= 38)和健康对照组(n至少有3年半的历史。在父母知情同意和一夜禁食后,每个自闭症儿童或健康对照组都采集了氧化应激参数和血清FR的血液样本α同时对自闭症儿童进行脊椎穿刺。对于两组,抽血测量氧化应激参数以及促氧化和抗氧化因子(见下文)。通过统计分析,将自闭症组的结果与年龄匹配的健康对照组进行比较(见下文)。对患者血清进行FR分析α-阻断和结合型自身抗体,并与健康对照组进行比较。两组患儿的父母均被要求参与血清FR检测α抗体测试。随访时,连续取样检测FRα对6名自闭症儿童,包括一对同卵双胞胎,每隔一周抽取抗体。脊髓穿刺后,我们分析了脑脊液(CSF)生物单胺代谢物、翼蛋白和MTHF。对于每个自闭症儿童,我们还测定了空腹血浆氨基酸。
2.3.氧化应激和促氧化和抗氧化生物标志物
在目前的病例对照研究中,通过测量脂质和DNA的氧化损伤以及天然促氧化剂、抗氧化剂和自由基清除剂的水平来调查氧化应激状态1).氧化应激的生物标志物是脂质过氧化物、氧化LDL和抗氧化LDL蛋白抗体,而彗星试验通过检测单/双链DNA断裂、碱不稳定位点(嘌呤/嘧啶位点)、DNA交联、碱基/碱基对损伤和淋巴细胞中的凋亡核来测量DNA损伤的百分比[29].对于抗氧化防御,我们测量了paroxonase、总谷胱甘肽和氧化谷胱甘肽、硫醇蛋白、铜蓝蛋白、载脂蛋白- b、维生素C和E、ubichinn - q10、γ -生育酚、β -胡萝卜素、抗氧化酶谷胱甘肽过氧化物酶及其辅助因子硒,以及超氧化物歧化酶及其不同的辅助因子铜、锌和锰[30.- - - - - -35].我们还测定了血清铁和铁蛋白作为抗氧化酶过氧化氢酶的辅助因子。作为公认的抗氧化剂,我们还测量了维生素A和D的水平。
对于促氧化因素,我们测量了β -胡萝卜素、铁、铜、锌、铜锌比以及锰,因为这些金属和微量元素的升高或铜/锌比的升高会促进氧化应激和Fenton反应以生成羟基自由基[36].在这种情况下,应该强调的是,一些因子如-胡萝卜素具有双重功能,在生理浓度下是抗氧化剂,但在高浓度时则变成促氧化剂[37].
对于每个孩子,还包括以下常规测量:全血细胞计数(CBC),血清和红细胞叶酸,维生素B12、肾功能、肝功能、甲状腺功能(TSH、T3和T4)、乳酸、CPK、碱性磷酸酶、钙、镁和胆固醇。血清样本用于测定抗麦胶蛋白抗体。
2.4.血清FRα自身抗体
对阻滞FR和结合FR进行分析α自身抗体在前面已经描述过。阻塞FRα血清中自身抗体表达为阻断与FR结合的放射性叶酸pmolα-抗原每毫升血清和结合FRα自身抗体表达为每ml血清中IgG抗体的pmol [38].
2.5.CSF分析
空腹过夜后,通过腰椎穿刺采集脑脊液样本,测量包括细胞、蛋白质和葡萄糖,中间代谢产物(l-多巴、3- o -甲基多巴和5oh -色氨酸)和多巴胺和血清素的最终代谢产物,即高香草酸(HVA)和5-羟基吲哚乙酸(5HIAA),蝶呤代谢产物新蝶呤和生物蝶呤,以及N5-methyltetrahydrofolate (MTHF)。计算HVA/5HIAA比值。用高效液相色谱法测定了生物单胺代谢产物。用高效液相色谱法测定二氧化锰氧化后的总新蝶呤和生物蝶呤(代表四氢和二氢生物蝶呤和生物蝶呤的总和)。采用电化学高效液相色谱法测定甲基四氢大麻酚。分离是在5上实现的μSperisorb ODS-1 (250 × 4.6 mm)分析柱(Stagroma AG,瑞士),使用50 mm醋酸钠在22% (v/v)甲醇中,pH 4.5作为流动相。流速为1 ml/min,分析单元(型号5011,ESA, Bedford, MA, USA)调整到+0.20 V (ESA库仑化学型号5100A, ESA),响应时间为2 s。[39- - - - - -41].
