雷公藤肽缀合右旋糖酐包被磁性纳米颗粒作为GnRH靶向探针的研究⁺MRI显示癌细胞

摘要

近年来，超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPIONs)作为磁共振成像(MRI)的肿瘤成像探针，与肿瘤靶向肽的结合在MRI药物特异性传递方面具有很好的优势。本研究的目的是设计一种基于铁的MRI靶向造影剂_3.O₄纳米粒子结合雷公藤肽(SPION@triptorelin)，它对GnRH受体有很大的亲和力。采用共沉淀法合成了sp离子束包被的羧甲基葡聚糖(SPION@CMD)共轭triptorelin (SPION@CMD@triptorelin)，并通过DLS、TEM、XRD、FTIR、Zeta和VSM等技术对其进行了表征。然后使用1.5特斯拉临床磁场计算合成配方的弛豫性。评估它们的MRI、定量细胞摄取和细胞毒性水平。表征结果证实了SPION@CMD@triptorelin的形成与合适的尺寸相结合。结果表明，SPION@CMD@triptorelin对MDA-MB-231癌细胞的细胞吸收没有细胞毒性，且在浓度为75时，其对MDA-MB-231癌细胞的细胞吸收是对SPION@CMD的6.50倍μM. SPION@CMD@triptorelin的弛豫度计算显示了一个合适的r₂而且r₂/r₁数值为31.75 mM⁻¹·年代⁻¹和10.26,分别。我们的研究结果证实，triptorelin靶向SPIONs可以提供一个T₂在MRI诊断gnrh阳性癌症方面具有巨大潜力。

1.简介

癌症是世界范围内最常见的死亡原因之一，因为癌症患者在诊断和临床管理方面面临挑战[1，2］．然而，传统的影像学技术在疾病诊断中发挥了有效的作用，但特异性较低。靶向纳米分子成像是一种较好的早期检测和提高对比度噪声比的方法。因此，开发新的有效的癌症早期诊断方法对于降低癌症死亡率至关重要[3.］．此外，基于特定生物标记物或受体的癌症检测已经大大改进了人类癌症的早期和特异性诊断，以及在治疗过程中和治疗后监测疾病的结果[4- - - - - -6］．

多种方法(包括物理、实验室、活组织检查和成像检查)用于各种人类癌症的诊断。影像学检查是一种非侵入性的检查骨骼和内部器官的方法。用于诊断癌症的最常见的成像方法可能包括计算机断层扫描(CT)、骨扫描、超声、x光、正电子发射断层扫描(PET)和磁共振成像(MRI) [7，8］．在过去的几年里，研究人员已经使用了一系列选择性和敏感的造影剂，通过MRI对早期癌症进行特异性诊断。

超顺磁性氧化铁纳米颗粒(SPIONs)是美国食品和药物管理局(FDA)批准的纳米颗粒之一，已成功用作MRI的肿瘤成像探针[9，10］．由于其低毒、生物相容性和生物降解性，它们也可用于药物输送，显示出在治疗应用方面的巨大潜力[10- - - - - -14］．将SPIONs包覆有机材料还可以提高其胶体稳定性，有利于SPIONs作为MRI造影剂的实现[15，16］．SPIONs与肿瘤靶向基团(如抗体、适体或多肽)的结合为肿瘤生物标志物/受体的选择性诊断和MRI制剂的特异性传递提供了一个很有前途的平台。在癌细胞中过表达的肽与其受体的特异性结合(特异性配体-受体相互作用)，导致基于受体介导的内吞作用(RME)的spion高效内化进入细胞[17，18］．此外，它可能有助于延迟肿瘤组织外渗，从而增加MRI制剂在肿瘤部位的停留时间。

Triptorelin是一种合成的十肽促性腺激素释放激素(GnRH)激动剂，与天然的GnRH结构相似，对GnRH受体有很强的亲和力。雷公藤雷素是一种有效的睾酮(男性)和雌激素(女性)合成抑制剂，由于癌细胞增殖下调，被用于治疗晚期前列腺癌和乳腺癌[19，20.］．

