HPLC-UV/GC-MS分析其化学成分及不同抑菌活性黑种草胰腺部分α-淀粉酶和肠道葡萄糖吸收

摘要

黑种草(NS)是一种著名的植物，因其多种益处和在传统医学中的多用途。本研究旨在调查不同的化学成分NS用GC-MS对酯化脂肪酸进行分析，用HPLC-UV对有机部分进行分析，并评价其对胰腺的抑制作用α淀粉酶(在体外，在活的有机体内)和肠道葡萄糖吸收。在所有被研究的馏分中，显示出它们含有丰富的不同的有趣的分子。正己烷部分以亚油酸(44.65%)、棕榈酸(16.32%)、硬脂酸(14.60%)和百里醌(8.7%)为特征，而在乙醇部分的鉴定峰中，我们发现了儿茶素(89.03 mg/100 g DW)、芦丁(6.46 mg/100 g DW)和山萘酚(0.032 mg/100 g DW)。MeOH组分与没食子酸(19.91 mg/100 g DW)、儿茶素(13.79 mg/100 g DW)和芦丁(21.07 mg/100 g DW)的存在进行了区分。最后，通过不同分子的存在对水馏分进行了标记;其中，我们提到了水杨酸(32.26 mg/100 g DW)、芦丁(21.46 mg/100 g DW)和香草酸(3.81 mg/100 g DW)。关于对胰腺的抑制作用α-淀粉酶，发现在在体外学习，是最好的IC₅₀分别为乙醇(0.25 mg/ml)、甲醇(0.10 mg/ml)、水溶液(0.031 mg/ml)和正己烷馏分(0.76 mg/ml)在活的有机体内研究一个重要的抑制α观察正常大鼠和糖尿病大鼠-淀粉酶的变化。最后，评估了所有测试提取物的肠道葡萄糖吸收率，其范围为24.82 ~ 60.12%。本研究的结果表明NS种子部分具有有趣的抑菌作用α-淀粉酶和肠道葡萄糖吸收活性可能与存在的生物活性化合物有关。事实上，这些化合物可以作为抗糖尿病药物，因为它们无毒且疗效高。

1.简介

糖尿病是一种代谢紊乱，被认为是葡萄糖稳态异常，其特征是血糖升高。这种严重的疾病影响着世界上大量的人口，其特点是随着年龄的增长而不断增加，因为肥胖和久坐不动的生活方式越来越普遍[1］．2000年至2030年期间，糖尿病患病率将增至50% [2］．目前已知的糖尿病有两种类型:与胰岛素缺乏有关的1型糖尿病和与胰岛素抵抗直接有关的2型糖尿病[3.］．

胃肠道中含有丰富的各种消化酶，如α-淀粉酶，它被赋予很大的能力来分裂α淀粉中糖苷连接的-1,4，它诱导麦芽糖和葡萄糖的形成[4］．一般有两种类型α淀粉酶:唾液和胰腺的淀粉酶，它继续在小肠上消化淀粉。其抑制作用被认为是调节糖尿病餐后血糖升高的重要靶点[5］．肠道葡萄糖从管腔侧吸收和转运到血液的机制被认为是预防和治疗胰岛素抵抗型糖尿病患者的重要途径[6］．

黑种草（NS)亦称黑孜然，属毛茛科植物，分布于北非、中东、欧洲及亚洲。[7］．黑孜然具有广泛的作用，如免疫调节[8]、抗肿瘤[9，10]，以及抗真菌药物[11]，加上它的抗高血压作用[12］．这种植物被认为是多种次生代谢产物的丰富来源，如多酚、类黄酮、单宁、皂苷和生物碱[13］．最近，它被证明NS被赋予抗氧化剂[14]和抗菌活性[15，16］．黑孜然有很大的能力降低葡萄糖通过增加胰岛素水平;此外，还发现它能降低糖化血红蛋白[17]，这使得这种植物成为有前途的替代品，可用于预防和治疗抗糖尿病药物[18］．