CSF数据与先前在大学儿童医院收集的按不同年龄组分类的健康儿童样本进行比较,Zürich [39- - - - - -41].由于自闭症的重点是血清素周转减少,我们对编码SERT和PMAT蛋白的SLC6A4和SLC29A4基因进行了适当的测试,如前面所述[22].
对于一组患有氧化应激和脑脊液中血清素代谢产物低的儿童,按照先前研究中概述的抗氧化治疗和补充治疗,随访其生化和临床演变2经伦理委员会批准和知情同意后[20.].
2.6.统计分析
用未配对的方法比较了自闭症组和年龄匹配的健康对照组之间测量的氧化应激生物标志物和前抗氧化剂t以及。
在自闭症组中,统计分析评估了一方面脑脊液结果与另一方面氧化应激的生物标志物,每一个pro和抗氧化参数,FR自身抗体滴度,以及常规参数铁,铁蛋白和维生素A和D之间的相关系数。
此外,统计分析评估了每个自闭症患者与每个氧化应激生物标志物相比存在的异常的促氧化参数和抗氧化参数的累积数量,也评估了MTHF和生物单胺代谢物HVA和5HIAA的正常和异常脑脊液结果的分布。
进一步的统计分析使用卡方检验来验证由我们的发现引起的不同假设。
3.结果
3.1.氧化应激生物标记物和亲和抗氧化因子
38名儿童自闭症患者参与了这项研究。年龄7.25±3.9岁(平均±标准差),年龄3.6 ~ 18岁。男女性别比为4.4:1。24个年龄匹配的对照组,与38名自闭症患者相比,性别分布是平等的,他们的年龄为8.7±3.2岁(4.4-16岁),没有显著差异。
表格1显示婴儿自闭症组之间氧化应激参数的结果(n= 38),而健康对照组(n= 24)。统计学检验为未配对t以及。与对照组相比,淋巴细胞中的彗星试验是氧化应激的唯一生物标志物,显示氧化DNA显著增加,而其他氧化应激参数,即血脂过氧化物、氧化低密度脂蛋白(LDLox)和抗氧化低密度脂蛋白抗体,在自闭症组和健康对照组之间没有差异。虽然自闭症组的锌值保持在正常范围内,但与对照组相比,自闭症组的铜和铜蓝蛋白值明显更高。因此,自闭症组的铜/锌比例显著升高。在所有测量的抗氧化参数中,与对照组相比,自闭症组的维生素C值显著降低。虽然总谷胱甘肽和氧化谷胱甘肽水平没有差异,但总硫醇-蛋白质水平在自闭症组明显较高。此外,自闭症患者的超氧化物歧化酶活性显著升高。虽然在这项研究中,假定的抗氧化剂维生素A和D没有被考虑在内,但自闭症组中假定的抗氧化剂维生素A(64%)和维生素D(70%)的值都很低。其他参数显示自闭症和对照组之间没有统计学差异。
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控件的参考范围显示健康控件的上限和下限。的决定使用未配对学生的值t-test可以在最后一列找到。 |