葡聚糖包被SPIONs与雷普托雷素结合作为靶向分子，可为肿瘤诊断提供合适的MRI探针[21］．因此，在本研究中，triptorelin肽被共轭合成SPION@CMD。然后，利用透射电子显微镜(TEM)和动态光散射(DLS)对制备的纳米粒子的形态性质和尺寸分散性进行了表征。此外，还对制剂的细胞毒性进行了研究。为了研究合成的SPION@CMD@triptorelin作为诊断纳米探针的潜力，在体外对gnrh阳性乳腺癌细胞MDA-MB-231进行了MRI技术研究。同时，利用原子吸收光谱技术获得了纳米探针的定量细胞吸收。本研究的工作流程如图所示1．

2.材料和方法

2.1.材料

右旋糖酐，四水合氯化铁(FeCl)₂h·4₂O, 99%)，六水合氯化铁(FeCl_3.h·6₂O, 99%)， NaOH，溴乙酸，氢氧化铵(5 M)，和2,5-二苯基四唑溴化铵(MTT)从Sigma-Aldrich(德国慕尼黑)购买。N50钕磁体(50 × 50 × 30 mm)， 14公斤高斯剩磁购自凯文公司(中国)。所有材料均为分析级。细胞培养基(RPMI1640)、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶和青霉素/链霉素溶液均来自Gibco公司(Darmstadt, Germany)。MDA-MB-231细胞株来自伊朗国家细胞库，伊朗巴斯德研究所。

2.2.cmc涂层SPIONs的制备

采用共沉淀法合成了羧甲基化右旋糖酐(CMD-)包覆的超顺磁性氧化铁纳米粒子(SPIONs)₂)的气氛。简单地说，1 g葡聚糖溶于3ml去离子水;然后加入含有0.1 M溴乙酸的8m NaOH溶液3ml。反应混合物加热至60-65°C 120 min, CMD与乙醇沉积，50°C干热干燥。接下来，将25毫升含1克CMD的水溶液加入含200毫克FeCl的水溶液(10毫升去离子水)中₂h·4₂O和550毫克FeCl_3.h·6₂脱氧去离子水中O与N的摩尔比为2:1₂并搅拌。2.5 mL 28%的nhh₄在N的作用下搅拌，OH慢慢加入到溶液中₂在10°C的气氛下，直到反应颜色变成深黑色。然后，将悬浮液加热到78°C 1 h。将反应混合物冷却到室温，以每分钟3500转的速度离心，以去除非常大的团聚体。用外磁铁分离SPION@CMD产物，用双蒸馏水(ddH2O)洗涤两次，冷冻干燥后得到冻干的SPION@CMD。

2.3.将Triptorelin偶联到SPION@CMD

在将雷公藤肽与SPION@CMD结合的过程中，采用异脲键偶联反应将羧基修饰的SPION@CMD与雷公藤肽胺共价连接。简单地说，4.6 mg溴化氰(BrCN)加入到pH为10的碱性悬浮液(5 g/mL SPION@CMD和0.0211 g/mL碳酸钠(Na₂有限公司_3.)，在室温下轻轻摇晃1小时，以激活SPION@CMD上的末端羧基。然后，加入0.0238 g磷酸二氢钠(NaH₂阿宝₄)，然后在反应培养基中加入4.8 mg雷公藤肽，室温搅拌2 h。下一步，在3.2 mg甘氨酸的存在下，在4°C搅拌混合物24小时。将形成的结合物(SPION@CMD@triptorelin)用截断分子量为20,000的膜袋透析法收集24 h，去除多余的反应物。