本研究是我们前期研究的延续，旨在阐明白藜芦醇抗糖尿病作用的作用机制NS通过研究它们对胰腺的抑制作用α淀粉酶(在体外/在活的有机体内)及原位肠道葡萄糖吸收。采用HPLC/UV和GC/MS测定了不同的生物活性化合物，并对所研究的药理作用作出了贡献。

2.材料与方法

2.1.植物材料

黑种草种子是从当地市场购买的。为了工作的准确性，植物材料的植物学鉴定在Oujda科学学院进行了评估，并将标本存放在学院植物标本室，凭单号为HUMPOM471。

2.2.的制备黑种草

的NS种子被清除掉灰尘和残留物，然后在黑暗的房间里干燥大约一周。必威2490干燥的种子在提取前被制成细粉。然后，取100 g，用索氏仪从己烷到水，用极性递增的不同溶剂提取。每次提取后，用旋转蒸发器对所得馏分进行干燥。所得馏分置于4°C下进一步使用。

2.3.定性和半定量GC-MS分析

甲基酯的制备根据NF T60-233协议实现[19］．用气相色谱仪(Shimadzu GC-2010)分析酯化的正己烷馏分，配以熔融二氧化硅毛细管柱(5%苯基甲基硅氧烷， ，0.25μm薄膜厚度)加上质谱仪探测器(GC-MS-QP2010)。将作为载气的氦气调整到100千帕的恒压。烤箱温度最初设定为50°C(维持1分钟)，然后以10°C/min的梯度上升至250°C(维持1分钟)。注入器、传输管线和离子源的温度分别设置为250°C、250°C和200°C。对于定性和半定性分析，溶液中含有1μ将己烷(50 mg/g)稀释后的L以分裂方式注入( ）GC-MS系统在扫描模式下操作。质谱记录在70 eV(电子撞击电离模式) 范围40-350上午。(速率和溶剂延迟分别为5秒/扫描和4.5分钟)。脂肪酸成分的鉴定是通过将其质谱数据与国家标准与技术研究所(NIST147)计算机库中存储的数据进行比较来完成的。数据收集和处理使用LabSolutions(2.5版本)。

2.4.定性和定量HPLC分析

为了测定不同的HPLC剖面，以20 mg/ml的浓度制备了不同的馏分(水，MeOH和乙醇)。然后，过滤20个μm Millipore过滤器已经完成。然后,20μ取每个样品的l，注射到Alliance ew2695, C₁₈（ ，5μm)与紫外检测器PDA Waters 2996 (210-400 nm)相连的高效液相色谱系统的反相柱。高效液相色谱分析采用线性梯度进行，从80%的醋酸水到100%的甲醇20分钟，然后100% 25分钟，流速为1 ml/min，在254 nm处进行紫外检测。峰面积和峰高采用HPLC附带的Empower (version 3)软件进行分析。在HPLC图谱中，使用了不同的化学物质，如没食子酸、香草酸、柚皮素、芦丁、儿茶素、山奈酚、香兰素、阿魏酸和水杨酸。在DMSO (1 mg/ml)中制备不同的分析标准品;10μ使用上述相同的协议将L注入到系统中。酚类化合物的含量从每个标准的校准曲线中定量，并以mg/100 g干重表示。该分析分三次进行。所有校准曲线均呈良好的线性 ．

2.5.动物

的白化老鼠和纯种实验中使用的大鼠来自摩洛哥Oujda科学学院生物系的动物设施。动物被关在适当的笼子里，在通风良好的房间里，自由获得食物和水，并在实验室标准条件下(光/暗周期为12小时/12小时，温度为 ）.所有动物均按照美国国立卫生研究院发表的《国际实验动物护理及使用指引》[20.］．