尽管在整个自闭症患者组与健康对照组之间,所有测量参数(氧化应激生物标志物和抗氧化和促氧化因子)的每一项都没有一致的统计学差异,但38名自闭症儿童中有25名(66%)有一项或两项氧化应激生物标志物升高(12名自闭症患者中淋巴细胞中的氧化DNA高于健康对照组参考范围的上限,2例患者脂质过氧化物升高,7例患者高氧化LDL, 11例患者抗氧化LDL抗体高)。在这25个有一个或两个氧化应激生物标志物升高的自闭症患者中,我们发现有1到4个亲抗氧化参数存在于正常参考范围之外,定义为高于健康对照组范围的上限或低于下限的值(n= 24)。然而,在25名氧化应激生物标志物升高的自闭症儿童中,有5名(2名患者氧化DNA损伤,1名患者氧化DNA和氧化LDL结合,1名患者氧化DNA和抗氧化LDL抗体结合,1名患者氧化LDL和抗LDL抗体结合升高),所有测定的促氧化因子和抗氧化因子均正常(数据未显示)。在这后5例患者中,其他易导致氧化应激的促氧化因素,如重金属中毒(铝、铅和汞)、锰增加、铜/锌比或β -胡萝卜素被排除在外。
然而,在38名自闭症患者中,异常的促氧化和/或抗氧化因子随机分布,任何特定因子与不同的氧化应激生物标志物之间没有明确的关联。38例自闭症患者中有8例具有正常的促氧化和/或抗氧化参数,而9例患者只有一项促氧化或抗氧化参数异常,9例患者有两项或两项异常,7例患者有三项异常,最后5例患者有四项促氧化和/或抗氧化参数异常。在所有30例抗氧化剂前期和/或前期异常的自闭症患者中,促氧化因子包括硒升高(6例)和锌升高(5例),铜/锌比值升高(4例),β -胡萝卜素升高(1例)。抗氧化因子频率降低的依次为铁低(9例)、载脂蛋白b降低(7例)、总谷胱甘肽低(6例)、γ -生育酚低(5例)、锰低(5例)、血浆和红细胞谷胱甘肽过氧化物酶活性降低(5例)、硒低(4例)、维生素C低(4例)、铁蛋白低(3例)、Q10低(2例)、β -胡萝卜素低(2例)、降低维生素E水平(1例)。
我们比较了自闭症组的每个氧化应激生物标志物作为异常抗氧化剂的总数的函数与健康对照组获得的氧化应激生物标志物值。与对照组相比,自闭症儿童的彗星检测(氧化DNA)显著增加,不仅是在具有正常的亲抗氧化剂的亚组,而且在每个亚组的自闭症儿童中,只有1个异常的亲抗氧化参数或2个、3个或4个同时测量异常的亲抗氧化参数的组合。尽管数量太少,无法达到统计学意义,但在正常范围内氧化DNA的自闭症患者亚组与高于健康对照范围上限的氧化DNA升高的自闭症患者亚组之间的比较表明,氧化DNA升高的自闭症患者亚组抗氧化酶辅因子锰和硒、总谷胱甘肽、γ -生育酚和维生素E的值往往较低。
氧化生物标志物脂质过氧化物在整个自闭症组与健康对照组之间没有显着差异。在自闭症组中,只有两名患者的脂质过氧化物值高于健康控制范围的上限。然而,亚组自闭症患者的脂质过氧化物水平有2个或2个以上的抗氧化价值异常(平均值±标准差:774±349)μM;n= 21)的脂质过氧化物显著高于具有正常或只有一项抗氧化参数异常的自闭症患者亚组(平均值±标准差:549±290)μM;n= 17;t= 2.12; ).与对照组相比,在亲抗氧化参数正常或只有一个异常值的自闭症亚组中,脂质过氧化物水平没有显示出统计学差异。然而,自闭症亚组的脂质过氧化物水平(n(平均±标准差:888±335)μM)显著高于健康对照组(n= 24;mean±SD: 609±219μM;t= 3; ).