2.4.物理化学特征

使用HORIBA zeetasizer(纳米- zs, Malvern, UK)的DLS测量SPION@CMD和SPION@CMD@triptorelin的粒径分布。通过透射电子显微镜(TEM) (Philips CM120, Philips electron Optics, The Netherlands)对纳米颗粒的形貌进行观察。用x射线衍射(XRD)(意大利GNR EXPLORER)在室温下表征了SPION@CMD的晶格结构。XRD系统(x射线衍射仪)在40 kV, 30 mA的条件下在2θ20°-80°。用傅里叶变换红外光谱(FTIR)测定了SPION@CMD和SPION@triptorelin的官能团和化学结构变化。利用振动样品磁强计(VSM) (Danesh Pajoush Magnetis Company of Kashan, VSMF model，伊朗)，在室温下，在−15000 ~ 15000 Oe的循环磁场作用下，评估了磁场依赖性磁化强度。

2.5.合成配方的细胞摄取水平

通过使用SPION@CMD和SPION@CMD@triptorelin评估细胞内铁引入细胞来评估合成配方的细胞摄取水平。将MDA-MB-231癌细胞以4 × 105细胞/孔的密度接种于6孔板中，孵育过夜。然后，用0.075、0.25和0.7 mM的SPION@CMD和SPION@CMD@triptorelin洗涤细胞，孵育24 h。然后，用PBS冲洗三次，用高氯酸分解细胞。然后用原子吸收光谱法(AAS)测定细胞内铁的浓度。

2.6.合成制剂的细胞活力测定

MDA-MB-231细胞以每孔8 × 103的密度播种于96孔板中，在37°C和5% CO中孵育过夜₂在空气中。分别在培养基中加入0.025、0.05、0.1、0.25和0.7 mM的SPION@CMD和SPION@CMD@triptorelin，继续孵育24 h。将培养基更换为新鲜培养基，48 h后进行MTT检测。孵育20年后μL/孔MTT溶液(PBS中5 mg/mL)处理4 h，每孔培养基完全去除，100μ加入L的DMSO在室温下溶解福马赞结晶。使用ELISA分析仪(Stat Fax-2100 Awareness, USA)在545 nm波长和630 nm参考波长处测量吸光度。

2.7.王仁贵

根据松弛率对SPION@CMD和SPION@CMD@triptorelin进行MR能力测定 随SPIONs浓度线性增加，公式如下: 在1 /T₀纯净水的弛豫率是多少C为SPIONs的浓度。

纵向和横向松弛度值(r₁而且r₂)在1.5特斯拉MRI扫描仪(Avanto/SIEMENS, Kamyab医院)测量，使用含有SPION@CMD@triptorelin的幻影，其不同浓度为0.15,0.30,0.9,1.20,2.40和3.0 mM。

回波时间(TE): 8.7 ms时获取t1加权图像;重复时间:TR1至TR6: 100/300/600/ 900/1200/2000 ms;翻转角度:20度;矩阵尺寸:256 × 192;视场(FoV): 260毫米;100%;平均值:1，回波序列长度:1;切片厚度:5毫米。T₂的加权图像T₂自旋回波多段脉冲序列，固定TR为2000 ms;TE1 TE16: 13.8 / 27.9 / 41.4 / 55.2 / 69.0 / 82.8 / 96.6 / 110.4 / 124.2 / 138.0 / 151.8 / 165.6 / 179.4 / 193.2 / 207.0/220.8的女士;翻转角度:20度;矩阵尺寸:256 × 192;视场:260毫米;100%;平均:1;与回声列车长度:1。所有用于确定松弛率图的曲线拟合例程均由Origin、Excel和RadiAnt DICOM Viewer软件执行。

2.8.磁共振成像

利用MRI技术观察制备的SPION@CMD和SPION@CMD@triptorelin在MDA-MB-231细胞中的积累情况。MDA-MB-231细胞(1.5 × 106)接种于3个单一T25烧瓶中，37℃孵育过夜。孵育后，将浓度为0.25 mM的SPION@CMD和SPION@CMD@triptorelin添加到每个T25 flask中孵育24 h。PBS冲洗细胞，将3 × 106个细胞置于2 mL试管中0.4%琼脂糖溶液中。未与纳米颗粒孵育的琼脂糖细胞作为对照。的T₂使用1.5 T MRI扫描仪获得加权图像，参数如下:TR/TE: 2197/110 ms;翻转角度:180°;切片厚度:3.0 mm;片间距离:1.2 mm;FoV: 1.2 × 1.2 cm;矩阵尺寸:128 × 128。

