高效液相色谱法测定伏立康唑血药浓度并评价其与侵袭性曲霉病临床结局和不良反应的关系

摘要

目的．侵袭性曲霉病是一种流行的真菌疾病，特别是在亚洲国家，死亡率很高。伏立康唑(Voriconazole, VRZ)是治疗侵袭性曲菌病的首选药物。这种药物的血浆浓度是不可预测的，而且因人而异。这种可变性受许多因素的影响，导致临床意义。治疗药物监测(TDM)可能在患者的治疗过程中起着至关重要的作用。高效液相色谱法为血浆VRZ浓度测定提供了足够的特异性和敏感性。方法．本研究纳入了因侵袭性曲菌病而开始口服或静脉VRZ的患者。记录人口统计学特征和临床数据、结局和不良反应。对于每个患者，在稳态条件下收集血浆样本，并使用经过验证的高效液相色谱法进行分析。结果．共进行了22次测量。50%的患者超出了治疗范围。其中，27.27%和22.73%处于亚治疗和超治疗范围(<1μg / mL, > 5.5μ分别g / mL)。VRZ血药浓度与治疗结果有显著相关性( ）.在亚治疗范围内，治疗失败是治疗成功的五倍。与非超治疗浓度的患者相比，超治疗浓度的患者更频繁地观察到不良反应。治疗失败患者的死亡率是治疗成功患者的2.17倍。结论．VRZ的TDM对于更好地评价治疗过程中的疗效和毒性具有重要作用。因此，药物水平的测定可能具有临床意义。

1.简介

在过去的二十年里，侵袭性真菌感染的患病率和严重程度都有所增加。在医院环境中，第二种流行的真菌感染是曲霉菌病，大约90%的病例是由曲霉菌引起的答:来自烟［1］．在真菌感染中，侵袭性曲霉病的发病率和死亡率较高[2，3.］．侵袭性曲霉病是一种流行的真菌疾病，特别是在亚洲国家，死亡率很高。全球侵入性曲霉病的发病率为每年30万例(其中50%在亚洲国家)，死亡率为30-80% [4］．伏立康唑(VRZ)是第二代抗真菌药物，是氟康唑的广谱衍生物[5，6］．该制剂有口服和静脉注射(IV)两种剂型[7］．VRZ是治疗侵袭性曲菌病的首选[1，8］．VRZ的口服生物利用度、蛋白结合度和组织穿透度分别为96%、58%和2-4.6 L/kg [9］．VRZ由肝脏CYP450同工酶代谢[2，6并具有复杂和非线性的药代动力学特征[2］．这种药物的血浆浓度是不可预测的，而且个体内部和个体之间存在差异[10[不论以何种方式施用]11］．这种变异性受到许多因素的影响，如年龄、性别、体重指数(BMI)、CYP2C19多态性、药物-药物相互作用和基础疾病[2，9，12]，这导致了临床意义[8］．因此，治疗性药物监测(TDM)是必要的，以减少毒性和优化疗效[3.，5］．实际上，VRZ是这种方法的理想选择[12]，而TDM可能在患者的治疗过程中起着至关重要的作用[6］．

VRZ的血浆谷水平是治疗监测的首选[12］．VRZ槽位低(<1μG /ml)与治疗失败相关。高VRZ槽位(>5.5μg/ml)与毒性反应有关，包括皮疹和光敏反应、视觉障碍、幻觉、肝毒性和中枢神经系统事件[7- - - - - -9，12］．由于VRZ的TDM对更好地评价治疗的疗效和毒性有重要作用，因此确定药物水平可能具有临床意义。

目前已采用高效液相色谱(HPLC)、液相色谱-串联质谱(LC-MS)、气相色谱-质谱(GC-MS)、微生物法等多种分析技术对唑类物质进行定量分析。HPLC方法为血浆VRZ浓度测定提供了足够的特异性和敏感性[6，9］．

由于VRZ水平及其相关因素的个体间变异性仍具有挑战性，因此本研究旨在评价VRZ血浆浓度与其疗效和安全性之间的关系。建立了一种简单、快速、特异、灵敏的VRZ血浆浓度测定方法。

2.材料和方法

2.1.病人

本研究纳入了因可能的、可能的或已证实的侵袭性曲菌病而开始口服或静脉VRZ的患者。已证实的、可能的和可能的真菌病定义是基于修订后的欧洲癌症研究和治疗组织/真菌病研究组(EORTC/MSG) 2008年的共识定义[13］．VRZ的负荷剂量为6mg /kg BD，其次为4mg /kg BD，所有患者记录以下数据:性别、年龄、体重、BMI、给药途径、基础疾病、转归、不良反应、生化实验室检测。评估治疗是否部分或完全成功的依据是临床(发热、感染体征和症状以及炎症标志物)和放射学(CT或MRI检查结果)的改善或缓解，以及证实或推定真菌病原体已被根除。治疗失败的定义为:超过14天的治疗后持续真菌感染，或超过7天的治疗后真菌感染进展(临床和放射学进展，持续阳性培养结果，或因真菌感染死亡)[14］．