2.6.体外抑制α淀粉酶

用索氏仪测定了不同组分的抑菌能力α-淀粉酶按照Thalapaneni等进行[21］．反应混合物含有200μL的NS以不同浓度(0.45,0.9和1.82 mg/ml)的阿卡波糖作为对照，200μ磷酸缓冲液的L ( )，和200年μL的α-淀粉酶溶液。反应混合物在37°C下预孵育10分钟。之后是200μ在每个管中加入1%的淀粉，然后在37°C下孵育20分钟。为了停止反应，使用DNSA显色剂(600μL)被添加。将所有试管置于100℃下孵育8 min，然后在冷水浴中冷却。最后，用1毫升蒸馏水稀释测试分数和对照的不同管子。在540 nm处测定了混合物的吸光度。

按以下公式计算抑菌率:

2.7.急性毒性试验

在测试化学物质的急性口服毒性时，已严格遵守经济合作及发展组织的化学物质测试指引(2008年)[22］．将30只小鼠分为5组，每组6只(3公3母):第一组为对照组，接受蒸馏水。其余3组分别增加0.5 g/kg、2 g/kg和5 g/kg不同组分的剂量;然后，在前30分钟内分别对它们进行观察，然后在最初的24小时内进行定期观察，在14天内每天进行毒性研究。

2.8.糖尿病感应

糖尿病是根据以下步骤诱导的[23］．动物禁食约16小时，并可获得水。必威2490之后，所有动物腹腔注射磷酸钠-柠檬酸盐缓冲液中溶解的四氧嘧啶(140 mg/kg)。 ）.一周后，使用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶方法验证给药。血糖高于1.5 g/l。

2.9.体内抑制α淀粉酶酶

这项研究是用体重在200至300克之间的正常和糖尿病大鼠进行的。实验前16小时，所有动物均不进食，免费饮水。这些动物被分为四组( ；♂♀/ ）;每组在每个OS中分别接受250 mg/kg的剂量。阳性对照组以同样的给药途径给予阿卡波糖10mg /ml剂量。对照组给予蒸馏水(10 ml/kg)。30 min后，灌胃2 g/kg淀粉。用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法估计不同时间(0、30、60和120分钟)的血糖水平。

2.10.原位肠道葡萄糖吸收

以下实验根据[24］．这种技术是基于使用的纯种大鼠空肠。实验前，所有动物禁食约36小时，并免费饮水。必威2490实验当天，肌肉注射戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉动物。对照组在10cm空肠内灌注适当的灌注液+葡萄糖，阳性对照组空肠内灌注根霉素。对于测试的部分，以250 mg/kg的剂量灌注空肠。使用530 ml/min灌注泵促进灌注。灌注约60 必威2490min后，收集不同的灌注液，采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法测定最终溶液中的葡萄糖浓度。测量空肠长度，所得结果以mg/cm/h表示，对应于每段长度(cm)每段灌注时间(min)吸收葡萄糖的mg量。

2.11.统计分析

分析采用方差分析和Student 's分析 -其次是Tukey检验，事后多重比较阈值为5%。采用SPSS v22.0软件对占总分数5%以上的组分进行层次聚类分析(HCA)和主成分分析(PCA)。在HCA的情况下，树状图(树)是使用Ward的分数间欧式距离平方的层次聚类方法生成的。

3.结果

3.1.提取及化学成分黑种草获得分数

表格1根据不加校正因子的气相色谱峰面积，给出了所研究的酯化正己烷馏分中各组分的相对百分比。不同的NS在索氏仪中使用不同极性的溶剂获得馏分;所得收率为2.53%至21.51% ( ）.采用气相色谱-质谱联用技术研究了正己烷馏分酯化脂肪酸的化学组成;该化合物的鉴定是根据他们的质谱数据与国家标准与技术研究所(NIST147)计算机库中存储的数据进行比较来评估的。表中所示数据1和图1结果表明，正己烷馏分中亚油酸(44.65%)、棕榈酸(16.32%)、硬脂酸(14.60%)、百里醌(8.70%)、香芹酚(3.03%)等化合物含量较高。

采用高效液相色谱法对乙醇、甲醇和水馏分的化学成分进行了分析;所得结果如图所示2和表2(一个)而且2 (b)．乙醇馏分主要富含三种黄酮类化合物:芦丁、儿茶素和山奈酚，而没食子酸、芦丁、香草酸和柚皮素是我们能够在MeOH馏分中识别出的分子。最后，发现水馏分中含有丰富的水杨酸、芦丁、阿魏酸、香兰素和香兰酸。

NF:未发现，低于检测限度。所有值都由 （ ）.

