慢性抑制FAAH减少抑郁样行为，改善慢性不可预测应激暴露后齿状回增殖

摘要

抑郁障碍的症状，如快感缺乏和绝望，可能是对压力条件的异常适应的产物。慢性不可预测应激模型(CUS)可引起下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)活性的增加，并诱导神经营养素信号通路的减少和成人齿状回中神经祖细胞的增殖，同时氧化应激增加。内源性大麻素anandamide (AEA)的水平似乎会影响这些与压力相关的抑郁特征，并可能被脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)调节。我们旨在评估FAAH抑制剂URB597对CUS模型小鼠抑郁样行为和神经增殖的影响。在CUS后以0.2 mg/kg的剂量腹腔注射URB597，持续14天。在水花飞溅和强迫游泳测试中分别评估了抑郁样行为、快感缺乏和绝望。用肾上腺的相对重量和血清皮质酮水平分析HPA轴水平的变化。氧化应激和脑源性神经营养因子(BDNF)也进行了评估。采用荧光免疫组化试验检测BrdU和Sox2的免疫反应性，比较神经前体。URB597能够逆转模型建立后小鼠产生的抑郁样行为。 Likewise, other physiological responses associated with CUS were reduced in the treated group, among them, increase in the relative weight of the adrenal glands, increased oxidative stress, and decreased BDNF and number of neural precursors. Most of these auspicious responses to enzyme inhibitor administration were blocked by employing a cannabinoid receptor antagonist. In conclusion, the chronic inhibition of FAAH generated an antidepressant effect, promoting neural progenitor proliferation and BDNF expression, while reducing adrenal gland weight and oxidative stress in mice under the CUS model.

1.简介

临床抑郁症普遍存在并使人衰弱;它的特点是出现快感缺乏和绝望等症状[1］．根据世卫组织最近的报告，全球有3亿多人(占世界人口的4.4%)患有抑郁症;因此，到2030年，它可能成为疾病负担的指导因素。各种实验证据表明，抑郁症状可能是对慢性应激条件的异常适应的结果，这种适应会增加下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴的活性。2，3.]导致肾上腺损伤，包括腺体肥大和对皮质酮的反应性加剧[4］．这些情况，加上血清素的缺乏，会抑制神经营养因子的水平，比如脑源性神经营养因子(BDNF)和神经发生。因此，齿状回(DG)中神经前体增殖的显著减少与抑郁症相关表型有关[5］．从这个意义上说，与健康对照组相比，没有任何抗抑郁治疗的抑郁症成年人在前DG中有更少的颗粒神经元[6]，这与重度抑郁症患者海马体积减少的发现相一致[7］．此外，提高人体糖皮质激素水平会诱导活性氧和氮的产生，并增加氧化应激，从而导致脂质过氧化作用的增加[8］．目前，治疗抑郁症的药物包括单胺氧化酶抑制剂、选择性5 -羟色胺再摄取抑制剂、5 -羟色胺-去甲肾上腺素再摄取抑制剂和三环抗抑郁药[9］．然而，这些抗抑郁治疗并不普遍有效[10]，许多药物会产生严重的副作用，如认知障碍、性功能障碍、睡眠障碍、尿潴留等，导致治疗依从性差[11］．因此，我们迫切需要通过调节各种神经传递系统(如内源性大麻素系统)来开发更有效、更安全的抑郁症药物治疗方法。该系统由其特定的受体，1型和2型大麻素受体(分别为CB1R和CB2R)组成;其内源配体2-花生四烯酰甘油(2-AG)和anandamide (AEA);其回收系统;以及参与内源性大麻素合成的n -酰基转移酶和磷脂酶D，以及参与内源性大麻素降解的脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)和单酰甘油脂肪酶(MAGL) [12］．从这个意义上说，内源性大麻素系统在某些神经精神疾病中起着核心作用，特别是那些涉及情感障碍的疾病，如焦虑和抑郁[13］．几种CB1R/CB2R激动剂已被用于探索内源性大麻素系统作为抑郁症的治疗靶点。这些化合物在改善HPA轴障碍和逆转抑郁样行为方面的抗抑郁作用已在动物模型中得到证实[14］．CB1R基因敲除小鼠的使用也被假设为抑郁症的遗传模型，其中突变小鼠表现出增加的抑郁行为，例如在强迫游泳测试(FST)中与野生型小鼠相比增加的不动性[15］．有证据表明cb1r介导的海马神经发生在活的有机体内在C57小鼠中CB1合成激动剂花生四烯酰-2-氯乙酰胺给药[16］．对他来说，通过激活mTOR1信号通路，刺激CB2R能够在健康小鼠海马中产生神经祖细胞增殖[17］．这些证据强调了这些受体信号传递的重要性;然而，大麻素激动剂对受体的直接刺激使化合物对受体的作用不如间接刺激那么强大，并导致这种策略容易产生副作用。因此，抑制FAAH和MAGL通过减少内源性大麻素的水解间接增加内源性大麻素系统的兴奋性可能是一种更有前途的治疗抑郁症的方法[18］．FAAH的抑制被描述为一种能够增强脑源性神经营养因子(BDNF)的策略，在具有遗传易感性的大鼠中表现出抑郁行为，这些行为在这些受试者中也被逆转[19］．抑制FAAH能够增加中缝背侧5 -羟色胺能神经元的放电率，并减少抑郁行为，类似于西酞普兰和丙咪嗪对健康大鼠的作用[20.］．然而，抑制FAAH的影响需要在其他模型中进一步分析，这些模型模仿抑郁症的特征，如慢性不可预测应激模型(CUS)，以了解它们在神经发生和行为中的作用。CUS模型已被证明对抑郁样行为有影响，并伴有一系列生理变化，如肾上腺重量、皮质酮和氧化应激的增加，以及BDNF和神经新生的减少，使其成为实现这一目标的可靠工具[21，22］．本研究旨在评估FAAH的慢性抑制是否能够恢复CUS抑郁模型小鼠的神经发生和行为损伤。

