一个具有胆管息肉表型的家族性腺瘤性息肉病家系的突变分析

摘要

在中国，大量的结直肠癌具有遗传背景。然而，由于认识不足，诊断率仍然很低，只有5-6%的结直肠癌患者被诊断为遗传性结直肠癌。家族性腺瘤性息肉病(FAP)是一种由大肠性腺瘤性息肉病(APC)基因突变引起的常染色体显性遗传疾病。APC的不同突变位点与FAP的严重程度、致癌风险和肠外表现相关。我们使用下一代测序(NGS)和捕获技术来筛选该谱系中先证者的可疑突变点。使用改进的Sanger测序，我们确定了该变异携带者的家庭成员，以及这种变异是否与疾病发生分离良好。FAP家族成员在胃肠道中有多个腺瘤性息肉，其中一些随着年龄的增长发展为癌症。两名受试者呈现罕见的胆总管息肉表型。未观察到肠外表现。在先证者和其他患者中观察到APC外显子16 (NM_000038.6)的杂合移码突变:c.3260_3261del (p.Leu1087GlnQfs31) (rs587782305);变体呼叫格式为CCT/C。由于缺失了两个碱基，31个氨基酸后出现了一个终止密码子，蛋白质被过早截断，影响了蛋白质的构象。谱系遗传连锁分析表明，临床表型与APC突变p.L1087fs共分离。这种突变可能是FAP家族的致病性，并导致罕见的胆总管息肉。

1.简介

在中国，结直肠癌的发病率和死亡率一直呈上升趋势;其中许多病例都有遗传背景。然而，在中国只有5-6%的患者被诊断为遗传性结直肠癌[1］．由于在中国对这种疾病的认识不足，遗传性结直肠癌的实际发病率仍然很低。以息肉病为特征的遗传性结直肠癌包括家族性腺瘤性息肉病(FAP)、Peutz-Jeghers综合征(PJS)、幼年性息肉病综合征(JPS)、锯齿状息肉病综合征(SPS);可进一步分为经典FAP (CFAP)、衰减FAP (AFAP)、mutyh相关息肉病(MAP)、Gardner综合征和Turcot综合征亚型。临床上FAP(包括CFAP和AFAP)是最常见的综合征[2］．

FAP于1925年首次报告[3.］．它是一种特殊类型的遗传性结直肠癌，其特征是高度显式的常染色体显性遗传。FAP的特点是发病早，甚至可以在新生儿中表现出来，没有明显的性别取向。FAP表现为结直肠粘膜上成百上千个腺瘤性息肉的弥漫性生长，没有明显的早期症状。但随着时间的推移，息肉的数量和大小不断增加，同时出现疼痛、腹泻、肠梗阻等腹部症状。70%以上的患者可能有先天性视网膜色素上皮细胞肥大(CHRPE)、多发性骨瘤和牙齿畸形的肠外表现。在过去，FAP也被称为Gardner综合征、Turcot综合征、胃腺癌或胃近端息肉病。如果不及时治疗，典型的FAP恶性肿瘤可在40岁左右高达100% [4，5]，而AFAP伴缓慢息肉发展的结直肠癌(CRC)的平均发病年龄约为55岁[6］．癌症的风险每10年增加2.4倍，手术的最佳年龄是25岁之前;因此，早期发现是非常重要的[7］．通过对家庭先验者的检测、基因诊断和风险管理，以及对其他家庭成员的基因筛查和随访监测，可以实现预防、早诊断、早治疗。