2.9.统计分析

采用SPSS 22进行数据分析。采用非参数Kolmogorov-Smirnov检验评价数据的正态性，作为拟合优度检验。采用单因素方差分析和Tukey多重比较检验分析统计学差异(各组比较均< 0.05)。

3.结果

3.1.纳米粒子的理化表征

对于DLS结果，在SPION@CMD和SPION@CMD@triptorelin中只观察到一个峰值(图2(一)和2(b))。SPION@CMD和SPION@CMD@triptorelin配合物的最大粒径分别为160 nm和116 nm。这一现象表明颗粒的粒径分布较窄，数量单一，部分原因是雷公藤雷公素与SPIONs的作用。在SPION@CMD和SPION@CMD@triptorelin的Zeta电位分别为~ - 72.4 mV和~ - 31.5 mV2(c)和2(d))。

TEM图像显示，合成的SPION@CMD呈球形，形貌均匀3(一个))．TEM图像得到的粒径分布直方图(图3 (b))发现，SPION@CMD纳米颗粒的尺寸在30 ~ 45 nm之间，平均尺寸为31.35±11.1 nm。

数字4为SPIONs得到的XRD数据。XRD谱显示，最大XRD峰出现在2θ35.7°，代表典型SPION层间距值为3.83242 a。所有峰的位置和相对强度与标准磁铁矿铁相匹配_3.O₄图案(JCPDS卡，文件号。19-0629)，表明合成的纳米粒子具有磁性(Fe_3.O₄)晶体。疏水SPIONs晶型的主要峰为220、311、400、422、511和440。晶体的平均尺寸(D)根据Sherrer方程估计: 在哪里K为Scherrer常数(0.9)，为波长(0.1542 nm)，为FWHM(以弧度为单位)，和θ为峰值角位置。疏水SPIONs晶型的主要峰为220、311、400、422、511和440。SPIONs晶体的大小是由最密集的峰(311)计算出来的，其值约为7.95 nm。

用VSM评价了合成SPIONs的磁性。数字5结果表明，纳米颗粒在27°C时具有超顺磁性，饱和磁化(Ms)值为18.26 emu/g。

数字6显示SPION@CMD和SPION@CMD@triptorelin的FTIR。在SPION@CMD的光谱中，该波段在3244 cm处⁻¹对应于与吸附水基团相关的O-H键的拉伸振动和弯曲振动。峰高583厘米⁻¹与铁氧键有关峰高2923厘米⁻¹和583厘米⁻¹分别与羧甲基化右旋糖酐(CMD)的CH2和C-O键有关。此外，峰值在1590厘米⁻¹对应不对称羧基的羰基，键的位移是由于羰基与SPIONs表面的络合。

在被雷公藤肽包裹的SPIONs光谱中，峰值在1756 cm处⁻¹是由于γ-内酰胺，是肽结合在SPIONs表面的证据。因此，FTIR光谱结果证实了雷公藤藤素对磁性纳米颗粒的表面改性。

3.2.合成制剂的细胞活力测定

采用MTT法检测SPION@CMD和SPION@CMD@triptorelin的细胞毒性。结果表明，在0.025、0.05、0.1、0.25和0.7 mM浓度下，SPION@CMD的细胞毒性与对照组差异不显著 ，0.7 mM SPION@CMD与对照组比较差异有统计学意义。试验还显示，在0.7 mM的最大浓度下，存活率超过60% SPION@CMD@triptorelin(图7)．因此，MTT试验证实SPION@CMD@triptorelin配方缺乏细胞毒性。