2.材料与方法

2.1.动物的准备

在这项研究中，使用了87只雄性C57BL/6J小鼠，每只体重25-30克，来自哈兰实验室(墨西哥城)。小鼠保持在12:00小时的光-暗循环中，食物和水可自由取用。所有实验程序均符合Investigación Biomédica de Occidente中心伦理研究委员会(R-2017-1305-6)规定的伦理政策，并根据墨西哥官方规范NOM-062-ZOO-1999和NOM-033-ZOO-1995以及美国国立卫生研究院实验室动物护理和使用指南(NIH出版物No. 8023, 1978年修订)实现。

2.2.药品监督管理局

本研究旨在评估FAAH的慢性抑制对抑郁症CUS模型的影响。小鼠随机分为6组( 对照组在未向CUS展示的情况下接收车辆。URB597组接受了URB597 (Piomelli和合作者证实的选择性FAAH抑制剂[23])，每日一次，连续14天(0.2 mg/kg, i.p.;Sigma-Aldrich)。CUS组在模型展示后收到车辆。CUS+URB597在CUS结束后开始接受与URB597组相同的药物治疗。最后，CUS+RIM+URB597组给予利莫那班(一种CB1R拮抗剂，1 mg/kg, i.p;Tocris)，每天一次，每次URB597用药前30分钟，CUS用药结束后立即开始。

2.3.慢性不可预测应激模型(CUS)

采用CUS模型模拟抑郁症的行为和病理生理状况[24］．该模型是对Patterson技术的修正[25，其中包括以下应激源的应用:在黑暗的房间里闪光灯，床上的锯末潮湿，剥夺水，剥夺食物和水，使笼子相对于横轴倾斜45°，过度拥挤(每箱放置4只老鼠在一个空间 厘米)，并每15分钟由亮变暗。这些压力源被随机带出(这样动物就不能预测刺激的发生)，每天一次，每次2小时，每天共14小时，持续14天，在光明阶段和黑暗阶段的最后2小时。

2.4.血浆皮质酮浓度评估

我们量化了未暴露于模型的小鼠和暴露于模型的总周期(7天)的一半以及CUS模型的总周期(14天)的皮质酮浓度，以验证其效果。动物斩首，凝血后采集血清，1000 × g离心15分钟，- 80°C保存，待测定。使用商业酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒按照制造商的说明(EA66，牛津生物医学研究所，CUSABIO，武汉，中国)测量血清中皮质酮的浓度。根据标准品浓度建立了标准曲线的线性回归方程。用微板分光光度计在450nm处测定溶液的光密度(OD)。这项测试使用了15只小鼠(每组5只)，而其余的动物被分配到文中先前描述的组中。

