基于生物信息学分析的肺腺癌相关Hub基因鉴定

摘要

肺腺癌(LUAD)是一种恶性肺部肿瘤。然而，其病理尚未完全了解。本研究的目的是通过生物信息学方法鉴定与LUAD相关的枢纽基因。本研究使用从gene expression Omnibus (GEO)数据库下载的GSE116959、GSE74706和GSE85841三个基因表达数据集。利用limma包筛选与LUAD相关的差异表达基因(DEGs)。基因本体(Gene Ontology, GO)和KEGG分析通过DAVID网站进行。通过STRING网站绘制差异表达基因的蛋白-蛋白相互作用(PPI)，并将结果导入Cytoscape进行可视化。然后利用MCODE对PPI网络进行分析，利用cytoHubba找到得分大于5分的模块。最后，利用GEPIA数据库和UALCAN数据库对hub基因的存活进行验证和分析。我们从三个LUAD数据集中鉴定出67个上调基因和277个下调基因。 The results of GO analysis showed that the downregulated genes were significantly enriched in matrix adhesion and angiogenesis and upregulated differential genes were significantly enriched in cell adhesion and vascular development. KEGG pathway analysis showed that the differential genes of LUAD were significantly enriched in viral carcinogenesis and adhesion spots. The PPI network of differentially expressed genes consists of 269 nodes and 625 interactions. In addition, three modules with scores greater than 5 and seven hub genes, namely, MCM4, BIRC5, CDC20, CDC25C, FOXM1, GTSE1, and RFC4, playing an important role in the PPI network were screened out. In this study, we obtained the hub genes and pathways related to LUAD, revealing the molecular mechanism and pathogenesis of LUAD, which is helpful for the early detection of LUAD and provides a new idea for the treatment of LUAD.

1.简介

肺癌是迄今为止尚未找到有效治疗方法的恶性肿瘤之一。腺癌是最常见的组织学亚型，约占所有肺癌的一半[必威24901］．由于大多数肺癌在局部或远处扩散后被诊断为晚期，这种疾病在世界范围内具有很高的死亡率[2］．尽管有多种治疗方法，包括手术、放疗和靶向治疗，但不幸的是，LUAD的有效治疗存在重大障碍，肺腺癌患者的总生存期不到5年[3.］．如果能在早期发现疾病，患者的生存率将大大提高。有研究指出，许多生物标志物与肿瘤的发生发展密切相关，可用于肿瘤的早期筛查。然而，许多生物标志物在各种肿瘤中高表达，但没有良好的特异性[4］．因此，有必要探索LUAD早期诊断的特异性生物标志物。近年来，基因表达谱芯片被广泛应用于各种疾病的研究领域，揭示疾病与基因之间的联系，为疾病的发病机制提供有价值的线索，以确定癌症的诊断和预后[5］．生物信息学方法被广泛应用于肺腺癌的研究，MCODE [6]用于在庞大的基因功能模块网络中构建聚类。这些模块在PPI网络中的连接对于分子复合物的预测是必不可少的。为了进一步发现复杂网络的关键基因，本研究提出了结合MCODE和cytoHubba的研究方法。根据网络中节点的属性，就可以找到与疾病相关的基因。

在这项研究中，从GEO下载了三个肺腺癌数据集。通过比较肺腺癌样本与正常样本的基因表达，获得差异表达基因。然后利用GO和KEGG信号通路富集分析对deg进行功能标注和信号通路分析。最后，在分子水平上研究了LUAD发生发展的机制。基因表达水平通过GEPIA验证[7]，用UALCAN分析预后[8］．这可能为今后LUAD的诊断和预后提供有价值的思路。

2.材料与方法

2.1.数据预处理与相关分析

本文利用limma包获得差异表达基因。将数据分为正常组和患病组，分别进行差异分析，提取三个数据集上不同的差异基因。筛选差异表达基因的标准为 而且 在本文中。三个数据集的差异分析结果是交叉的，三个数据集共有的基因是本研究接下来分析的基因。维恩图在线工具用于制作交叉基因的维恩图。大卫(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)是一个用于差异基因功能注释和通路富集在线分析的数据库。GO分析从分子功能(MF)、生物过程(BP)、细胞成分(CC)三个部分描述基因，找出显著富集的GO项。KEGG通路富集分析将差异基因丰富为通路，有利于发现基因、通路、疾病之间的关联程度。在本研究中，我们选择 GO分析和KEGG通路富集分析。