其他氧化应激生物标志物氧化LDL和抗氧化LDL抗体在自闭症组和健康对照组之间没有显示出统计学上的显著差异。在自闭症组中,后者氧化应激生物标志物没有显著变化,作为异常的亲和抗氧化参数的累积数量的函数。
3.2.FRα自身抗体
与FR相比α阻断型抗体仅在1/30的对照组中存在,这些抗体在26/38的自闭症患者中存在(68%)(卡方检验为30.12 ).在最初的测试中,两名自闭症患者的FR检测呈阴性α后续检测的自身抗体。在每隔1周采集血清样本的6名患者中,FR波动α在两名患者中发现抗体滴度从无法检测到的水平到高滴度不等,而在四名患者中,包括一对同卵双胞胎,FR抗体在五周内出现了一次小峰值(图3.).在38名自闭症儿童中,有26名儿童的FR检测呈阳性α阻滞型自身抗体(所有38例患者的平均±SD: 0.59±1.17 pmol FRα抗原阻断/ml血清)同时伴有FRα17例受试者中有6例存在结合型自身抗体(平均±标准差:0.30±0.51 pmol IgG/ml血清)。只有1名自闭症儿童FRα在没有FR的情况下,可以检测到结合类型的自身抗体α阻断型抗体。在38个家庭中的29个家庭中,有FR数据可用α在孩子和父母双方的抗体(表2).在这组29个科中,FRα阻断型抗体(mean±SD: 0.62±0.63 pmol FRα在同时存在FR的29个家庭(69%)的20名儿童中,抗原阻断/ml血清)呈阳性α15个被试个体中有5个存在结合型抗体(mean±SD: 0.73±0.61 pmol IgG/ml血清),29个家庭中只有1个儿童有FRα结合型抗体,但没有阻断FRα抗体。对来自这29个家庭的自闭症儿童的父母进行的测试显示,29个家庭中有12个父母(41%)检测呈阳性,包括母亲(5/29)、父亲(3/29)或父母双方(4/29)。相比之下,在对照组30名健康的非自闭症儿童中,我们仅在1名儿童及其父母中检测到FR抗体(3.3%)。统计分析表明与亲代FR高度相关α自闭症组的抗体(卡方检验为14.26 ).
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在29名自闭症儿童中,他们的父母也接受了测试,其中20人患有FR阻断α与FR结合的抗体α只有5名儿童出现抗体。括号中的值(mean±SE: 0.62±0.63)是指阻塞FRα抗体滴度在p鼹鼠FRα阻塞/毫升血清。1例患儿仅有FRα发现了结合型抗体。 |
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F代表甲基四氢叶酸(MTHF)。 |
3.3.脊髓液发现
10/38例(27%)患者脑脊液结果正常,28例(73%)患者脑脊液结果异常,见表3..在13/38例患者(34%)中,脊髓液中5HIAA水平降低。虽然其他5例患者(13%)5HIAA值仍在正常范围内,但与HVA值相比,HVA/5HIAA比值高于3.5 (HVA/5HIAA比值正常范围为1.5-3.5),其水平仍相对下降。在2例患者(5%)中,5HIAA和MTHF浓度均降低,而在8例患者(21%)中,仅脑脊液MTHF水平降低。
考虑到是否存在氧化应激和FRα自身抗体,可以区分四组不同的患者。18例患者同时出现氧化应激和FR自身抗体升高,导致8例患者5HIAA低,3例患者CSF MTHF低,7例患者结果正常。在另外7例患者中,只有氧化应激的证据,并伴有低CSF MTHF(1例),低MTHF和5HIAA(1例),5例患者的5HIAA水平下降或相对较低。FRα6例患者无氧化应激的自身免疫与3例患者CSF MTHF低、2例患者5HIAA低或1例患者正常相关。FR缺失7例α除2例脑脊液表现正常的患者外,其余患者均未发现自身抗体和氧化应激生物标志物升高,脑脊液代谢物异常。在几例对氧化应激生物标志物进行随访的患者中,我们注意到这些生物标志物以及亲和抗氧化参数的波动。2例CSF 5HIAA低的患者空腹血浆氨基酸Trp值较低,其余患者的Trp值保持在正常范围内。
无异常氧化还原状态或抗氧化剂的平均1个异常值与脑脊液正常(38-40%)、低脑脊液MTHF(30%)、低脑脊液5HIAA(20-23%)或5HIAA和MTHF联合降低(7-10%)相关。两个或两个以上异常的促氧化和/或抗氧化参数的平均值往往与CSF 5HIAA值低的儿童患病率较高相关(图4).统计分析证实,与氧化还原状态正常或只有1个抗氧化参数异常的儿童组相比,两个或两个以上抗氧化参数异常的儿童CSF 5HIAA低水平的比例显著更高(卡方检验为4.55 ).