2.5.硫代巴比妥酸反应物质(TBARS)测定

每组6只动物斩首，收集海马，立即放在干冰上，- 80°C保存，直到检测。样品均质于标准裂解缓冲液(100 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100和0.5%脱氧胆酸钠)和蛋白酶抑制剂溶液(Complete™;Sigma-Aldrich, 05 056 489 001)，以13000 rpm离心30分钟。根据制造商的说明，使用TBARS检测试剂盒FR22(牛津生物医学研究)测量脂质过氧化水平。在这种方法中，过氧化物脂质聚集形成丙二醛(MDA)，脂质过氧化的最终产物;这种分子与2-硫代巴比妥酸(TBA)反应形成希夫碱。这些配合物的颜色，其浓度可在586毫米分光光度法测定。计算结果表示为μ丙二醛(MDA)。

2.6.行为测试

为了评估行为方面，溅水和强迫游泳测试(FST)被用来测量抑郁样行为(图1)．

2.6.1.启动测试

测试包括用喷头喷洒10%的蔗糖溶液(100μL)在动物的下背部，然后把它放在一个丙烯酸圆筒(直径20厘米，高30厘米);他的一举一动都被录了下来。在溶液放置的区域进行梳理，测量其潜伏期和总时间，以及每次梳理的平均持续时间和会话期间梳理的次数[26］．所有这些参数都被定义为测量实验对象的快感缺乏。换句话说，梳理行为越大，次数越多，潜伏期越低，小鼠表现出的快感缺乏就越少[27］．在没有刺激的情况下，小鼠在录制视频的地方已经习惯了20分钟。

2.6.2.强制游泳测验(FST)

FST遵循Porsolt等人的经典方案进行。[28，也被称为行为绝望测试，该测试基于啮齿动物对溺水威胁的反应，其结果被解释为对消极情绪易感性的衡量。小鼠被放置在透明的玻璃缸中( 直径)装满水(25°C)，大约15厘米深，以防止它们的尾巴接触底部。进行第一个阶段(预测试)是为了使小鼠适应不可能逃跑的情况，以进行随后的绝望评估。24小时后，再次对小鼠进行5分钟的测试，以评估整个测试中不动的总时间(绝望)，定义为除了保持头部在水面上所需的运动之外，没有任何运动[29］．用摄像机记录测试过程，静止不动的持续时间由3个不同的实验评估者评分。所有小鼠从第0天开始遵循相同的实验时间表，在第29天结束最终的行为评估。

2.7.Western Blot分析

之前描述的匀浆被用于该试验。用Lowry法测定蛋白浓度。样品(30μg总蛋白)通过sds -聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后转移到PVDF膜上。用5%脱脂牛奶在tris缓冲的生理盐水中阻塞膜，然后在4°C下与抗bdnf抗体(1:10 00,AB108319 Abcam)或抗bdnf抗体的各自一级抗体孵育过夜β-肌动蛋白抗体(1:5000,MA1-140 ThermoFisher)。用tris缓冲的Tween 20生理盐水(TBST)洗涤后，用生物素化的山羊抗兔IgG (1:10 00, BA 1000;作为二抗。冲洗五次后(PBS-Tween-20, 0.05%)，用ABC Elite试剂盒(PK6100;载体实验室)孵育1小时，然后用二氨基联苯胺(D5905;σ)。使用免费使用的ImageJ软件(Wayne Rasband，美国国立卫生研究院，版本1.51j8)评估蛋白质表达，获得的数据被归一化为每行的面积，如Bass及其合作者所述，适用于单个蛋白质分析[30.]，然后使用对应的表达式β-actin作为内部控制在每个样本。数据以相对于对照的归一化面积的百分比报告，并以至少六个独立实验的平均值表示。