2.材料与方法

2.1.研究对象

在本研究中，我们调查了FAP家族谱系(图1(a))。先证者(III1) 6年前来过我院，我们进行了家谱调查。先证者(III1) 28岁时的内镜检查显示结肠和直肠有数百个息肉，被认为是FAP的诊断(图)1(b) -1(e))。31岁时确诊结肠癌，行全结肠切除术+回直肠吻合术。系谱分析显示有家族性胃肠息肉病和结肠癌的家族史。先证者的祖母(I2)有“胆管息肉、结肠腺瘤性息肉”病史，死于“结肠癌”。第二代的6个兄弟姐妹中有5个也患有这种疾病;其中3例(II3、5和10)死于“结肠癌和结肠腺瘤性息肉”。母亲(II1) 32岁时胃肠道多发腺瘤性息肉，52岁时确诊结肠癌，行全结肠切除及回直肠吻合术。其中一位阿姨(II12)的内镜结果提示食管上部胃粘膜异位。表兄弟姐妹(III4和5,24岁和25岁)和男性(III3, 40岁)有结肠腺瘤性息肉。先证者的另一位阿姨(II 8)因“右上腹痛、急性胆管炎、胆总管占位病变”，于2012年11月40岁时行“腹腔镜胆囊切除术+胆总管探查+胆总管肿块切除+ t管引流”。 Multiple polypoid lesions were observed in the lower part of the common bile duct during the operation. Postoperative pathology showed that adenoma in the lower segment of the common bile duct was accompanied by mild to moderate atypical hyperplasia of the glandular epithelium. Three months later, the common bile duct adenoma was resected through the T-tube sinus tract. Postoperative pathology showed villous adenoma of the bile duct with moderate to severe atypical hyperplasia. In July 2013 (at age 41), the aunt was admitted to Fujian Provincial Hospital with the main complaint of “repeated abdominal pain for two years plus fever for last three days.” Her test results showed normal serum bilirubin, alanine aminotransferase 168 U/L, aspartate aminotransferase 88 U/L, alkaline phosphatase 858 U/L, and glutamyl aminotransferase 520 U/L. Magnetic resonance cholangiopancreatography (MRCP) showed irregular intrahepatic and extrahepatic bile duct dilatation, with the greatest common bile duct diameter of 1.7 cm. In addition, multiple space-occupying lesions of the common bile duct were observed. A diagnosis of “acute cholangitis, common bile duct villous adenoma, and possible FAP” was made, and pancreatoduodenectomy was performed; this was published by us as a case report [8］．2014年(42岁)，她再次入院，原因是“10多年来大便次数增加，伴血性便”，诊断为“多发胃肠息肉:可能是FAP”。行全结直肠切除术(图1(f)和1(g))。经福建省医院伦理委员会(K2015-031-01)批准，接受调查的FAP家族的每个成员都签署了知情同意书。

2.2.临床表型检测

我们整理了先证者及家属的临床表现及相关生化检查，包括超声、CT、核磁共振、胃肠内窥镜检查结果。

组织学及免疫组化:采集组织常规脱水，石蜡组织块包埋，连续切片。厚度为3-4的切片μm采用苏木精-伊红染色(H&E)，切片厚度为2-3μm在阳性对照的抗剥离片上去除，在60-70℃的烤箱中烘烤1-2小时。按预设程序染色，结直肠癌标本分别用CK20、CK7、CEA、CDX2、P53、Ki67、、染色β连环蛋白。染色切片常规脱水，透明，清洗后密封。全自动免疫组化仪器为Ultra (Roche公司，美国)。上述染色蛋白一抗购自中国福州MXB生物技术公司，二抗、显色系统、H&E保持液均配有相应仪器。

2.3.DNA提取

先证者和同意接受调查的其他家庭成员的12 mL外周血样本被采集到EDTA抗凝管中。按照TIANGEN提取试剂盒说明书提取基因组DNA。

2.4.靶区捕获测序与生物信息学分析

首先用Nanodrop 2000测定DNA样品的浓度，并进行DNA碎片处理。采用下一代测序(NGS)和序列捕获技术对先证者进行检测。TargetSeq®液相芯片捕获测序是由iGeneTech®开发的靶区基因检测项目。TargetSeq®基于多因素算法设计靶区基因组，然后合成有效的特异性探针，在液相中与基因组DNA杂交。靶区序列被捕获并富集后，采用Illumina等主流测序平台进行高通量测序。通过对目标区域进行测序，可以检测到候选基因或候选位点。利用Covaris对DNA片段进行剪切和恢复，并构建Illumina测序文库。包含多个基因的DNA捕获微阵列进行多轮靶向基因富集，然后进行DNA测序(Illumina MiSeq)。使用短寡核苷酸分析包(Short oligonuctide analysis package, Soap)软件分析拷贝数、多态性和插入/删除数据，筛查疑似致病突变。筛选(http://sift.jcvi.org/)及Polyphen软件(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/)用于预测突变蛋白对功能的影响。以上步骤与北京百思诺医疗科技有限公司合作完成，目标基因包括APC、EPCAM、MUTYH，并检测相关遗传和结直肠癌致病基因编码区域及侧翼区域(T192V1Plus，液相分析平台，iGeneTech，北京，中国)。

