基因共表达分析确定外伤性脑损伤后动态变化的功能模块

摘要

创伤性脑损伤(TBI)是成人和儿童人群发病和死亡的主要原因。然而，脑外伤后基因表达谱的动态变化尚未完全了解。在本研究中，我们鉴定了TBI后的差异表达基因(DEGs)。值得注意的是，Serpina3n、Asf1b、Folr1、LOC100366216、Clec12a、Olr1、Timp1、Hspb1、Lcn2、Spp1被认为是具有最高统计学意义的前10位。加权基因共表达分析(weighted gene coexpression analysis, WGCNA)从DEGs中鉴定出12个功能模块，这些模块随着时间的推移表现出特定的表达模式，并通过富集分析进行了表征。其中黑色和蓝绿色模块主要参与能量代谢和蛋白质翻译。绿黄模块Hmox1、Mif、Anxa2、Timp1、Gfap、Cd9、Gja1、Pdpn、Gpx1与脑损伤反应相关，说明Hmox1、Anxa2、Timp1等基因的表达对脑损伤具有保护作用。绿黄色模块突出了参与微胶质细胞激活的基因，如Tyrobp、Cx3cr1、Grn、Trem2、C1qa和Aif1，这表明这些基因与TBI引起的炎症反应有关。这些基因的上调已经在一个独立的数据集中得到验证。这些结果表明，激活小胶质细胞的关键基因可能成为脑外伤的一个有前途的治疗靶点。 In summary, the present study provided a full view of the dynamic gene expression changes following TBI.

1.简介

创伤性脑损伤(TBI)通常是由头部的突然创伤引起的，但其对患者的有害影响可能是终身的和动态的[1，2］．它是全世界死亡率和长期残疾的一个突出原因，也是神经和心理疾病的一个公认的危险因素，如阿尔茨海默病、慢性创伤性脑病、抑郁症和精神病[3.，4］．这种由TBI引起的慢性后果现在对TBI幸存者和社会都构成了巨大的负担，然而，建立针对慢性TBI组织损伤和神经退行性变进展的治疗干预措施仍然是一个挑战，因为我们对TBI后果背后长期和不断演变的致病机制的了解非常有限。

据认为，慢性创伤性脑炎症在tbi后神经退行性变中起着关键作用，人们正在努力解决一系列tbi后间隔的代谢组学、蛋白质组学和基因组学变化，希望确定潜在的长期生物标志物，以确定损伤进展[2，5，6］．先前的一项研究提供了TBI患者体液中12种生物标志物的时间分布，证明了TBI的严重程度与每个分子的峰值高度之间存在关联，并提示不同类型分子的释放机制可能不同，这进一步提示了连续测量对于TBI诊断至关重要[7］．利用微阵列分析，最近的一项研究描述了TBI动物模型中免疫介质和脑损伤诱导因子以及再生免疫调节基因的异常表达，并指出这种基因表达异常在初始损伤后可能会持续很长时间[8］．同样在实验性创伤性脑损伤中，在损伤早期的神经元中发现了星形胶质激活标志物Serpina3n的高水平表达[9］．同时，在另一项研究中观察到敲除Serpina3n导致神经元细胞凋亡增加，mmp2特异性抑制剂可能作为神经创伤的治疗靶点[10］．此外，Trem2和Tyrobp已被确定为TBI的主要调控因子和治疗靶点[11，12］．本研究中，为了更好地捕捉tbi后各时间点的基因表达动态及相关生物学功能，我们通过差异表达分析和共表达分析来识别共表达模块，并通过过度表达富集分析对其功能进行表征，以期揭示一些参与tbi后动态变化的关键基因。

2.材料与方法

2.1.基因表达数据

皮层组织的基因表达数据从gene expression Omnibus (GEO)上下载，登录GSE111452 [8］．本研究共收集了60份样品进行分析。表达值归一化至第75百分位强度。此外，用于验证的基因表达数据来自GEO，登录号为GSE79441 [13]并归一化为每千万分之一片段(FPKM)。

2.2.差异表达基因

在每个时间点对对照、假手术和TBI样本进行两两比较，进行差异表达分析。基于fpkm的基因表达数据进行对数变换。对于每一个比较，采用R limma包来鉴定差异表达基因[14］．的数值调整为错误发现率(FDR)，以避免多重统计检验的假阳性。

2.3.共表达式网络与功能模块

采用加权基因共表达网络分析(weighted gene coexpression network analysis, WGCNA)鉴定功能模块[15］．具体来说，选取无标度拓扑最适合的软阈值功率。利用差异表达基因的功率和表达数据计算拓扑重叠矩阵(TOM)相似度。