3.2.不同组分之间的化学变化

对HPLC法鉴定的不同部位中存在的不同分子进行层次聚类分析(HCA)和主成分分析(PCA)，以探讨不同得到部位之间存在的相似性以及鉴定分子与所研究药理作用之间的关系。

树状图的结果如图所示3.表明NS分数可分为距离为25个单位的两个主簇。短距离连接的分数比长距离连接的分数更相似。所研究的分数可分为两个主要组。第一组(簇1)以MeOH和水馏分为代表，其特征是没食子酸、儿茶素、芦丁和香草酸含量最高。第二组(簇2)仅由富含儿茶素、芦丁和山奈酚的乙醇馏分所代表。

如图所示4，第一主成分PC1占总方差的64.11%，与没食子酸、香草酸和芦丁为主要成分呈正相关。PC1被发现与山奈酚、儿茶素和水杨酸呈负相关。第二主成分占总方差的35.88%，与水杨酸呈正相关。这些PCA结果表明，NS分数可分为两大类，这证实了HCA中的发现。

3.3.急性毒性

所研究组分的急性口服毒性见表3.即使在最高剂量(5 g/kg)下也显示无毒效果。同时，我们提到白化病老鼠强迫喂食后行为正常。因此，没有任何有害影响;对此，我们可以得出不同的结论NS使用索氏仪得到的分数是无毒的。统计分析显示，对照组与被测组分之间无显著差异( ）.

3.4.体外研究α淀粉酶

的在体外抑制能力α-淀粉酶的不同NS对分数进行评估。观察到不同的提取物都具有一定的抑制能力α-淀粉酶和非常有效的所有测试剂量(0.45,0.9，和1.82毫克/毫升)。研究人员还指出，MeOH ( )，EtOH ( )，水( ）分数已注册IC₅₀比阿卡波糖( ）在研究中用作对照(表4)，而二氯甲烷和正己烷组分则分别生成IC₅₀的值 而且 比对照组高。

在1.82 mg/ml时，其抑制率最高，为91.49%，与使用的药物所获得的抑制率(92.24%)几乎相同。MeOH组分的抑制活性为86.39%，ethh组分的抑制活性为81.28%。还注意到，二氯甲烷和正己烷馏分给出了大约相同的抑制率63.33%(图5）.

3.5.在活的有机体内α淀粉酶抑制

关于结果体内α-淀粉酶抑制的正常和糖尿病大鼠，他们描绘在图中6(一)而且6 (b)．对照组大鼠口服淀粉后血糖由0.83 g/l升高至1.32 g/l。与对照组相比，口服250 mg/kg剂量的不同馏分30和60分钟后，观察到显著下降。120 min时，对照组血糖与其他各组无明显差异，而四氧嘧啶糖尿病大鼠口服淀粉后，对照组血糖由3.16 g/l升高至4.35 g/l。餐后血糖在水( ）及乙醇( ）以250mg /kg的剂量，口服淀粉30分钟后，而正己烷治疗60分钟后，血糖显著下降( )，甲醇( )，及乙醇( ）这种减少持续到MeOH淀粉过载120分钟( ）正己烷馏分( ）.

3.6.原位肠道葡萄糖吸收

得到的结果原位研究结果见图7，我们观察到，在没有得到的部分，肠道葡萄糖吸收达到12.18 mg/10 cm/h。在MeOH部分存在时，肠道葡萄糖的吸收量为4.85 mg/10 cm/h，其次是水溶液部分(8.70 mg/10 cm/h)和乙醇部分(9.15 mg/10 cm/h)。正己烷组分与本实验中作为阳性对照的根菌素相比无统计学意义。根黄酮对葡萄糖肠吸收有重要抑制作用，抑制量为4.71 mg/10 cm/h。20间(1%)作为阴性对照，与对照组相比无显著影响。水溶液、MeOH和ethh馏分加根菌素作为对照的抑制率分别为28.54、60.12、24.82和61.29%。