2.2.中枢基因PPI网络结构及预后分析

通过构建蛋白质-蛋白质相互作用网络，可以可视化蛋白质与蛋白质之间的关系，推导蛋白质之间的功能相关性。它是通过STRING数据库(http://string-db.org)，选择综合得分大于0.5的互动。利用Cytoscape软件对PPI网络进行可视化，利用分子复杂性检测(MCODE)方法筛选出度截断值为2、节点得分截断值为0.2、 -核心值为2，最大深度为100。筛选出得分大于5分的网络，使用cytoHubba插件进行分析，筛选出得分大于10分的枢纽基因。GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/)是一个免费的在线可视化平台，用于分析癌症组织和正常组织之间特定基因表达水平的差异。UALCAN (http://ualcan.path.uab.edu)是一个非常有效和方便的网站，用于分析癌症数据。本研究利用本网站对枢纽基因进行生存分析，验证基因与疾病的相关性。为了使这项研究的结果更加可信，癌症中枢基因的评估被非常著名的在线网站Kaplan-Meier (https://kmplot.com/analysis/)，可用于评估mRNA、miRNA和蛋白质对21种癌症生存率的影响以及基因表达信息的影响。将meta分析的临床预后价值与生存研究相结合，发现并验证相关分子标志物。

3.结果与讨论

3.1.基因表达谱数据

本研究使用的数据来自GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)收录了世界各地研究机构提交的各种高通量基因表达数据，可供专家学者免费使用。GSE116959基于GPL17077平台(Agilent-039494 Sure Print G3 Human GE V2 8x60K Microarray 039381)，由68个样本组成，包括11个正常肺组织和57个LUAD样本。GSE74706基于GPL13497平台(Agilent-026652 Whole Human Genome Microarray 4x44K V2)， 36个样本，包括18个无肿瘤肺组织和18个肿瘤组织。GSE85841基于GPL20115平台(Agilent-067406 Human CBC lncRNA + mRNA microarray V4.0)，包含8个LUAD样本和8个相邻的非肿瘤组织。本研究选取的数据均满足三个条件:(1)样本均来自人体肺组织，(2)样本量≥16，(3)包含对照组和实验组。平台和一系列矩阵文件以TXT格式下载，数据集信息如表所示1．

3.2.deg的鉴定

GEO网站上的三个数据集使用了limma包[9]进行差距分析;我们建立了小于0.05，且 大于1为标准。共得到3051个上调基因和3817个下调基因，如图所示1．3个LUAD数据集中重叠的上调基因数为67个，如图所示2(一个)，三个数据集中重叠的下调基因数为277，如图所示2 (b)．

3.3.脱氧核糖核酸GO分析及KEGG通路富集分析

为了了解LUAD中差异基因的生物学功能，在DAVID网站上进行了差异基因的GO分析和KEGG通路分析，从基因功能和通路分析两个重点进行解读。GO分析结果显示，上调基因和下调基因的前15个GO项列在table中2(一个)而且2 (b),分别。在分子功能(MF)方面，下调的DEGs主要在蛋白激酶抑制剂活性(GO: 0004860)、整合素结合(GO: 0005178)和离子通道结合(GO: 0044325)方面发挥作用。DEGs的上调在蛋白质异构化活性(GO: 0046982)、DNA结合活性(GO: 0003677)和丝氨酸内肽酶活性(GO: 0004252)等方面发挥作用。在生物学功能(BP)方面，下调的DEGs在细胞基质粘附(GO: 0007160)、RNA聚合酶II启动子转录(GO: 0045944)和血管生成(GO: 0001525)方面显著富集。上调的DEGs在肺血管发育(GO: 0060426)、细胞粘附(GO: 0007155)和细胞外基质组织(GO: 0030198)中尤其丰富。细胞成分(CC)分析显示，下调的DEGs集中在囊泡(GO: 0031982)、溶酶体(GO: 0005764)和转录因子复合物(GO: 0005667)中。上调的DEGs主要集中在细胞外间隙(GO: 0005615)、蛋白细胞外基质(GO: 0005578)和细胞外基质(GO: 0031012)。

根据KEGG通路分析，表3.显示DEGs主要集中在病毒致癌作用(HSA05203)、粘附斑块(HSA04510)、肌动蛋白细胞骨架调控(HSA04810)、cAMP信号通路(HSA04024)、cGMP-PKG信号通路(HSA04022)。

3.4.PPI网络构建与模块分析

使用STRING数据库构建PPI网络，然后使用Cytoscape软件对三个数据集的deg进行可视化。利用Cytoscape中的MCODE插件对PPI网络进行进一步分析，最终筛选出三个得分大于5的模块。PPI网络的构建涉及269个节点，625个交互，如图所示3.．MCODE筛选出3个模块，共38个节点，140个交互，如图所示4．344个差异表达基因中有10个不在PPI网络中。当cytoHubba应用于这三个模块时，选择了得分大于10的基因，说明MCM4、CDC20、CDC25C、BIRC5、FOXM1、GTSE1、RFC4等基因可能在LUAD的发病中发挥重要作用。

3.5.轮毂基因表达水平及预后分析

根据GEPIA数据库的结果，7个枢纽基因在LUAD中均上调(图5)．然后利用UALCAN数据库对hub基因进行预后分析，结果显示MCM4、CDC20、CDC25C、GTSE1的表达显著缩短了LUAD患者的生存时间(图6)．最后通过Kaplan-Meier生存曲线也证明了UALCAN数据库中低表达组LUAD患者的生存率明显高于高表达组(图7)．可以发现这与图中得到的结果是一致的6．