排除标准为:对唑类、曲菌球或过敏性支气管肺曲菌病的过敏史或严重反应史，同时使用卡马西平、依非韦伦、利福平、西罗莫司或与VRZ相互作用的麦角生物碱，症状持续时间超过四周的慢性侵袭性曲菌病，严重肝功能障碍(定义为总胆红素、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)，或碱性磷酸酶(ALP) >正常上限3倍)，并接受抗真菌联合治疗。

该研究由Shahid Beheshti医科大学伦理委员会批准，符合ir . smu . phnm .1396.886的伦理规范。

2.2.化学和仪器

VRZ粉末来源是基什医药制药公司捐赠。内标氯硝西泮(IS)购自索布汉制药公司。HPLC级乙腈、甲醇和醋酸铵从默克公司获得。流动相为0.05 M乙酸铵/乙腈/甲醇40:20:40 (v/v/v)。高效液相色谱系统由Shimadzu泵模型LC-10AD和调节在256 nm的紫外检测器(Shimadzu SPD-20A模型)组成。分离在低压梯度模式下进行，流速为1ml /min，使用C₁₈柱(250 mm × 4.6 mm, 3.5μ米球形粒子)。

2.3.实验

VRZ原液以甲醇(100μg / ml)。一系列的7个校准溶液浓度为2.5,5,10,20,40,80和100μ用VRZ原液在甲醇中制备g/ml。氯硝西泮原液在甲醇(7.5μg / ml)。

2.4.抽样

对于每个患者，在稳定状态下(VRZ给药后至少3天)，下一次给药前30分钟在EDTA管中采集血液样本。血液样品在3000转/分离心10分钟分离血浆。血浆保存在−70°C的微管中，直到分析时间。

空白血浆(450μL)转入微离心管;校准器的解决方案(50μl)和IS (250μL)被吸进其中。甲醇(1250μL)加入蛋白沉淀。将悬浮液涡旋2分钟，然后在10000 rpm的转速下离心15分钟。上清液用注射器过滤器过滤后注入HPLC系统。

测量VRZ峰与氯硝西泮峰的曲线下面积比(AUC)。这些比值被用来构建校准曲线，并使用校准曲线来确定患者样本的VRZ浓度。

3个质量控制(QC)样品，浓度为10、50和80μG /ml在甲醇中配制，加入空白血浆中，使终浓度为1、5、8μ克/毫升。以与校准器相同的比例加入IS和甲醇后，按与校准器相同的方式处理样品。

验证了该方法的线性度、准确度和精密度。通过分析浓度分别为1、5、8的3个QC样品，计算日间和日间的准确度和精密度μ克/毫升。对于日内测定，这些样品在同一天进行三次测定，对于日间测定，这些样品在三个不连续的天进行处理。

为了分析患者的样本，每个样本首先在室温下解冻，然后，500μL的它被转移到一个微离心管。最后,(250μL)和甲醇(1250μL)被添加到它。管被盖上并以与校准器相同的方式处理。

2.5.统计分析

分析采用SPSS 17.0版本软件(SPSS Inc.， Chicago IL, US)。我们使用适当的描述性统计，包括连续变量的中位数或平均值和标准差(SD)，分类变量的频率和百分比。采用Kolmogorov-Smirnov检验评估数据分布的正态性。分类变量比较采用卡方检验。参数变量和非参数变量的比较分别采用方差分析和Kruskal-Wallis检验。值<0.05为显著。

3.结果

3.1.病人

研究纳入了24例因侵袭性曲菌病开始VRZ的患者(14例已证实，9例可能，1例可能)(13名男性和11名女性)。其中2例因同时使用依非韦伦而被排除。其余22例患者的人口学特征和临床资料见表1．

3.2.峰鉴别

IS用于纠正任何可能的错误，由于蛋白质沉淀和提取血浆样本。在此方法中，氯硝西泮与VRZ具有相似的logP，且与VRZ和等离子体峰没有相互作用，因此适合作为IS化合物。

用有机溶剂(甲醇)沉淀血浆蛋白是一种快速、简便的方法。为此，我们评估了不同比例的甲醇。以1:1甲醇:血浆为最佳配比。

如色谱图所示(图1)，在此方案和色谱条件下，氯硝西泮和VRZ的保留时间分别为9和11.5 min。运行时间是20分钟，分辨率很好，没有重叠的峰。

3.3.线性，LOD和LOQ

VRZ/氯硝西泮峰比AUC与VRZ血药浓度在0.125-10范围内呈线性关系μG /ml，方程是 （R²= 0.999)。校准曲线如图所示2．

定量限是0.125μg/ml，以信噪比3:1估计LOD，测得LOD为0.042μ克/毫升。

3.4.规格、精度和准确度

空白血浆(不含VRZ和氯硝西泮)与药物和IS峰值没有任何界面。所有浓度的准确度范围为85-115%。日内和日间精密度在定量下限±20%和其他浓度±15%的可接受范围内。