2.5.Sanger测序验证

采用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR)对疑似候选突变位点片段进行扩增，并进行Sanger DNA测序验证，在先证者及参与研究的家庭成员中检测相应的位点。使用Primer Premier 5软件设计目标序列引物。从GenBank (NM_000038.6)中获得APC序列，目标扩增子长度为446 bp，位于APC外显子16号(c.3260_3261del: p.L1087fs)。使用了以下引物:F: 5 ' -TCAGATGAGCAGTTGAACTCTGGAAGG-3 '和R: 5 ' -CTATAATCAATAGGCTGATCCACATGAC-3 '。在50µL的反应体积中进行PCR，在热循环仪(PTC-200 PCR, BioRad)上扩增目标片段，PCR退火温度为58℃。PCR产物用Takara试剂纯化，目的片段PCR产物在ABI 3730XL平台上测序。从谱系成员(II1、II2、II8、II12、III1、III3、III4、III5、III6、III7、III8)中提取DNA，在目标区进行PCR扩增和Sanger测序，检测是否携带移码突变p.L1087fs。

3.结果

3.1.FAP家族谱系分析

先证者(III1) 28岁时被诊断为结肠直肠息肉病，三年后发展为坦率的“结肠癌”。全结肠+直肠部分切除后病理检查显示:II期大肠管状腺癌，伴神经周浸润，血管癌血栓，浆膜下浸润伴大肠广泛腺瘤息肉。28个大肠淋巴结中有3个出现癌转移。免疫组化示CK20 (+++)， CK7 (+)， CEA (+++)， CDX2 (+++)， P53(野生型)，Ki67(60%+)，和β连环蛋白(膜+)。弹性纤维染色(+)显示恶性组织已浸润到静脉导管结构(图2(一个)- - - - - -2 (c))．在FAP谱系成员I2和II8中观察到一种罕见的临床表型，即总胆管腺瘤。II8成员胆道手术，胆总管中下部见珊瑚样瘤变，直径约1.0 cm，基础广泛，易碎易出血。术后病理示“胆总管绒毛状腺瘤”。在我院行胰十二指肠切除术。胆总管扩张至直径约2.0 cm，十二指肠壶腹周围可见数个硬块。术后标本显示十二指肠乳头大小约5.0 × 4.0 cm，质地牢固，边界清晰。十二指肠降部可见多个直径0.3 ~ 0.5 cm的息肉。胆总管内可见多发带蒂肿瘤，直径1.0 ~ 1.5 cm。胃壁见多发息肉，直径0.5 ~ 0.7 cm。 Postoperative pathology results showed duodenal papillary tubular adenoma with local high-grade intraepithelial neoplasia and common bile duct tubular adenoma with high-grade intraepithelial neoplasia (Figures2 (d)- - - - - -2 (h))．结肠镜示多发结肠息肉，直径约0.3-2.5 cm，横跨整个结肠，乙状结肠和直肠较多。此外，在升结肠观察到一个无梗的扁平凸起，这被认为是FAP。直径约1.5 × 2.0 cm，表面黏膜结节状。胶囊肠镜检查未见异常。术后病理证实大肠FAP。息肉表现为管状腺瘤伴低级别上皮内瘤变(中度发育不良)(图2(我))．所有已故家族成员(I2、II3、II5和II10)均患有结肠癌和腺瘤性结肠息肉病。II1成员的胃肠病理表现为多发胃肠腺瘤性息肉及结肠小管腺癌。在调查的家庭成员中未发现CHRPE、骨髓和牙齿畸形、表皮样囊肿、脂肪瘤、硬皮病或其他恶性肿瘤如甲状腺癌和肝母细胞瘤等肠外表现。

