系统性硬化症相关肺动脉高压的候选基因与免疫、炎症和细胞因子相关

摘要

背景．系统性硬化症(SSc)的肺部并发症，包括肺动脉高压(PAH)，是患者死亡的主要原因。然而，其病因的确切分子机制尚不清楚。本研究的目的是确定参与SSc-PAH进展的候选基因并研究其功能。方法．从基因表达综合数据库(gene expression Omnibus, GEO)中获取GSE33463的基因表达谱。利用加权基因共表达网络分析(WGCNA)构建自由尺度基因共表达网络，探讨基因集与临床特征之间的关系，并识别候选生物标志物。然后进行基因本体分析。第二个数据集GSE19617用于验证枢纽基因。利用基因集富集分析(GSEA)进一步探讨验证的枢纽基因的潜在功能。结果．通过平均链路级聚类，共划分了7个模块。在关键模块中共鉴定出938个枢纽基因，其中关键模块功能富集主要与趋化因子活性有关。随后筛选BTG3、CCR2、RAB10和TMEM60四个候选基因。这4个hub基因在GSE19617和GSE33463数据集中表达水平一致。我们绘制了枢纽基因的ROC曲线 )．此外，hub基因的GSEA结果与补体和炎症反应相关。结论．hub基因(BTG3、CCR2、RAB10和TMEM60)在SSc-PAH患者与对照组的区分中表现良好，其免疫学、炎症和细胞因子相关的生物学功能可能为后续SSc-PAH的诊断和治疗研究铺平道路。

1.简介

系统性硬化症(SSc)是一种罕见的系统性自身免疫性疾病，呈慢性进行性变化[1］．一系列的病理生理过程最终导致皮肤和各种器官系统中胶原蛋白的过量沉积和纤维化，尤其是肺[2］．SSc的累及肺部包括间质性肺疾病(ILD)和肺动脉高压(PAH)，值得注意的是，PAH在SSc中并不罕见[3.可能在有限的SSc中更常见[4］．在尸检中，多环芳烃占患者死亡的8-12% [4］．据估计，多环芳烃在SSc患者中的终生患病率为5-12% [5］．

多环芳烃(PAH)是一种破坏性疾病，可导致小、中肺动脉基础上的内膜、内侧和外膜层发生明显重构，导致肺血管腔明显变窄[5- - - - - -7］．最后表现为静息时平均肺动脉压增加( ）［5，6］．肺受累是慢性鳞癌患者死亡的常见原因[8，其中ILD是最常见的，其次是多环芳烃[6］．此外，据估计，全球30%的多环芳烃病例似乎与结缔组织疾病相关的多环芳烃有关，其中与sc相关的多环芳烃(sc -PAH)占多数[9］．基于ILD的多环芳烃的死亡风险是单纯多环芳烃的5倍[10］．SSc-PAH患者的预后极差。据报道，多环芳烃诊断后的3年死亡率约为50% [5]，而最近3年生存率为75% [11］．在治疗中，尽管由于使用血管扩张剂，特发性多环芳烃(IPAH)患者的运动能力和生活质量有显著改善，但在sc -PAH患者中没有这种趋势[2］．

加权基因共表达网络分析(WGCNA)被广泛用于探讨复杂疾病相关的基因网络特征[12]，可用于研究基因组和临床特征之间的联系，并识别候选生物标志物。本研究的目的是通过WGCNA分析研究与SSc-PAH相关的外周血基因网络特征，确定与SSc-PAH最相关的枢纽基因，并利用单个候选基因的基因集富集分析(GSEA)来探讨其潜在功能。

2.材料和方法

2.1.基因表达数据及数据预处理

SSc-PAH的RNA表达谱数据集来自基因表达综合(GEO)数据库(https://www.NCBI.nlm.nih.gov/GEO/)．在本研究中，微阵列数据集GSE33463 [13从42例sc - pah患者和41例对照组的全外周血中提取]，构建共表达网络，并鉴定与sc - pah相关的枢纽基因。考虑到本研究中使用的数据集是通过公开的方法从GEO数据库下载的，因此放弃了知情同意的必要性。