2.8.BrdU+/Sox2+细胞神经元前体增殖的荧光免疫组化测定

所以是5-溴-2 -脱氧尿苷(BrdU) (B5002;Sigma-Aldrich)在牺牲前2小时给予100mg /kg i.p剂量。在盐水中。立即用氯胺酮(100mg /kg)麻醉小鼠。，i.p.) and xylazine (15 mg/kg, i.p.) and perfused intracardially with a 0.1 M PBS (phosphate-buffered saline) solution followed by 4% paraformaldehyde (PFA) solution in PBS. After perfusion, the animal’s brains were removed, left in fresh PFA fixative for 24 h, and washed 3 times with 0.1 M PBS, and finally, coronal vibratome slices (35 μm，徕卡VT1000E;Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)的DG区域(布雷格玛1.70至0.14毫米)，根据Paxinos和Franklin [31]。从每个大脑中，每个人收集了6个组织，每个切片之间的距离为175个μm.组织样品在37°C下用2n HCl处理10分钟，然后在pH 8.5下用0.1 m硼酸缓冲液处理10分钟。脑切片在0.1 M PBS中冲洗四次，并在封闭溶液(PBS, 0.1 M, Triton X-100, 0.03%和10%胎牛血清)中孵育50分钟。随后，自由漂浮的样品与一抗大鼠IgG抗brdu(细胞增殖标记物)孵育过夜(1:500;Bio-Rad，基德灵顿，英国;Cat# OBT0030)和anti-Sox2，一种神经干细胞标记物(1:500;Millipore, Billerica, MA, USA;Cat# AB5603)，在4°C。然后用0.1 M PBS冲洗切片4次，并与含有偶联二抗(1:1000 Alexa面粉488抗大鼠猫# A-21208和1:1000 Alexa面粉594抗兔子猫# R37117, ThermoFisher, Waltham, MA, USA)的相同封闭溶液在室温下孵育1小时。漂洗(用0.1 M PBS冲洗4次)后，用DAPI (Abcam, Cambridge, MA, USA;猫# ab104139)。 The sections were washed with 0.1 M PBS and mounted on glass slides and covered with Vectashield mounting media (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA; Cat# H-1000). All slices from each mouse were counted to a total of 12 DG per mouse (6 per hemisphere) ranging from -0.94 to -2.8 mm relative to the bregma. Every DG was analyzed entirely counting all positive cells following the subgranular zone, taking in a count from 1 field to 3 depending on the anteroposterior exact location of the slice. The slices were analyzed in an Axioskop Zeiss microscope, and photomicrographs were taken with an OLYMPUS DP70 camera. Then, the channels were separated and merged with the ImageJ program to count all merged marks per subgranular zone of DG per slice.

2.9.肾上腺的相对重量

固定后取肾上腺，从位于肾脏上的腹膜后结缔组织中取肾上腺，去除脂肪组织，然后用分析天平称重。固定组织在测量其重量前干燥5分钟，以避免在测量固定液残留物时产生误差。肾上腺相对重量(每对干腺mg /每只小鼠总体重g)按前文所述计算[32］．

2.10.统计分析

采用Kolmogorov-Smirnov检验检验数据的正态性。随后，未通过检验的数据通过Kruskal-Wallis检验进行分析。由一名未配对的学生评估FST的0天和15天之间的比较 -多组间比较采用双因素方差分析，然后采用Holm-Sidak多重比较检验。只有在主要因素显示出统计学意义后才进行事后比较;主要因素为CUS(存在或不存在(对照))和药物治疗(载体、URB597和RIM+URB597)。一个 被认为具有统计学意义，我们在GraphPad Prism 8软件上进行分析。

3.结果

3.1.血清皮质酮水平

为了评估CUS对糖皮质激素水平的影响，我们进行了ELISA检测，以检测小鼠体内最丰富的糖皮质激素皮质酮。在CUS模型进行的第0天、第7天和第14天，在不同的队列中获得血清皮质酮浓度。统计分析显示，第7天皮质酮浓度显著增加( ng/mL)与无应激的第0天( ng / mL, )．在14天的应激后，小鼠没有这种增加( ng / mL)(图2(一个))．

3.2.肾上腺相对重量

CUS模型产生肾上腺变化。在实验设计结束时，肾上腺的相对重量被量化为腺体重量(毫克)/体重(克)。2向方差分析显示交互作用的显著性: ：20.90, ；因子治疗: ：7.72, ；和因子CUS ：84.24, ．我们的结果显示统计上显著增加( ）与对照组相比，接受CUS的动物肾上腺的相对重量。此外，CUS后使用URB597治疗(CUS+URB597)导致有统计学意义的降低( ）与CUS组相比，肾上腺的相对重量有所降低。有趣的是，由URB957诱导的这种效应被先前使用CB1R拮抗剂RIM显著逆转。由于( ）在CUS+RIM+URB597组中观察到的肾上腺重量与CUS+URB组相比，值得一提的是，在仅使用URB597治疗的动物中，与对照组相比，肾上腺重量没有变化(图2 (b))．