3.2.FAP家系的基因分析

液相芯片捕获测序全外显子组测序在Illumina平台上进行(靶区42M，覆盖基因编码区+剪接位点+ mtDNA基因位点)。使用Trimmomatic、Bwa、Samblaster、GATK等软件去除剪接序列和低质量数据，将剩余数据与参考基因组进行比较。结果共生成80.71 M目标映射reads和13928.71 M总精确映射碱基。靶区覆盖率为99.76%，有效测序深度为168.91。4X、10X和20X的覆盖率分别为99.64%、99.46%和99.08%。我们使用GATK, SAMtools, VarScan, Annovar和snpEff分析SNP, InDel, CNV和突变注释的数据。选择已知相关基因APC, EPCAM, MUTYH，其他基因突变，筛选群体数据和同义突变，鉴定出APC突变。通过NGS检测，先证者在APC的第16外显子(NM_000038.6)上发现了一个杂合移码突变:c.3260_3261del(p.Leu1087Glnfs31) (rs5877823053.)．由于删除了两个碱基，变体调用格式(VCF)为CCT/C;31个氨基酸后出现一个终止密码子，蛋白质过早截断，影响蛋白质构象。被HGMD数据库收录，临床意义标注为致病性。有关更多信息，请参阅http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/gene.php?gene=APC．突变通常与FAP患者的发病机制有关，并已在几个FAP家族谱系中检测到。Sanger DNA测序结果显示，患者II1、II8、III1、III3、III4和III5携带了帧变突变体p.L1087fs，而其他家族成员II12、II2、III6、III7和III8不携带。谱系基因-表型相关分析表明，临床表型与突变基因p.L1087fs共分离。这支持了该变异为致病性的分类。

4.讨论

Groden最早的鉴定证实FAP与APC直接相关[10，11］．该APC位于常染色体5的5q21-q22上，包含16个外显子。100 kDa APC蛋白由2,843个氨基酸组成[12］．最近，一种新型的息肉病综合征被提出:胃腺癌和胃近端息肉病(GAPPS)。GAPPS的典型内镜表现是胃近端存在息肉，而远端不受影响。与其他息肉病相比，GAPPS可显著增加胃腺癌的风险，而直肠癌的风险较低。GAPPS与APC外显子1B中特定位点的突变相关[13］．然而，偶发肝外腺瘤性胆道息肉在临床实践中非常罕见，且鲜有病例报道。除超声、MRI、CT等内镜检查外，该病早期的临床诊断较为困难，对其自然进展的认识仍有限[14，15］．FAP患者十二指肠乳头及Vater壶腹周围区(延伸至肝外胆管区)腺瘤及微腺瘤的发生率较高[16］．FAP患者发生十二指肠腺癌和壶腹癌的相对风险分别高出331倍和124倍[17］．索拉维亚等人[18]描述了APC 5 '突变患者的严重十二指肠息肉病。APC中心部分和外显子16的突变(尤其是密码子1400的远端)使个体容易出现严重的十二指肠表型[19］．Björk等报道了15例FAP患者16外显子1051密码子下游的12个APC突变，揭示密码子1051下游突变可能与严重的壶腹周围病变有关[20.］．

APC是一种经典的肿瘤抑制蛋白。APC蛋白与轴蛋白和糖原合成酶激酶结合形成的破坏复合体β3 (GSK3β)是泛素介导的，可降解胞质β连环蛋白(β-catenin)，从而预防β-连环蛋白在细胞核中的积累。这可以防止下游靶基因的过表达，维持正常的Wnt/β-catenin信号通路，调节细胞分裂和迁移[11，21，22］．APC突变或缺失可导致Wnt/的过度激活β-catenin信号通路，核高表达β-catenin可修饰细胞间连接，诱导上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的进展。这最终导致细胞增殖异常，胚胎发育紊乱和肿瘤发生。肠上皮细胞过度增殖，凋亡不足，形成肠腺瘤结节和结肠腺癌，最终形成侵袭性结肠癌[23］．APC突变改变了APC蛋白和蛋白质之间的平衡β-catenin和E-cadherin，导致细胞与细胞间粘附和接触抑制的改变。这破坏了细胞分裂和细胞死亡之间的平衡，成为结肠增殖过程的限速因素[24］．APC是Wnt信号通路中重要的抑癌蛋白，介导结直肠癌的发生发展。APC缺失导致肠隐窝细胞增殖和体积增加，导致息肉的形成。