R软件(版本3.5.2;https://www.R-project.org/)和几个软件包用于数据挖掘和统计分析。有意义的是，" Limma "包的" normalizeBetweenArrays "函数[14被用于标准化。

2.2.差异表达基因的筛选

我们在表达数据中筛选sc - pah患者与正常对照之间的差异表达基因(DEGs) -在r的“Limma”包中测试，截止标准定义为 ，和调整值< 0.05。

2.3.共表达网络的构建

通过R包" WGCNA " [12，构建了基于GSE33463的DEGs共表达网络。在共表达网络中，基于16的软阈值能力和30个模块中的最小基因数，将绝对相关性高的基因聚类到同一个模块中。

2.4.基因本体与途径富集分析

如果在与性状密切相关的转录模块上进行基因本体和途径富集分析，将会更有效。为了进一步探索关键模块中DEGs的功能，使用R包“clusterProfiler”进行了基因本体(GO)分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析[15]，其中氧化石墨烯分析包括分子功能(MF)、生物过程(BP)和细胞成分(CC)。 被设定为截止标准。

2.5.临床意义模块中枢纽基因的鉴定

基因显著性(GS)通过介导进行评价值( ）基因表达与临床特征之间的线性回归[16]，而基因的连通性则通过Pearson相关的绝对值来评估。

在我们的研究中，GS大于0.95和 被认为是模块的枢纽基因，反映了与特定临床特征的有意义的相关性。

2.6.基因验证与疗效评价

第二个数据集GSE19617 [17，从17名SSc-PAH患者和12名健康对照的外周血单个核细胞(PBMCs)中提取的RNA中提取，用于验证枢纽基因。为了评估枢纽基因在区分SSc-PAH患者与健康对照的可靠性，我们绘制了受试者工作特征(ROC)曲线并计算了曲线下面积(AUCs)。

2.7.基因集富集分析

使用R包“clusterProfiler”对单个候选基因进行GSEA分析，以探索合适的候选基因在sc - pah中的潜在功能。我们使用h.all.v7.0.entrez。gmt在分子特征库中作为参考基因集。我们选择了调整后的临界值为<0.05。

3.结果

3.1.sc - pah与正常对照的差异表达基因

在42例sc - pah患者和41例对照组的基因表达芯片研究中，共鉴定出938个DEGs，前15个上调基因和前15个下调基因如表所示1．选择这些deg进行后续分析。

3.2.sc - pah共表达网络的构建与正常条件

用“hclust”函数的平均法计算表达矩阵后，簇高超过40的基因芯片(GSM827775)出现偏差，被排除在进一步分析之外(图1)1(一))．软阈值参数选取为16(无标度 ）以0.9为相关系数阈值时，保证网络无标度1 (b)而且1 (c))．使用WGCNA分析构建7个共表达模块(图2(一个))，其中含有最多基因的是绿松石模块。这些共表达模块是独立于其他模块的2 (b))．

3.3.临床意义模块和枢纽基因的鉴定

由于在所有模块中，绿松石模块与SSc-PAH的相关性最高，且与临床特征的相关性较高，因此选择绿松石模块进行进一步分析(图2 (c)而且2 (d))．根据截止标准( 而且 )，27个在临床重要模块中具有高连通性的基因被鉴定为枢纽基因。值得注意的是，蓝绿色模块中的一些基因，包括“BTG3”、“C12orf41”、“CCR2”、“COPB2”、“DYNLL2”、“ETNK1”、“GIMAP4”、“GIMAP8”、“HSPA1A”、“LFNG”、“LOC653171”、“LOC731878”、“RAB10”、“TMEM60”、“TNFAIP3”和“TNFAIP8L2”，对SSc-PAH具有较高的基因意义(图)2 (e)而且2 (f))．这说明上述这些基因之间也是密切相关的(图2 (f))．