进一步的统计分析没有发现脑脊液代谢物的测量值与氧化应激生物标志物、亲和抗氧化价值、血清和红细胞叶酸、铁和铁蛋白、维生素A和D以及血清FR自身抗体滴度之间的任何其他相关性。此外,在测定的FR滴度之间没有发现相关性α自身抗体和氧化应激生物标志物,亲和抗氧化参数,维生素A和D。
3.4.基因的发现
在患有严重自闭症的同卵双胞胎中,CSF检查结果正常的近亲的基因检测显示存在杂合子SLC29A4基因突变(c.412G>导致p.Ala138Thr改变的突变),编码质膜单胺转运蛋白(PMAT)的功能丧失。PMAT突变与自闭症的相关性之前由我们的小组报道[22].在一名CSF 5HIAA低的患者中,常见的杂合子SLC6A4检测到编码血清素再摄取转运蛋白(SERT)的Gly56Ala基因突变。正如先前在另一位患者中报道的那样,这导致了功能的增加[42].杂合SERT突变在自闭症和健康对照组中发现的频率相同。在另一位脑脊液中5HIAA水平低的患者中发现了2q22.2-q23.3微重复,文献中已描述该微重复与发育迟缓和自闭症有关[43].早前描述的Xp22.31微重复在一名HVA/5HIAA比值增加的患者中发现,其他患者也有报道[44].在一位脑脊液数据正常的患者中,我们发现了最近报道的15q11.2微缺失[45].
3.5.抗氧化剂补充对脑脊液异常的影响
经鉴定,3例患者脑脊液5HIAA和氧化应激水平低,其中2例发生FRα抗体和抗氧化剂补充剂分别在8个月(患者1和2)或24个月(患者3)期间使用。这3例患者的脊柱穿刺随访显示先前较低的5HIAA值已恢复正常4).最小的3岁半自闭症儿童血清FR阳性α低滴度的自身抗体在母亲中也存在,但在父亲中不存在。氧化应激生物标志物显示1283时脂质过氧化物增加μM(对照组均值±SD: 609±219;范围:183 - 1095μM)与低血清载脂蛋白b (0.38 g/L)(对照组范围:0.60-1.40)、低维生素A和维生素E以及低谷胱甘肽、硒和锌有关。脑脊液显示5HIAA在104 nM处较低,HVA值正常,HVA/5HIAA比值升高为5.4(正常为1.5-3.5),MTHF和翼蛋白的检测结果正常。在8个月的时间里,每天补充维生素C、维生素E、维生素A、硒和硫酸锌,10个月后脑脊液检测结果正常。孩子的非语言交流能力和社会交往能力都有所提高。他的CARS基线评分与严重自闭症(CARS 42)相一致,在8个月的补充后,他的CARS下降到34,反映了中度自闭症。第二个孩子是4岁半,没有血清FRα抗体,而他的母亲FR检测呈阳性α抗体。氧化应激包括1790时脂质过氧化物增加μM(对照组均值±SD: 609±219;范围:183 - 1095μM)归因于低辅酶Q10,铜升高,铜/锌比增加到2.34(正常范围:0.70-1.66),低维生素A,低正常硒,硒依赖的谷胱甘肽过氧化物酶活性降低。脑脊液在81 nM处显示5HIAA减少(正常范围:105-299),HVA正常,HVA/5HIAA比值在4.2处增加(正常范围:1.5-3.5)。