2.4.过度代表富集分析(ORA)

采用过度表征富集分析方法，识别功能模块内基因富集的基因本体(GO)生物学过程。采用超几何检验方法计算值，并在R clusterProfiler包中实现[16］．

2.5.随机森林分类器

利用7个功能模块的枢纽基因表达水平进行分类器训练和验证。随机划分训练集和验证集，用于构建分类器并评估分类器的预测性能。采用re1071软件包(https://cran.r-project.org/web/packages/e1071/index.html)．

2.6.统计分析

学生对双样本和多样本比较进行了测试 -分别为检验和方差分析(ANOVA)。斯皮尔曼相关和对应通过计算该性状与枢纽基因之间的值来评价模块-性状关系。采用Kolmogorov-Smirnov检验TBI对上调基因中6个小胶质细胞活化相关基因的富集情况。

3.结果

3.1.外伤性脑损伤失调基因的鉴定

为了鉴定外伤性脑损伤(TBI)导致的基因失调，我们收集了损伤后24小时、2周、3个月、6个月和1年大鼠皮层的基因表达数据，以及相应的阴性对照组(naïve组)，共4个重复。具体来说，我们在五个时间点分别鉴定出806、628、113、114和94个差异表达基因(DEGs)(图1(一))．deg的数量随着时间的推移而减少。此外，24小时和2周时间点比其他时间点共享更多的deg(图1 (b)；费雪精确检验，值< 0.001)，表明时间间隔越短，基因表达谱越相似。相比之下，从3个月到1年的中晚期，共享的DEGs要少得多，这表明在创伤性脑损伤后，基因表达谱随着时间的推移而动态变化。

此外，我们确定了排名前10位的deg包括Serpina3n、Asf1b、Folr1、LOC100366216、Clec12a、Olr1、Timp1、Hspb1、Lcn2、Spp1(图11)1 (c))．值得注意的是，Serpina3n达到了最高的统计学意义，并且在TBI组早期和中期都被观察到上调(图1 (c)而且1 (d))．这些结果表明Serpina3n可能在TBI中起关键的调节作用。

3.2.TBI涉及功能模块的识别

由于这些基因之间可以相互协作，并作为一个功能模块共表达，因此我们利用加权基因共表达网络分析(weighted gene coexpression network analysis, WGCNA)构建了加权基因共表达网络来识别功能模块，可用于寻找高相关性基因的聚类(模块)。具体来说，我们从WGCNA的deg(补充表)中确定了12个功能模块S1,图2(一个))．值得注意的是，每个模块中的基因表现出高度相似的表达模式(图2 (b))．为了进一步将功能模块与样本的特征相关联，我们进行了相关分析，发现黄色、蓝绿色、绿色和棕色模块在24小时和2周与TBI高度相关，而这些模块在中后期与TBI相关性较低(图2 (c)；值< 0.05)。特征基因的差异表达分析显示，与对照组相比，TBI样本中包括黄色、绿黄色、蓝绿色、黑色、棕色、紫色和粉红色在内的模块高度失调(图2 (d)；值< 0.05)。

3.3.WGCNA模块的功能描述

为了进一步表征WGCNA模块的生物学功能，我们对7个tbi相关模块中的基因进行了基因集富集分析。其中黑色和蓝绿色模块主要参与能量代谢和蛋白质翻译(图3(一个))．绿色、黄色和黄色模块与对伤害的反应有关(图3(一个))．此外，棕色、粉色和紫色模块的特征是神经系统相关的生物功能(图3(一个))．值得注意的是，编码核糖体蛋白的基因如RPL和RPS家族基因在绿松石模块中经常被鉴定出来(图3 (b))．Hmox1、Mif、Anxa2、Timp1、Gfap、Cd9、Gja1、Pdpn、Gpx1参与损伤反应，提示这些基因可能是TBI的反应(图3 (b))．黄绿色模块突出了参与微胶质细胞激活的基因，如Tyrobp, Cx3cr1, Grn, Trem2, C1qa和Aif1(图3 (b))，表明这些基因与TBI引起的炎症反应有关。

3.4.通过模块内的中心基因预测疾病表型

如图所示4(一)7个模块共包含962个基因。其中，黄色模块和棕色模块分别在早期上调和下调，但在中后期恢复正常(图4 (b))．绿松石模块在早期和中期上调，但在后期恢复正常。此外，粉红色模块在6个月时上调，但在1年时下调。这些结果表明，tbi相关模块随时间动态变化。