3.3.TBARS化验

本试验的2向方差分析显示相互作用的显著性: ：25.95, ；因子治疗: ：4.90, ；和因子CUS ：50.45, ．与对照组相比，接受CUS模型的小鼠海马体中MDA含量显著增加( ）(见图3.)．通过URB597对FAAH的抑制，CUS的这些作用被逆转;因此，与单独使用CUS相比，CUS+URB597组MDA水平降低( ）在这个地区。最后，在本试验中，当使用CB1R拮抗剂时，MDA水平再次显著升高(CUS+RIM+URB597 vs. CUS+URB597) ( )．

3.4.强迫游泳测验

与对照组相比，长期压力大的动物表现出明显的静止时间增加。静止时间(以秒为单位)显著增加( ）与第0天的对照试验相比，CUS模型后第15天的FST(图4(一))．第22天总静止时间的2向方差分析显示交互作用的显著性: ：25.52, ；因子治疗: ：11.18, ；和因子CUS ：61.42, ．第29天总静止时间的2向方差分析显示交互作用的显著性: ：30.29, ；因子治疗: ：27.12, ；和因子CUS ：125.6, ．对照组与CUS组在第22天的测试( ）第29天的测试 )．对他来说，FAAH抑制剂(CUS+URB597)治疗组在第22天的测试( ）第29天的测试 )．另一方面，在接受RIM的动物组(CUS+RIM+URB597)中，CUS后的URB597所造成的影响被阻断，与CUS+URB597组相比，在第22天观察到静止时间显著增加( )．这些效果一直持续到第29天( ）(数据4 (b)而且4 (c))．尤其在试验第29天，URB597组与CUS+URB597组差异显著( )．

3.5.启动测试

2-way方差分析显示了相互作用的显著性: ：11.22, ；因子治疗: ：15.58, ；和因子CUS ：42.30, ．新郎总数的2-way方差分析显示了交互作用的显著性: ：9.45, ；因子治疗: ：20.61, ；和因子CUS ：14.69, ．本文提供的数据(图5)表明，与对照组相比，接受CUS协议的动物忽视了毛发梳理。这可以从开始第一次梳理的延迟增加( ）总数减少( ）新郎。在CUS (CUS+URB597)后，经URB597处理的动物开始第一次梳理的潜伏期降低( ）而增加( ）在新郎总人数上，与单独接受CUS的组相比。有趣的是，由URB957诱导的这些作用被先前使用CB1R拮抗剂RIM显著逆转。CUS+RIM+URB597组潜伏期有显著性差异( ）在新郎总数中( )，分别与CUS+URB597组对照。其中，URB597组与CUS+URB597组在本试验总新郎数上有显著差异( )．

3.6.脑源性神经营养因子的表达

各组海马区BDNF蛋白表达情况如图所示6．2向方差分析显示交互作用的显著性: ：389.8, ；因子治疗: ：452.3, ；和因子CUS ：397.1, ．与对照组相比，CUS组海马中BDNF蛋白水平显著降低( )．慢性URB597 (CUS+URB597)治疗与单独CUS组相比，海马中BDNF表达升高( )．另一方面，与CUS+URB597组(CUS+RIM+URB597)相比，给予RIM组(CUS+ URB597)在CUS后的作用被阻断。 )．

3.7.BrdU/Sox2双荧光免疫组化

为了标记增殖细胞，我们在牺牲前两小时注射了100 mg/kg的BrdU(图7(一))．sox2阳性细胞的2向方差分析显示相互作用的显著性: ：3.53, ，因素处理: ：9.30, ，而不仅仅是CUS因素的差异 ：0.02, ．我们的数据表明，与对照组相比，CUS组的Sox2细胞数量显著减少( )．有趣的是，我们还可以观察到，与CUS组相比，CUS+URB597组这些阳性细胞明显增加( ）(图7 (b))．对他来说，每个区域的brdu阳性细胞的2向方差分析显示了相互作用的意义: ：6.78, ，因素处理: ：20.86, ，而不仅仅是CUS因素的差异 ：4.00, ．这些结果表明，与对照组相比，CUS组的BrdU细胞数量明显减少( ）(图7 (c))．最后，每场BrdU-/ sox2阳性细胞的2向方差分析显示了相互作用的显著性: ：3.19, ，因素处理: ：14.81, ，而不仅仅是CUS因素的差异 ：4.30, ．这种双重标记的结果与上述单一计数的结果相似，但有更多的差异。与对照组相比，CUS组双阳性细胞明显减少( )．有趣的是，我们还可以观察到，与CUS组相比，CUS+URB597组这些阳性细胞明显增加( )．然而，与CUS+URB597组相比，CB1R拮抗剂CUS+RIM+URB597组由URB597诱导的作用被逆转( ）(图7 (d))．尤其在本实验中，URB597组与CUS+URB597组仅在单场双阳性细胞数量上有显著差异( )．