3.5.等离子体中的VRZ水平

治疗开始后的中位5天(范围3-8天)测得药谷水平。50%的患者(11/22)超出了治疗范围。其中亚治疗组占27.27%，亚治疗组占22.73%μG /ml)和超治疗(>5.5μ分别g / ml)范围。

3.6.VRZ级别和结果

亚治疗和非亚治疗水平治疗失败分别为83.33%和18.75%。

3.7.VRZ水平和毒性

与非超治疗水平相比，超治疗浓度的患者更容易观察到VRZ毒性。根据VRZ水平的不良反应情况见表2．

此外，肝酶(ALT、AST、ALP)和总胆红素在治疗上高于其他两组。数据如表所示3.．

3.8.VRZ级别和死亡率

总共有9例患者死亡。血浆浓度较低的患者的死亡率高于治疗范围内的患者(55.56% vs .;44.54%)。

4.讨论

在本研究中，50%的纳入患者的血浆水平超出了治疗范围。报告的亚治疗和超治疗水平分别为27.27%和22.73%。结果表明VRZ血药浓度变异性高。因此，固定剂量并不适合所有患者。其他研究报告了血浆水平变异性方面的相同结果。Chawla等人指出，分别有30%和5%的患者VRZ水平存在较大的个体间差异，从亚治疗性到毒性[6］．Cabral-Galeano等报告了30.7%的病例超出治疗范围水平(<1μG /ml为19.2%，>为5.5μG /ml为11.5%)[11］．根据Perreault等人的研究，应用VRZ剂量调整指南，达到治疗水平的患者比例从36%显著提高到80% [15］．

VRZ血药浓度与临床结局有显著统计学相关性( ）.亚治疗水平的患者治疗失败是成功治疗的5倍，同时，该组治疗失败比非亚治疗水平的患者治疗失败高4.5倍。这一结果与meta分析报告的“治疗性伏立康唑血清浓度患者获得成功结果的可能性是两倍”相一致[8］．

尽管死亡率与VRZ水平没有统计学关联( ）在治疗失败的患者中，它比治疗成功的患者高2.17倍(62.50%)。28.57%)。Miyakis等研究表明患者初始VRZ槽水平≤0.35μ与血浆浓度高于0.35的患者相比，G /ml患者的死亡风险显著增加了11倍μ克/毫升(16］．

根据其他研究，许多因素可以影响VRZ水平，如年龄、性别、体重、基础疾病、药物相互作用和遗传多态性[8，11，12］．本研究中VRZ血药浓度与年龄无显著相关性( )，性( )，BMI ( )，及给药途径( ）.由于研究的局限性，我们没有评估遗传多态性。Obeng等报道CYP2C19基因型对VRZ的谷浓度有影响[17］．

根据Vanstraelen等人的研究，如果血浆白蛋白降低1 g/dl，胆红素升高1 g/dl, VRZ蛋白结合分别降低0.67%和0.19% [18］．在我们的研究中，与治疗组和亚治疗组相比，治疗水平高于治疗水平的患者白蛋白水平较低(1.41 vs . 2.87和3.47 g/dl)。他们的胆红素水平也高于治疗组和亚治疗组(1.5 vs . 0.95和0.40 g/dl)。低白蛋白血症和高胆红素血症可影响VRZ蛋白结合及血浆水平[18］．

VRZ血浆浓度的测定方法多种多样;每一种都有其优点和缺点。生物测定法是一种较为可靠的VRZ水平测定方法，但存在一些局限性，如不能识别药物和活性代谢物之间的差异、联合抗真菌治疗对抑制生长带的影响以及运行测试过程耗时等。Badiee等人报道，当实验室不采用高效液相色谱法时，生物测定法可用于测定VRZ血浆浓度[9］．用于此目的的另一种方法是UPLC-MS/MS。这是一种简单、快速的监测三唑类抗真菌药物的方法，但不易操作[19］．Prommas等人使用了运行时间快速准确的LC-MS-MS，但成本很高，并不是所有实验室都可以使用[20.］．

该方法具有快速、简便、采样方便等优点。该方法简便易行，为VRZ血药浓度的测定提供了足够的特异性和选择性。

本研究的局限性是样本量小，未评估基因多态性，患者随访时间短。

5.结论

VRZ血浆水平在个体间有相当大的变异性。VRZ的TDM对于提供更高疗效、更低毒性的侵袭性曲霉病治疗具有重要作用。确定药物水平可能具有临床效益。

数据可用性

支持本研究结果的数据可根据要求从通讯作者处获得。

的利益冲突

作者声明不存在利益冲突。

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