8个月期间每天补充辅酶Q10、硒和硫酸锌可使脂质过氧化物达到正常水平945μM和正常CSF 5HIAA水平。临床改善包括改善语言和非语言沟通,社会互动的第一个迹象,焦虑的消失,和更好的注意力。然而,他的CARS底线45.5分只略微下降到43.5分。第三例患者在调查时为17岁,FR检测呈阳性α抗体,父母检测均为阴性。氧化应激生物标志物显示氧化DNA增加29%(对照组平均±SD: 14.9±3.9;范围:10.2-21.5)归因于低血清锰、辅酶Q10和铁蛋白值。血浆l -色氨酸在15时较低μM(正常范围:27-75)。脑脊液分析显示MTHF正常时5HIAA和HVA值降低。在2年内接受铁、维生素C、维生素E和Q10补充后,2年半后重复CSF分析的结果显示CSF 5HIAA和HVA水平升高并恢复正常。然而,自闭症的严重程度没有显著变化,这反映出临床的改善微乎其微。患者年龄较大(17岁)可能是解释脑脊液恢复正常后临床反应不佳的一个消极因素。
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Ratio表示HVA/5HIAA的比值,正常范围为1.5-3.5。“↑”表示价值上升,“↓”表示价值下降。 |
4.讨论
这项研究表明,氧化应激和FRα自身免疫是两个独立的参数,能够影响DNA完整性、脑神经递质和叶酸依赖的单碳代谢,破坏表观遗传编程。因此,不仅治疗FRα自身免疫必须考虑在内[13],但也应该考虑采取特定的干预措施来中和丰富的活性氧(ROS),这可能会在不同水平上扰乱叶酸稳态、血清素周转、中间脑代谢、DNA完整性和表观遗传学。图中总结了氧化或亚硝化应激扰乱中间代谢、叶酸转运和遗传完整性的多个点1.最近一项针对自闭症的治疗试验证实,一种旨在中和氧化应激和缓解FR的联合治疗方法对结果有积极影响α自身免疫(45].
在以前的在体外研究中,我们发现超氧阴离子的生成在体外可在一小时内分解75%的甲基四氢大麻酚,这可被自由基清除剂抗坏血酸所阻止[16].在培养中暴露于超氧阴离子后,表达FR的KB细胞中叶酸的掺入减少α和RFC1蛋白。因此,胎盘和脉络膜丛的MTHF跨膜通道可能被ROS破坏,从而导致胎儿和大脑叶酸缺乏。ROS会与产生no的神经元发生反应,导致这些神经元内形成过氧亚硝酸盐,从而导致神经元功能障碍,最终导致细胞凋亡[46,47].
除了在活的有机体内超氧阴离子生成促进过亚硝酸盐形成(图1),额外的神经元叶酸消耗会降低嘌呤的合成,从而降低鸟苷三磷酸池作为gtp -环水解酶I的底物,gtp -环水解酶I是四氢生物蝶呤(BH4)生产的限速酶[48].由于BH4是色氨酸和酪氨酸羟化酶和NO合成酶的共同辅助因子,叶酸的消耗将限制血清素、多巴胺和NO的产生。此外,在低BH4存在的情况下,NO合酶改变其酶活性,不再生成NO,而是开始产生亚硝基过氧亚硝酸盐[49].此外,过氧亚硝酸盐通过其酶底物结合位点的巯基氧化使色氨酸和酪氨酸羟化酶失活,其中含有半胱氨酸残基[50,51].