3.3.合成配方的细胞摄取水平

原子吸收光谱结果显示，在0.075、0.25和0.7 mM浓度下，雷普托雷素包被SPIONs处理MDA-MB-231细胞，细胞内铁含量分别比未包被SPIONs多6.50、6.28和2.57(图)8)．经证实靶向SPION@CMD@triptorelin的细胞吸收效率优于SPION@CMD。

合成的纳米颗粒特异性靶向MDA-MB-231细胞的能力也通过MR成像技术得到了证实。结果如图所示9证明在铁浓度为0.25 mM时，与SPION@CMD相比，具有雷公藤肽功能化的纳米颗粒的MR图像强度降低了90%以上，而SPION@CMD的MR图像强度降低了53%。

3.4.MRI王仁贵

松弛测量是指在MRI中测量纳米粒子作为造影剂的功率。为了确定纳米颗粒的比磁性，将SPION@CMD和SPION@CMD@triptorelin溶液在0.15,0.3,0.9,1.2,2.4和3 mM Fe的水中制备，用于松弛度测量。

的r₂相对论计算为31.75 mM⁻¹年代⁻¹根据线性斜率图SPION@CMD浓度依倒数而定T₂与R²= 0.9965，而r₂相对论值为26.51 mM⁻¹·年代⁻¹与R²SPION@CMD@triptorelin = 0.9991，低于SPION@CMD10）

的r₁SPION@CMD和SPION@CMD@triptorelin的参数计算为3.10 mM⁻¹·年代⁻¹和2.86毫米⁻¹·年代⁻¹分别(图11)．的r₂/r₁比率是一个有趣而敏感的参数，用来辨别造影剂的类别(T₁或T₂对比剂)。的r₂/r₁SPION@CMD和SPION@CMD@triptorelin的比值分别为10.24和9.27。

4.讨论

在现代医学中，靶向成像探针的使用对改进诊断方法非常重要。临床使用的成像探针的特点之一是稳定性和生物相容性。在生理ph下使用spion的主要缺点是聚集和不稳定性。为了克服这些限制，人们使用各种表面涂层来修饰它们的表面性能[22］．研究还表明，用羧基(-COOH)基团修饰的SPIONs可以与任何药物和/或含有胺(-NH)的天然化合物结合₂)组或其组合[23，24］．

另一方面，虽然造影剂提高了图像的质量，但其注射剂量是有限的。利用多肽等配体可以特异性地增加靶细胞对细胞的吸收，从而降低造影剂的浓度。使用这种方法，我们使用了羧甲基化的葡聚糖，它有助于与雷公藤肽肽的SPIONs。FTIR也证实了SPION@CMD@triptorelin形成的可能性。SPIONs的涂层也可以归因于Fe屏蔽效应的降低_3.O₄这可以促进spion作为MRI造影剂的实施。蛋白质电晕的形成是裸铁相互作用的结果_3.O₄含有血浆蛋白的纳米颗粒[25］．最近的研究发现，裸铁_3.O₄纳米颗粒可通过ROS生成和氧化应激诱导细胞毒性和细胞凋亡[26，27］．铁的涂层_3.O₄可以降低这些纳米颗粒的细胞毒性，只要MTT试验证实SPION@CMD@triptorelin缺乏细胞毒性。

对MDA-MB-231细胞系上制剂的细胞吸收的评价表明雷公藤肽对靶向制剂吸收的重要性。随着浓度的增加，细胞对靶向或非靶向纳米颗粒的吸收增加。在所有浓度下，SPION@CMD@triptorelin的细胞摄取都高于SPION@CMD。这与之前的研究一致，在体外，带多肽的MRI制剂可增加功能化spions的细胞内化[28］．雷公藤甲素为基础的内化机制引起受体介导的内吞作用[17]，从而使配方有效地内化到表达gnrh的细胞中。