3.7.统计相关性

统计相关性如表所示5显示IC₅₀与五种化学成分(没食子酸，对香豆酸，柚皮素，槲皮素，山奈酚，和反式查耳酮)。这些不同的化合物对IC有显著的作用₅₀价值。山奈酚与IC呈负相关₅₀价值。

抑菌率主要与没食子酸呈高度显著正相关，与对香豆酸、柚皮素、槲皮素、山奈酚和其他3种化合物呈高度显著正相关反式-查尔酮)。

4.讨论

本研究旨在研究从索氏装置获得的不同组分对胰腺的抑制作用α-淀粉酶和肠道葡萄糖吸收。最好的IC₅₀从在体外抑制活性被选为实验对象在活的有机体内抑制α-淀粉酶活性对正常和四氧嘧啶糖尿病大鼠的影响之后，原位评估正常大鼠肠道葡萄糖吸收途径。结果表明，得到的不同馏分均表现出较好的稳定性在体外抑制胰腺酶的电位α-淀粉酶，特别是水，MeOH, EtOH和正己烷馏分，给一个IC₅₀在某些分数中比用阿卡波糖作为对照得到的值要低。与我们的发现相比，Value等人的[25]研究表明，水提物能够抑制α-淀粉酶具有剂量依赖性，在100 mg/ml的剂量下，其抑制能力约为84%，尽管在我们的工作中，我们发现在1.82 mg/ml的剂量下必威2490，其抑制酶的百分比为91.49%。我们的乙醇馏分给出了一个IC₅₀价值约为250必威2490μg/ml，高于Sandhya和Kannayiram的[26]研究，结果等于100μ克/毫升。在Buchholz和Melzig的研究中[27]，在浓度为2.5 mg/ml时，抑制率为45%，这比我们的结果中获得的IC₅₀值为100μ克/毫升。另一方面，正己烷组分具有抑制作用α-淀粉酶与IC₅₀450年μ克/毫升(28]，比IC低₅₀在我们的结果中发现(760μg / ml)。

的在活的有机体内研究表明，在短时间内给药后，不同分量的淀粉均能降低正常大鼠和糖尿病大鼠的血糖水平，证实了上述结论在体外结果。瓦盖塞和梅赫罗特拉[29]已经报道了氢丙酮提取物NS拥有抑制的能力α-淀粉酶与IC₅₀等于314.4μg / ml;当提取物被微囊化和IC时，这种效果增强₅₀变低224.1μG /mlα-淀粉酶抑制活性。此外，还表明，甲醇和乙醇提取物NS对四氧嘧啶糖尿病大鼠的血糖和血脂有降低的潜力，而没有再生β观察细胞胰岛[30.］．Khanam和Dewan的另一项研究[31]表明水提取物和正己烷提取物使血清葡萄糖和血脂正常;此外，研究表明，这些提取物对皮肤有再生潜力β细胞胰岛。

有关原位试验中，观察到所测试的部分和根黄素(SGLT1和SGLT2的特异性抑制剂)显示出肠道葡萄糖吸收的减少。SGLT1是一种发现于小肠顶端膜的葡萄糖转运体，负责从肠腔运输葡萄糖，而SGLT2在近端小管的葡萄糖重吸收中起着至关重要的作用[32］．获得的结果可能是由于生物活性化合物的存在，赋予位于粘膜中的葡萄糖转运蛋白抑制作用。在Meddah等人的研究中，研究表明NS使用短路电流技术的种子具有抑制钠依赖性d-葡萄糖吸收的活性，该活性是剂量依赖性的，且剂量非常低( ）［33］．在同一研究中还表明，水提取物可以从管腔侧控制SGLT1，这证实了植物抑制肠道葡萄糖吸收的能力。多项研究表明，儿茶素等类黄酮具有竞争性或非竞争性抑制SGLT1转运蛋白的能力[34］．研究表明茶多酚能够抑制SGLT1活性，从而导致肠道葡萄糖吸收减少[35］．