过亚硝酸盐也亚硝基化酶蛋白酪氨酸残基,但影响很小[49].此外,氧化通过二硫化物交联诱导神经元TPH2聚集物[50].因此,ROS和过氧亚硝酸盐的生成,在叶酸消耗的促进下,减少了多巴胺、NO的产生,特别是血清素的产生,这一点在之前的研究中得到了证实,即1/3的自闭症患者血清素的产生较低[21,22].本研究的结果证实,在每个个体中累积存在多种促氧化因子和/或抗氧化缺陷会增加脑脊液5 -羟色胺代谢物5HIAA低患者的百分比(图4).进一步支持我们研究结果的证据表明,3名患有氧化应激的自闭症儿童的抗氧化剂补充剂使低水平的CSF 5HIAA恢复到正常水平。在这项研究中,两种涉及血清素再摄取蛋白的遗传缺陷仅在1名患有自闭症的患者和来自近亲父母(一线表亲)的同卵双胞胎中遇到。我们之前对ASD中编码SERT的SLC6A4和编码PMAT的SLC29A4基因突变的研究表明,正常的大脑血清素稳态依赖于这些编码血清素再摄取蛋白SERT和PMAT的基因的充分表达,它们从突触间隙中清除血清素并终止血清素信号传递[22].我们研究中的一名儿童携带了常见的SLC6A4突变,如先前报道的那样,该突变具有编码SERT功能的增益[20.].在脑脊液检查结果正常的同卵双胞胎中,我们进行了进一步的遗传分析,因为他们的父母是一线表亲,我们发现了SLC29A4突变,PMAT膜转运蛋白功能丧失。然而,在我们的研究中,SLC6A4和SLC29A4突变对整个自闭症谱系障碍人群的贡献仍然很小。25,26].然而,由于在我们的研究中维生素D缺乏的患病率很高(70%),我们没有证实血浆维生素D浓度与脑脊液5HIAA水平之间的相关性(R2= 0.0422)。在仅有两名CSF 5HIAA水平较低的患者中,我们发现血浆色氨酸水平较低,是TPH2酶的底物,这在一定程度上解释了脑血清素产生降低的原因。然而,在其他患者中,我们没有检测到低血浆色氨酸浓度。
有一些报告显示,与健康对照儿童相比,采用无酪蛋白和无麸质饮食的自闭症儿童以及没有饮食的自闭症儿童尿色氨酸排泄量较低[52].其他报告证实低血浆氨基酸前体(苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)是神经递质合成的底物[53].这些报告所证明的低色氨酸可用性可能进一步解释了已知的高发生率的喂养障碍与营养缺乏的儿童自闭症[20.].因此,应注意避免严重的喂养障碍和饮食限制,并纠正营养缺乏。
暴露于氧化应激抑制B12-依赖的蛋氨酸合酶活性,对蛋氨酸循环产生负面影响,减少s -腺苷甲硫氨酸(SAM)的产生,导致>100甲基转移反应失败。同时,氧化应激增加了胱胱硫氨酸合酶(CBS)的活性,它将同型半胱氨酸从蛋氨酸循环转移到转硫途径,以增加半胱氨酸和谷胱甘肽的合成,作为抵御氧化应激升高的适应性机制。在这种情况下,由于FR,大脑MTHF可用性较低α自身免疫进一步抑制蛋氨酸合酶活性,增强了从蛋氨酸向转硫循环的转变,导致细胞甲基化能力下调。
ROS还直接与DNA嘌呤和嘧啶成分反应,引起DNA链断裂,如淋巴细胞中氧化DNA损伤增加所反映的那样。此外,ROS可在基因启动子位点附近的甲基化CpG岛水平诱导DNA氧化损伤,导致各种突变,包括C⟶T转换、G⟶T转换和CG⟶TT串联突变。此外,ROS还能将鸟苷转化为8-氧-鸟苷,将5-甲基-胞嘧啶转化为5-羟甲基-胞嘧啶[54- - - - - -56].由于氧化应激,这些修饰的甲基-CpG序列导致甲基化CpG岛的功能丧失,作为转录抑制机制介导基因沉默的识别位点[56].因此,氧化应激不仅会引起基因序列的改变,还会导致甲基化基因失活失败的表观遗传变化。
因为FRα自身抗体阻断MTHF通过胎儿和大脑,随之而来的大脑MTHF消耗减少了足够SAM作为DNA甲基转移酶底物的产生,该底物将甲基转移到CpG启动子位点,作为基因沉默所需的识别位点。因此,结合FRα在神经元发育和分化过程中,自身免疫和氧化应激独立或合作,使控制特定基因激活和失活编排的表观遗传机制错乱[57,58].