FAP是一种由APC突变引起的常染色体显性遗传疾病[25］．截至2019年4月，在HGMD免费版数据库中记录了1765(2037)个致病性APC突变。其中包括错义/无义421个，剪接位点112个，调控位点8个，小缺失721个，小插入310个，小插入43个，大缺失125个，大插入/重复12个，复杂重排13个，重复变异0个。高移码突变率导致APC失活增强。其中外显子16占APC编码序列的75%，也是一个热点突变区[26］．此外，40-77%的突变集中在该区域的5 '端，是突变密集区域[27，28］．Hutter等人发现c.3260_3261del (p.Leu1087GlnQfs .)突变31)在FAP家庭的一名18岁男性先证者中首次发现，这与我们的发现一致[29］．十二指肠腺瘤和结直肠腺瘤的表型与我们发现的家族一致，不同的是我们发现的家族中有2例胆管息肉表型。此前，我们报道过一例罕见的胆管息肉，两次特殊手术[8］．在我们发现的家族中，有两个胆道息肉的病例表明c.3260_3261del的携带者可能很容易感染胆道息肉。此外，Jarry等人在FAP谱系中发现了一个致病性突变(c.3260_3263delTCAA)，包括两个碱基的缺失(c.3260_3261delTC) [30.］．

APC突变位点多位于密码子178-309和409-1580，而最常见的致病性APC变体位于密码子1309 (c.3927_3931delAAAGA)。发病年龄一般为20岁，早期以大量结肠腺瘤开始。如果不治疗，密码子1309突变的结直肠癌患者的死亡平均比携带其他突变的FAP患者早10年[31，32］．密码子1250-1464的致病变异可导致高密度息肉病(平均5000个息肉)[33，34];然而，这种情况并非绝对[35］．AFAP(<100结直肠腺瘤)与密码子157前、密码子1595后和外显子9后mRNA替代剪接区突变相关。这部分与APC内的删除有关。APC致病变异体细胞嵌合体通常与FAP有关。CHRPE致病变异体的肠外表现与密码子148-2043或整个APC的缺失有关[35，36］．APC突变位点也影响结直肠病理表型。密码子208的错义突变与相对轻度的结直肠癌病理表型有关，密码子367的突变与AFAP衰减有关，密码子1309的截断突变可引起高度恶性的结直肠癌病理改变表型。密码子867和1114以及外显子6和9的突变影响APC Iβ-连环蛋白结合域，与较轻的结直肠癌表型相关[37］．

除胃肠道内镜监测外，其他器官的定期检查尤为重要，因为APC突变引起的疾病谱可能涉及肠外多个器官的疾病。例如，在APC密码子1395-1493突变的个体中，硬纤维瘤、骨瘤和表皮样囊肿的发病率明显高于密码子177-452突变的个体，而当致病变异仅位于密码子457-1309时，肝母细胞瘤和/或脑瘤的发展就会发生[25，36，38，39］．FAP患者死亡的主要原因是突变区癌变，无论黏膜是否正常，都应在该区域进行活检。

由于该病的发生和发展差异很大，即使在同一家族的不同个体之间也有显著差异;因此，治疗时机的确定应根据个别患者的结肠镜检查结果，而不是简单地根据基因突变位点[40］．目前，预防治疗仍然是FAP患者临床管理的最重要策略。通过胃肠内镜监测和权衡疾病进展的风险是选择内镜下局部治疗或预防性胃结肠根治术的基础。化学预防的定义是使用药物、天然药物或膳食补充剂来降低发病率或延迟疾病(包括癌症)的发作。各种化学预防策略在延缓FAP患者息肉进展、延迟预防性结肠切除术和预防结肠切除术后腺瘤复发方面发挥关键作用[16，41，42］．

数据可用性

本研究中使用和/或分析的数据集可根据要求从通讯作者处获得。

利益冲突

作者宣称他们没有利益冲突。

作者的贡献

谢利军、阮丹丹、张建辉和李毅对这项工作做出了同样的贡献。LJX, JHZ和DDR参与了文章的收集，数据分析和起草。JWL和HZZ设计、监督和编辑了这篇文章。LC所涉及的表格及数字提供。MDY和MLY监督了这项研究。所有作者都已阅读并批准了文章的最终草案。

致谢

国家自然科学基金(81874379)、福建省医学创新基金(2019-CXB-3， -4)、福建省青年健康科学计划(2020QNA079)资助。此外，临床研究得到了福建省张雪梅名老中医学术传承工作室建设项目和福建省财政厅专项研究基金(2020-500#，822#)的支持。

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