GC-MS和HPLC-UV分析表明，正己烷酯化脂肪酸中含有百里醌、棕榈酸、阿魏酸、芦丁等多种活性物质。此外，在我们之前的研究中NS，我们证明了不同的部分富含不同的生物活性化合物，如多酚和类黄酮[14］．Abdelmeguid等人。[36在一项研究中，链霉素糖尿病大鼠腹腔注射水提取物、油和百里醌可降低糖尿病，同时血清胰岛素升高。本文还提到，我们的正己烷部分中8.70%的百里醌和水部分在改善STZ诱导的从DNA损伤到线粒体碎片和空泡化的不同毒性作用中发挥了重要作用，这表明百里醌通过诱导氧化应激降低而具有对STZ的保护作用。在[报告的结果中37，他们发现NS油显示出其降低糖尿病大鼠血糖的能力，这表明了抗糖尿病的潜力NS石油。

高效液相色谱分析表明，存在几个分子的多酚和类黄酮性质，已知有很大的能力螯合消化酶，如α-淀粉酶和-葡萄糖苷酶[38］．例如，阿魏酸，一种酚类化合物，分别存在于我们的水溶液和MeOH馏分中 而且 (mg/100 g DW)，已被提及具有使糖尿病大鼠血糖、胰岛素等参数恢复正常的能力，不仅可以抑制糖异生和胰岛素的负调节因子，还可以改善肝糖生成[39］．这也由[40阿魏酸是一种猪的抑制剂α淀粉酶( ）通过与氨基酸残基相互作用。此外，芦丁，一种黄酮存在于我们的水和甲醇馏分中，含有一定量的 而且 ，是否有效并能阻止α-淀粉酶活性约53% [必威249041］．柚皮素 MeOH馏分中DW的含量也能抑制胰腺α淀粉酶(42］．

没食子酸，一种酚类化合物，存在于我们的水溶液和MeOH馏分中( 而且 )，发现能抑制吗α-淀粉酶和 ［43］．此外，有人提到，它与阿卡波糖的组合显示出很大的协同抑制能力α-淀粉酶和葡萄糖苷酶[44］．研究表明，以0.032 mg/100 g DW为乙醇馏分，山奈酚作为黄酮类化合物表现出较高的抑制能力α-淀粉酶，这可能是由于它们与胰酶的高度结合[45］．儿茶素是一种分子，在乙醇中具有重要的含量(89.03)，其次是MeOH分数(19.92)，显示出其抑制胰腺的能力α淀粉酶(46］．

此外，正己烷馏分中的两种脂肪酸棕榈酸和亚油酸的比例分别为44.65%和16.32%，被发现具有微弱到减缓的胰腺抑制能力α淀粉酶(47］．在Aazza等人的研究中，他们认为香芹醛可能在α-淀粉酶抑制[48］．最后，还登记了香芹醇存在于Zataria野蔷薇对胰腺有71%的抑制能力α淀粉酶(49］．

5.结论

本研究的发现揭示了这一点NS分数对两者都具有显著的抑制作用α淀粉酶消化酶和肠道葡萄糖吸收。这种效应可以归因于HPLC/UV和GC/MS鉴定出的不同生物活性化合物，如没食子酸、对香豆酸、柚皮素、槲皮素、山奈酚、反式-查尔酮，亚油酸和百里醌。需要对这些不同的成分进行更多的研究，以确认它们的抗糖尿病活性，并进一步用作商业化药物的替代品。

数据可用性

所有用于支持我们研究发现的数据均可根据要求从通讯作者处获得。

利益冲突

这项工作的作者声明，他们没有相互竞争的经济利益或个人关系，可能会影响在这篇论文中报道的工作。

致谢

作者要感谢拉姆达维·卡里姆先生和巴德拉维·穆斯塔法先生的技术支持。同时，他们也要向Loukili Hassania博士表示感谢，感谢她在这项工作中的指导。

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