3.4.关键模块的功能注释

GO分析显示，绿松石模块中的基因主要富集C-C趋化因子受体活性、C-C趋化因子结合活性、G蛋白偶联趋化因子受体活性和趋化因子受体活性。这些基因与氧化石墨烯术语之间的关系表明，许多基因与免疫反应和炎症有关(表2)．KEGG富集未见显著结果。

3.5.枢纽基因的验证与疗效评价

在数据集GSE33463中，与对照组相比，sc - pah患者PBMCs中B细胞易位基因3 (BTG3)、C-C基序趋化因子受体2 (CCR2)、RAS癌基因家族成员(RAB10)和跨膜蛋白60 (TMEM60)四个基因的表达明显增加或减少(图)3(一个)- - - - - -3 (d))．此外，在第二个数据集GSE19617中，BTG3、CCR2、RAB10和TMEM60 (all ）在sc - pah患者中也显著上调或下调(图3 (e)- - - - - -3 (h))．此外，为了将sc - pah与对照区分开，我们使用ROC曲线来计算auc。数据集GSE19617和GSE33463中每个基因的AUC大于0.7(图3(我)而且3 (j))．

3.6.基因集富集分析

通过GSEA找到了BTG3、CCR2、RAB10或TMEM60高表达样本中富集的完整基因集列表(图4(一)- - - - - -4 (d))．完整列表中与免疫和炎症相关的基因集被用于进一步分析。“补体”在CCR2和RAB10高表达的样品中富集(图4 (f)而且4 (g))．同样，BTG3和TMEM60高表达的样本在“炎症反应”中富集(图4 (e)而且4 (h))．此外，“肿瘤坏死因子-”α(肿瘤坏死因子-α)信号通过核因子κ B (NF-κB)”和“哺乳动物雷帕霉素复合体1靶蛋白(mTORC1)信号通路”在BTG3、CCR2、RAB10或TMEM60任何一种高表达的样本中都有丰富的表达4 (e)- - - - - -4 (h))．

4.讨论

最近的研究为多环芳烃的关键信号通路提供了新的线索。这些信号通路包括炎症、免疫激活、内皮功能障碍和生长因子[5］．在本研究中，我们通过WGCNA分析构建了sc - pah相关基因的共表达网络。构建模块和性状的关联，并将其可视化为热图，以寻找与多环芳烃最相关的模块。绿松石模块是SSc-PAH中最重要的模块，发现了该模块中与SSc-PAH发病相关的枢纽基因。研究结果表明，在sc - pah中发现的候选基因与免疫、炎症和细胞因子相关。

一些被认为是枢纽基因的基因可能在SSc-PAH的发病过程中发挥重要作用。PAH中的肺血管细胞在增殖和抗凋亡方面具有与肿瘤细胞相似的表型特征[18］．miR-142-5p通过下调BTG3，促进血管平滑肌细胞增殖[19］．虽然一些研究结果表明CCR2不能直接促进多环芳烃的发展，但它可能在肺血管的发育和重塑中发挥了以前没有认识到的作用[20.］．Guanosine-5 -三磷酸酶IMAP家族成员4 (GIMAP4)是一个强烈影响血管炎易感性的位点[21］．考虑到热休克蛋白A1A (HSPA1A)的抗炎特性[22]，细胞内和循环中的低水平HSPA1A会促进促炎状态，增加动脉壁对与内皮功能障碍相关的血管危险因素破坏作用的脆弱性[23］．既往研究表明肿瘤坏死因子-的表达降低α-诱导蛋白8 (TNFAIP8)，导致血管内皮生长因子受体2 (VEGFR-2)水平降低[24］．抗凋亡作用可部分介导内皮祖细胞移植对PAH的治疗作用。然而，内皮祖细胞条件培养基的抗凋亡作用通过阻断VEGFR-2而减弱[25］．同样，Pendergrass等人也发现了TNF-等炎症介质αSSc-PAH受试者的血管损伤标志物如VEGF [17］．Grigoriev等通过real-time PCR证实，与严重PAH和健康对照相比，轻症患者VEGF明显上调[26］．肿瘤坏死因子-内的多态性α-诱导蛋白3 (TNFAIP3)基因组位点与多种炎症和自身免疫疾病有关[27］．这些基因在sc - pah中尚未被进一步阐明。Hemmes等人成功区分了血管扩张剂反应型和非反应型多环芳烃，但对sc -PAH的相关研究较少[28］．