叶酸缺乏对大脑发育的影响可能在患有叶酸缺乏症或母亲携带FR的自闭症儿童中更为突出α怀孕期间的自身抗体。这项研究不是一项治疗试验,而是一项观察性研究,解释了我们获得的不同结果。虽然对于每个参数,健康对照组的结果并不总是显示出与自闭症组相比的统计差异,但我们将健康对照组的上下限边界定义为正常范围。我们认为自闭症组的氧化应激生物标志物和抗氧化剂是不正常的,如果测量值落在正常范围之外。我们发现,对于每个自闭症患者来说,抗氧化剂可能具有正常值或1,2或更多异常值,这些异常因素的累积数量似乎对例如血清素代谢有影响。
在38名自闭症患者中,异常的促氧化和/或抗氧化因子随机分布,任何特定因子与不同的氧化应激生物标志物或脑脊液标记物之间没有明确的关联。
5.结论
在低功能自闭症的发病机制中,氧化应激和产前和/或产后叶酸受体自身抗体似乎通过影响DNA完整性、中间代谢、血清素周转和单碳转移机制发挥重要作用。这些变化可以对神经发育基因的表观遗传编程产生影响。早期发现和适当的治疗干预可以逆转核心缺陷,改善预后。
缩写
前者: | 自闭症诊断访谈-修订 |
节选: | 自闭症诊断观察时间表 |
B12最近: | B12蛋氨酸合成酶 |
黑洞4: | 四氢生物蝶呤 |
汽车: | 儿童自闭症评定量表 |
哥伦比亚广播公司: | 胱胱硫氨酸合成酶 |
CFD: | 脑叶酸缺乏症 |
囊肿: | 半胱氨酸 |
FRα: | 叶酸受体(FOLR1基因) |
GTPCHI: | GTPcyclohydrolase我 |
低密度脂蛋白: | 低密度脂蛋白 |
MBP: | 甲基- cpg结合蛋白 |
MTHF: | 5-Methyltetrahydrofolate |
MTHFR: | 亚甲基四氢叶酸还原酶 |
没有: | 一氧化氮 |
NOS1: | no合酶1(或nNOS) |
被忽视的热带病: | 神经管缺损 |
PDD-NOS: | 广泛性发育障碍——未另行说明 |
PMAT: | 质膜单胺转运体(SLC29A4基因) |
RFC1: | 减少叶酸载体-1 |
ROS: | 活性氧 |
山姆: | S-adenosylmethionine |
泽特: | 血清素再摄取转运体(SLC6A4基因) |
TH: | 酪氨酸羟化酶(TH基因) |
TPH2: | 神经元色氨酸羟化酶2 (TPH2基因) |
酪氨酸: | 酪氨酸 |
Trp: | 色氨酸。 |
数据可用性
用于支持本研究结果的数据可根据要求从通讯作者处获得。
伦理批准
该研究方案由纽约州立大学医院Liège伦理委员会和IRB批准。
同意
所有患者和志愿者都收到了关于研究目标的书面信息,并在参与前签署了知情同意书。必威2490
信息披露
所有患者都在自闭症中心(Liège)接受了全面评估。
利益冲突
两位作者(JMS和EVQ)被列为美国专利#7846672B2的发明者,该专利用于叶酸受体自身抗体的测量,已颁发给美国纽约州立大学研究基金会。对于其他作者来说,没有利益冲突或经济利益需要声明。
作者的贡献
这些研究的概念和设计由第一作者(VR)发起,与Liège大学的心血管外科实验室和毒理学实验室合作,与纽约州立大学下州医学中心医学系的免疫学/生物学实验室(EVQ和JMS)合作,并与苏黎世大学儿童医院(BT)的化学和生物化学实验室合作。
致谢
作者感谢J Pincemail博士和C Charlier教授在Liège大学医院的实验室中测量样本。本研究得到Liège大学自闭症中心的支持,部分由FNRS, Fonds National de Recherches Scientifiques(3;4.540.09。F到VR)、FIRS、科学研究投资基金(2008/85到VR)和自闭症之声(8202到EVQ)。作者还感谢Anahita Rassi女士在大学儿童医院临床化学实验室对自闭症儿童进行脑脊液分析Zürich。
补充材料
补充1:氧化应激和抗氧化剂的测定方法。补充2:根据生化异常和FR自身抗体的治疗方案。(补充材料)
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