由于7个模块中的基因在TBI和对照之间表现出明显不同的表达模式，我们随后测试了它们对TBI和对照样本的分离能力。样本随机分为训练组( ）和测试( ）集合，并基于训练集中的枢纽基因构建分类器。在验证集中，分类器获得了更高的曲线下面积(AUC)，为0.895。必威2490 )．这些结果表明，枢纽基因与TBI密切相关。

3.5.脑外伤后早期和中期炎症反应与小胶质细胞活化有关

由于绿黄色模块中的基因丰富了小胶质细胞的激活，我们随后测试了参与小胶质细胞激活和炎症反应的关键基因的表达模式。具体而言，我们观察到Trem2、C1qa、Aif1、Grn、Cx3cr1、Tyrobp等关键基因在早期和中期持续上调(图5(一个)；值< 0.05)。为了证实这一发现，我们收集了3个TBI和3个对照样本的独立基因表达数据。与对照组相比，TBI样本中六个关键基因一致上调(值< 0.05;数字5 (b))．此外，这些基因通过TBI (Kolmogorov-Smirnov’s test，值< 0.05;数字5 (c))．此外，这6个基因也参与了白细胞活化和炎症反应(图3 (b))．这些结果表明，小胶质细胞活化和6个关键基因与脑外伤后早期和中期的炎症反应有关。

4.讨论

创伤性脑损伤(TBI)是成人和儿童人群发病和死亡的主要原因。然而，脑外伤后基因表达谱的动态变化尚未完全了解。具体来说，我们发现，随着时间的推移，deg的数量逐渐减少，并且从3个月到1年的中晚期，共享的deg数量要少得多，这表明创伤性脑损伤后基因表达谱随着时间的推移发生了动态变化。相应地，在脑外伤后的脑组织中也观察到表观遗传动态变化[17］．其中，Serpina3n、Asf1b、Folr1、LOC100366216、Clec12a、Olr1、Timp1、Hspb1、Lcn2、Spp1为差异有统计学意义的前10位。值得注意的是，Serpina3n已被发现是TBI后神经炎症的一个有希望的靶点[18］．Timp1被认为对小鼠创伤性和缺血性脑损伤具有神经保护作用[19］．此外，Lcn2(脂脂素-2)通过蛋白酶激活受体-1激活凝血酶诱导的脑损伤上调[20.］．这些结果表明，这些deg与TBI高度相关。

WGCNA从DEGs中鉴定出12个功能模块，这些模块随着时间的推移表现出特定的表达模式，并通过富集分析进行了表征。其中黑色和蓝绿色模块主要参与能量代谢和蛋白质翻译。先前的一项研究表明，脑外伤后葡萄糖代谢发生了改变[21］．绿黄模块Hmox1、Mif、Anxa2、Timp1、Gfap、Cd9、Gja1、Pdpn、Gpx1与脑损伤反应相关，表明Hmox1、Anxa2、Timp1等基因的表达具有保护脑损伤的作用[19，22，23］．绿黄色模块突出了参与微胶质细胞激活的基因，如Tyrobp、Cx3cr1、Grn、Trem2、C1qa和Aif1，这表明这些基因与TBI引起的炎症反应有关。这些基因的上调已经在一个测试数据集中得到验证。一致地，通过基因共表达网络，Tyrobp和Trem2被确定为创伤性脑损伤后人类apoe表达小鼠的主要中枢[12］．此外，Tyrobp和Trem2可能是TBI的一个很有前景的治疗靶点。GRN蛋白与活化小胶质细胞中溶酶体生物生成的增加有关，并可加剧创伤性脑损伤后的神经元损伤[24］．这些结果表明，激活小胶质细胞的关键基因可能成为脑外伤的一个有前途的治疗靶点。

此外，本研究还存在样本量小、基因表达谱动态变化的独立验证数据集、缺乏实验验证等局限性。然而，本研究仍然提供了TBI后基因表达动态变化的完整视图。

数据可用性

本研究中使用的数据可在基因表达Omnibus (GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)，以供参考。

利益冲突

作者宣称他们没有利益冲突。

作者的贡献

f.l.和X.X.设计了这项研究。郑志中、丁伟文和荣志进行了数据分析、可视化和实验。郑宗宗、狄卫文、x.x、f.l和t.p.对论文的撰写和数字的设置都有贡献。赵志杰、魏东坡和郑瑞哲对这项工作做出了同样的贡献。

致谢

本研究由上海交通大学医学院同仁医院人才培养计划资助:“同仁新星”(No. 2019shtrxx10)。

补充材料

补充表S1:各功能模块及其对应的共表达基因。（补充材料）

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