在hub基因中，数据集GSE33463中，与健康对照组相比，SSc-PAH患者中BTG3、CCR2、RAB10和TMEM60的表达显著增加或减少。同时，我们确认了上述4个枢纽基因在GSE19617中的表达水平，并且在PBMCs中的表达也显著上调或下调。未来还需要更多的实验来阐明它们在不同民族中的表达和相关功能。

由于模块内基因在功能上密切相关，我们通过GO分析来研究绿松石模块中基因的生物学功能。结果表明，这些基因主要富集C-C趋化因子受体活性、C-C趋化因子结合活性、G蛋白偶联趋化因子受体活性和趋化因子受体活性。毫无疑问，SSc表现为免疫系统紊乱和内皮功能障碍[29］．多项研究表明，源自肺部的免疫过程似乎促进多环芳烃的发展，并可能在体循环中留下明显的痕迹[30.］．Hemmes等人通过微阵列分析发现了RNA表达模式的广泛差异，如细胞-细胞粘附因子[28］．

此外，我们的研究还发现“炎症反应”和“补体”参与了sc - pah的发病机制。免疫球蛋白驱动的补体激活可调节多环芳烃的促炎重塑[31］．此外,“TNF -α信号通过NF -κB”和“mTORC1信号”也丰富。肿瘤坏死因子-α，炎症介质之一，在sc - pah受试者中发现[17］．黄芩苷至少部分通过NF-抑制大鼠肺动脉重构κB通路(32］．在小鼠中，通过mTORC1信号，D前列腺样受体亚型1的缺失加剧了PAH中的血管重构[33］．醛固酮可上调雷帕霉素复合物1亚单位raptor的哺乳动物靶点，诱导肺动脉平滑肌细胞异常生存模式，促进PAH [34］．

我们的研究也有局限性。首先，由于GEO数据不完整，一些患者的特征未知，包括自身抗体。其次，许多与SSc-PAH相关的生物标志物仍不清楚，需要进一步的生物信息学分析和实验确认来详细了解这些基因在SSc-PAH中的生物学功能。第三，我们在中枢基因的WGCNA分析和验证中仅使用了两项不同研究的数据。需要从不同程度的多环芳烃患者中提取微阵列样本，并需要更多的样本。

5.结论

综上所述，我们确定了关键基因共表达模块中的枢纽基因，其中BTG3、CCR2、RAB10和TMEM60四个基因在SSc-PAH患者的诊断中起着至关重要的作用。一些连接免疫、炎症和细胞因子的功能性生物学通路在SSc-PAH的发病机制中起着至关重要的作用。这些结果为sc - pah的诊断和治疗提供了新的见解，但其确切的机制仍需进一步探索。

数据可用性

在本研究中分析的数据集是公开可用的数据库，如基因表达综合(GEO)数据集。

的利益冲突

作者声明他们没有竞争利益。

作者的贡献

陈成水参与了本研究的设计和稿件修改。徐志晓参与了数据收集、分析和稿件起草。阮嘉兴对数据分析和稿件修改有贡献。潘凌云为资料整理和稿件修改做出了贡献。

致谢

国家重点研发计划项目(2016YFC1304000)、浙江省介入性肺科学重点实验室(2019E10014)、温州市介入性肺科学重点实验室资助。

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