4.讨论

在本研究中，暴露于CUS诱导小鼠的抑郁样行为，以及海马DG亚颗粒区初级神经元前体的表达显著降低。压力引起的损伤是不同生化变化的结果，这些变化改变了大脑稳态、整个神经系统，从而改变了个体的行为，导致氧化应激增加、促炎过程、线粒体功能衰竭和细胞信号机制的改变等等[33］．为了减轻这些影响，有不同的药理学方法;然而，其中最具创新性的是刺激内源性大麻素系统。据我们所知，这是第一个研究慢性给药URB97抑制FAAH酶对CUS小鼠模型的神经保护作用的研究。CUS模型已被用作抑郁症神经生物学研究的工具。其效度不仅依赖于面部标准(基于抑郁样行为的产生)，还依赖于可预测性和构念效度。这些最后提到的标准分别与实际批准的治疗方法的模型反应(因此对新药评估的可预测性)以及临床中看到的生理、分子和形态生物标志物和其他客观可测量的特征(构建效度)有关。它的好处是一个一般的方法在活的有机体内该模型与遗传无关，因此提供了有关该疾病环境原因的更多信息，而该模型的局限性在于，由于小鼠和人类之间的差异，将其转化为临床应用至少是复杂的[必威249021，22］．

4.1.在CUS模型中URB597对生物标志物的影响

考虑到长期压力和抑郁行为之间的密切关系，我们决定研究皮质类固醇水平作为压力的主要生物标志物之一;同样，为了获得更多的信息，我们分析了肾上腺的相对重量。皮质酮浓度在基线和暴露于CUS的第7天和第14天测定。我们的结果表明，动物暴露于CUS后，第7天皮质酮水平显著增加，第14天皮质酮水平下降。皮质酮水平的升高与其他作者在类似模型中的结果一致[2，34，35]，尽管这些研究中的测量仅在治疗结束时进行。另一方面，龚等人进行的一项调查。4]，用CUS模型描述了暴露第2天至第8天皮质酮的持续增加。在本研究中，还采用运动限制模型(单一应激源)对一组应激动物进行了实验;有趣的是，该组皮质酮在第2天达到峰值，然后逐渐下降，这表明CUS可以使皮质酮水平升高的时间更长，因为习惯化程度较低。急性应激源(如睡眠剥夺)的模型也在长时间睡眠剥夺的动物中获得了皮质酮的增加，而这种增加并没有得到维持[34］．我们发现，在CUS下皮质酮的增加和随后该分子的减少有两种可能的解释。第一个暗示了HPA轴上的负反馈，即使在CUS后出现多动的情况下也仍然存在[36第二种是失代偿，即肾上腺皮质不能满足对糖皮质激素的需求，即使肾上腺皮质激素(ACTH)浓度很高，肾上腺皮质也会下降[37］．其他证据表明，在各种抑郁症模型中，测量肾上腺的相对重量可以作为HPA轴调节异常的指标[32］．接受CUS方案的动物表现出皮质酮水平升高和肾上腺重量增加[38］．这些腺体相对重量的增加可能表明皮质酮对ACTH最大反应的增加[39］．我们的结果显示，采用CUS模型的组肾上腺的相对重量有所增加，这与其他研究一致[2，40］．有趣的是，我们发现使用CUS+URB597组的相对权重低于使用CUS组。从这个意义上说，人肾上腺内的肾上腺皮质类固醇生成通过CB1R直接受到内源性大麻素系统的影响。希拉德和合作者[41]讨论了内源性大麻素张力负向调节HPA轴的活性。有人认为，在暴露于压力时，内源性大麻素水平通过一种不确定的机制迅速下降，导致对PVN的谷氨酸投射的抑制解除，并允许下丘脑激活[42］．Ziegler及其合作者的工作[37研究表明，大麻素受体CB1R和CB2R在肾上腺中表达，而这些受体与大麻酰胺的激活抑制了皮质酮的释放。因此，肾上腺重量的减少可能表明大麻素系统对HPA轴不同部分的抑制作用，反之亦然[43］．应激激素，如糖皮质激素，在诱导大脑氧化损伤方面的直接作用已被证明[44大脑中的促氧化剂(脂质过氧化和亚硝酸盐水平)标记物显著增加，抗氧化防御(过氧化氢酶和谷胱甘肽水平降低)系统显著下降。如今，众所周知，氧化应激和脂质过氧化存在于抑郁症患者和那些更容易遭受这些疾病的人，如老年人[45，46］．作为CUS模型的一部分，已经报道了不同的氧化特征，如较高的MDA和活性氧。作为我们研究结果的一部分，URB597对FAAH的抑制能够阻止MDA浓度的增加。虽然URB597分子本身对其结构具有抗氧化作用，并且最近被提出作为脂质介质的调节剂[47]，它发挥抗氧化作用的最可能和描述良好的机制是通过促进NRF2蛋白的活性。该转录因子负责细胞保护抗氧化蛋白氧氧化酶-1 (HO-1)、n-醌氧化酶(NQO1)和谷氨酸半胱氨酸连接酶(GCLc)的生物合成。所有这些证据都令人信服地解释了这种药理学策略的抗氧化优势[48］．