在Poller等人的研究中，研究了不同乳腺细胞系对非靶向SPIONs的细胞摄取，在50 μ g/ml浓度下，MDA-MB-231的细胞摄取为0.3 pg/细胞[29］．然而，在0.7 mM的浓度下，我们获得了7.25 pg/细胞的细胞摄取μG /ml)和孵育时间相同的细胞株[30.］．

合成铁的大小_3.O₄基配合物影响氧化铁纳米颗粒的磁性和进入靶细胞的内化[31］．在我们的研究中，通过DLS得到SPION@CMD和SPION@CMD@triptorelin的平均水动力直径分别为160和116 nm。TEM图像显示合成的SPIONs形貌均匀且不均匀，平均尺寸为31 nm，而TEM图像的尺寸分布直方图也显示合成的SPIONs尺寸低至10 ~ 20 nm。TEM图像中SPION@CMD相对于DLS的小尺寸可能是通过DLS在水溶液中测量含有表面结合水层来确定cmd包覆SPIONs的水动力直径，而TEM估计的是干燥SPIONs的实际芯尺寸。然而，TEM图像中较大的尺寸可能是由于粒子间的范德华力使较小的spion具有较高的聚集倾向[32］．SPIONs的小尺寸和修饰表面积导致超顺磁性行为[33，34］．通过XRD谱图分析，合成的SPION@CMD的晶粒尺寸由Sherrer方程评定，晶粒尺寸较小，为7.95 nm。这样小的尺寸可能与单晶的尺寸有关，而TEM图像揭示了粒子的尺寸。然而，稍高的尺寸可能是最佳的增强r₂relaxivity [35，36］．此外，小尺寸SPIONs增加了表面体积比，因此增加的死层成分降低了磁化强度(米_年代)[37］．

图像(先生T₂-加权成像)SPION@CMD和SPION@CMD@triptorelin在水环境中通过改变SPIONs的浓度来评估明显的对比。因此，SPION@CMD@triptorelin可以考虑作为靶向阴性造影剂。的r₂SPION@CMD和SPION@CMD@triptorelin的值估计为31.75 mM⁻¹·年代⁻¹和26.50毫米⁻¹·年代⁻¹分别通过1.5 T常规MRI系统的磁松弛测量。尺寸、质量磁化强度(米_年代)，和磁场强度都是影响的因素r₂值(38，39］．与以往的研究一致，得到r₂表示,T₂相对论还取决于SPIONs的浓度。研究还表明，SPIONs的尺寸越大，磁场越强，其强度越高r₂/r₁．的高价值r₂/r₁比表示T₂对比剂(40，41］．在本研究中，计算r₂/r₁表明SPION@CMD@triptorelin是临床磁场强度阴性造影剂的良好候选。

5.结论

本研究通过共沉淀法成功合成了GnRH +癌细胞靶向探针SPION@CMD@triptorelin，其平均尺寸为31 nm。T₂用常规MRI测定了氢质子在不同浓度水溶液中的弛豫时间。T₂relaxivities (r₂)为31.75 mM⁻¹·年代⁻¹和26.50毫米⁻¹·年代⁻¹分别登录SPION@CMD和SPION@CMD@triptorelin。此外,r₂/r₁计算出靶向SPIONs的比例为10.26;这一发现证明了合成的SPION@CMD@triptorelin在低浓度的常规MRI系统中作为适当的靶向阴性造影剂的潜在用途。此外，体外细胞活力测定表明，SPION@CMD@triptorelin在浓度达到0.7 mM时没有显示细胞活力降低。我们的研究结果表明，SPION@CMD@triptorelin在未来可以作为一种靶向治疗剂用于提高诊断和治疗的应用。可以得出结论，SPION@CMD@triptorelin载重抗癌药物为MRI制剂和药物的特异性传递提供了一个治疗平台。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据包含在文章中。

信息披露

本文提供的数据是马什哈德医科大学医学物理系硕士论文的一部分。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

该研究得到了马什哈德医学科学大学研究副主任(批准号:971737)。

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