4.2.URB597对行为测试和BDNF的影响

目前的研究结果表明，在强迫游泳(绝望)和飞溅测试(快感缺乏)中，长期服用URB597会引起类似抗抑郁药物的行为。临床前研究表明，CB1R的药物阻断使动物情绪更活跃和焦虑[49，50]，易患慢性应激性快感缺乏[50]，甚至表现出抑郁的表型[51]以及容易损害HPA轴调节[52使人联想到抑郁症中观察到的神经内分泌功能障碍。以前也报道过内源性大麻素再摄取抑制剂AM404 [N-(4-羟基苯基)-花生烯酰胺]和直接CB1R激动剂hub -210[3-(1,1-二甲基庚基)-()-11-羟基-8-四氢大麻酚]在FST中的抗抑郁作用[53]，尽管这是我们所知的第一个在重复范式中评估这个测试的研究。选择性FAAH抑制剂URB597[环己基氨基甲酸3-氨甲酰联苯-3酯]的抗抑郁活性也已在尾悬浮试验中得到证实[54，55]和慢性轻度压力模式[56，57］．与本文中显示的结果一起，这些证据支持了这样一个概念，即内源性大麻素系统通过其内源性配体激活可能作为抑郁症治疗的靶点[58，59］．此外，Bambico和合作者开展的工作[60]表明，FAAH基因缺失通过增加血清素能神经元的放电率，增强来自中缝背的神经元的自发活动，从而增强抗焦虑和抗抑郁的作用[60］．这可能会增加血清素能系统的参与，该系统在抑郁症期间受损，从而解释了这种分子对减轻抑郁样行为的影响。我们的研究结果显示，在行为测试方面，URB597组与CUS+URB597组之间存在统计学差异;这表明其他非aea / cb1r介导的机制也可能参与其中，如上文提到的血清素能系统。然而，这并不是对这些结果的唯一解释;研究还表明，神经营养因子在抑郁行为的调节中起着重要作用。以往的报道表明，海马体中低水平的BDNF可能会导致海马体神经元的一些功能和结构改变，诱发啮齿动物的抑郁样行为，并最终导致人类的抑郁症状[61］．与这些观察结果一致，先前的研究表明CB1R(-/-)敲除小鼠表现出对压力的增强反应(绝望行为和皮质酮增加)，海马中的BDNF水平下降[62］．值得注意的是，海马体局部给药BDNF逆转了CB1R(-/-)敲除小鼠增加的绝望行为。尽管BDNF在抑郁行为中的作用尚不清楚，但BDNF在神经元可塑性、树突发育和抑郁行为调节方面的潜在作用使其成为治疗抑郁症的可靠治疗靶点[63，64］．BDNF激活酪氨酸激酶B受体(TrkB)已被证明在突触可塑性机制和突触功效中发挥关键作用[65］．从这个意义上讲，正如我们的研究结果所列，我们可以观察到cuss诱导的BDNF水平下降伴随抑郁样行为。正如我们从Vinod和合作者之前的报告中所期望的那样[19]，发现京都大鼠的这种神经营养素水平增加，在这里，当FAAH酶被抑制时，BDNF的减少被逆转，这一效应可能是通过CB1R的激活介导的。内源性大麻素系统介导的BDNF功能是否促进神经元可塑性导致抑郁样行为的减弱仍有待观察。其他一些报告表明，大麻素似乎通过促进海马神经发生而引发抗抑郁样作用[66］．海马细胞增殖是抗抑郁治疗的下游后遗症[67]，这就是为什么我们也用BrdU/Sox2 colabeling评估神经祖细胞。

4.3.URB597对BrdU/Sox2标记的影响

各种事件的报道，可能影响神经前体的增殖和生存在海马体的亚颗粒区。从这个意义上说，压力已被证明对这一过程有负面影响。61，68］．例如，抑郁症患者的神经发生水平下降[69，70];此外，神经发生消融术会增加先天性焦虑样行为[71]和类似抑郁的症状[72在动物模型中。更重要的是，抗抑郁药物会增加神经发生，这是观察其在啮齿动物身上的一些行为影响所需要的效果[73，74］．影响这一过程的一个转录因子是Sox2，它是新生细胞过程的基本元素，如在体外而且在活的有机体内研究显示[75，76］．这种蛋白质在大脑中扮演的角色之一是维持神经前体的身份。77，78]，因此，它被认为是神经祖细胞和干细胞的标记物[79］．大量的研究表明它参与了神经发生过程[80];据报道，在接受抑郁症治疗的患者中，Sox2蛋白水平升高[81］．我们能够发现我们的模型产生了这种蛋白质的缺乏，而抑制FAAH能够恢复该分子的水平，除非引起CB1R的拮抗。因此，内源性大麻素系统是成年海马神经元生成、存活、成熟和功能整合的关键调节因子。神经祖细胞及其子代细胞表达一种功能性内源性大麻素系统，并受内源性大麻素信号传导的影响[82］．CB1R的激活诱导DG中神经元的增殖、维持和分化[16]，在缺乏CB1R(-/-)的小鼠中减弱[83，84］．此外，内源性大麻素系统调控的各种胞内信号通路主要集中在Akt/mTOR和MAPK/CREB通路上，这些通路在细胞增殖、分化和生存中起着至关重要的作用，是内源性大麻素发挥其原神经原作用所必需的[82］．消除负责水解AEA的酶FAAH，可增加成年小鼠DG中的细胞增殖[85］．这些发现说明了增加内源性大麻素张力在应激情况下维持神经发生的重要性。尽管如此，在神经前体标记上发现了URB597组和CUS+URB597组之间的差异，这表明与其他已知效应物的组合可能对应激条件有更好的反应。这项工作表明，在CUS+URB597组中，所有cus相关效应的阻断可能是由CB1R激活介导的，CB1R激活是通过在给药URB597后AEA水平的增加来实现的。然而，缺乏rim对照组代表了本研究的局限性，这意味着作者不可能证明cb1r介导的作用。考虑到服用RIM后CUS效应的恢复可能是由于其他与cuss无关的CB1R效应，其影响超过了URB对AEA/CB1R信号的影响，而且AEA可以结合其他非CB1R底物，这些底物也涉及CB2R等应激调节反应，因此这一点特别重要。

5.结论

我们的总体结果表明，抑制FAAH能够逆转模型后小鼠产生的抑郁样行为。同样，在治疗组中，与CUS相关的其他生理反应也减少了，其中，肾上腺和脂质氧化的相对重量增加，BDNF水平和神经前体数量减少。这些对酶抑制剂的良好反应被CB1R拮抗剂RIM阻断。在CUS模型下，慢性给药URB597对小鼠产生抗抑郁的整体效果。这些结果鼓励我们继续研究这种药理学策略，以确定其全部潜力。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据可根据要求从通讯作者处获得。

利益冲突

作者声明，这篇论文的发表不存在利益冲突。

致谢

我们要感谢墨西哥塞古罗社会学院和瓜达拉哈拉大学提供的设施和机构帮助。这项工作由国家科学委员会Tecnología (CONACyT)项目(#281452)资助，授予M. E. Flores-Soto博士，并授予A. R. Tejeda-Martínez奖学金(814186/620110)。

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