4.讨论

虽然世界医疗水平有了很大的提高，但目前仍没有完全治愈肺腺癌的有效方法。此外，由于肺腺癌发展迅速，疾病早期无明显症状，因此研究与肺腺癌相关的致病基因具有重要意义。随着生物信息学的快速发展，微阵列技术越来越多地应用于研究癌症的诊断、治疗和预后[10］．

本研究从GEO数据库中下载了3个LUAD基因表达数据集。共筛选出67个上调差异基因和277个下调差异基因用于后续分析。为了进一步了解这些差异基因的生物学功能，我们对这些差异基因进行了GO分析和KEGG通路分析。

GO分析显示，BP中参与细胞黏附、细胞外基质组织和骨骼系统发育的重要基因升高，而高度参与神经系统发育、血管生成和细胞基质黏附的基因差异降低。现有文献表明，细胞黏附减弱是癌症转移的关键因素[11]，与我们的GO结果一致。遗传变异和CC结果表明，主要作用在细胞外空间、细胞外面积、细胞外基质蛋白类的增加，通过基因在细胞骨架、溶酶体、小泡中的差异发挥作用，而肿瘤中的细胞质基质实际上调节了肿瘤细胞和癌症相关基质细胞的各个方面[12］．在MF方面，上调的差异基因在DNA结合、蛋白质异二聚体活性和生长因子结合方面显著富集，下调的差异基因在转录因子结合、整合素结合和离子通道结合方面显著富集，胰岛素生长因子在癌症的发生发展中发挥重要作用[13，14］．异二聚是一种重要的机制，其激活的erbB受体在许多癌症中高度表达，尤其是乳腺癌、卵巢癌和非小细胞肺癌[15]，进一步证实了我们GO分析结果的准确性。

KEGG通路分析显示，差异表达基因在病毒致瘤通路和粘连斑块中显著富集。致癌病毒选择细胞过程来复制和破坏免疫识别，通过共享的宿主细胞靶标和途径促进致癌[16］．在影响癌细胞耐药的许多微环境因素中，细胞与细胞外基质(ECM)的粘附已被确定为一个关键决定因素[17］．

为了更好地理解这些deg之间的关系和相互作用，我们使用Cytoscape软件可视化了deg编码蛋白的PPI网络，并高度筛选出7个枢纽基因，即MCM4、CDC20、CDC25C、BIRC5、FOXM1、GTSE1和RFC4。MCM4突变破坏正常的复制控制，影响有丝分裂阶段，进而影响DNA复制，导致DNA断裂。基因组的不完整性大大增加了癌症的易感性;例如，携带MCM4 Chaos3亚型等位基因的小鼠最终会患上乳腺癌[18］．BIRC5，也被称为survivin，是一种著名的癌症治疗靶点。通过寻找survivin-伴侣蛋白相互作用破坏抑制剂和survivin同二聚体破坏抑制剂，发现其中一些抑制剂可以降低乳腺癌、非小细胞肺癌和胰腺癌等癌症中survivin的表达[19］．CDC20是细胞分裂周期20的同源物，是细胞分裂后期的重要激活因子。Cdc20通过激活APC E3连接酶起作用，该连接酶在中后期转变过程中破坏关键的细胞周期调节因子。此外，Cdc20的缺失也会导致有丝分裂停滞，导致细胞死亡[20.］．CDC20不仅在非小细胞肺癌中上调，在其他恶性肿瘤中也上调，并与患者预后相关[21］．研究表明MCM4、BIRC5和CDC20是潜在的肺癌驱动基因，这些基因在肺癌患者的基因组中被放大，当它们的数量减少时，癌细胞的数量也会减少[22］．CDC25C是一种典型的双特异性磷酸酶，可调节CDK1的去磷酸化和细胞周期蛋白B1/CDK1复合物的核进入，这是调节细胞分裂开始的关键机制，在控制细胞周期中发挥重要作用[23］．CDC25C在细胞周期中的调控受多种信号通路的影响，与肿瘤发生、肿瘤发展密切相关。FOXM1是叉头家族的致癌转录因子，通过组织损伤或氧化应激表达，在成熟细胞中由有丝分裂刺激诱导。FOXM1的异常表达已被证明在各种肿瘤细胞的增殖和周期进程中起着非常重要的作用[24］．研究表明，FOXM1通过在转录水平调控靶基因的表达存在于大多数人类癌症中[25］．GTSE1是由人GTSE1基因编码的细胞周期相关蛋白，主要调控G1/S细胞周期转变。既往研究表明，GTSE1的高表达与多种癌症的耐药有关，GTSE1的不表达可显著促进NSCLC细胞IR后的凋亡[26］．RFC4是复制因子C家族(RFC)中的一个基因。既往研究表明，在多种恶性肿瘤中，具有生物活性的rfc可能在癌细胞的增殖、进展、侵袭、转移等过程中发挥重要作用，证实rfc可作为癌症诊断和预后预测的有效标志物[27］．

5.结论

本研究通过生物信息学鉴定了7个中枢基因。为了验证这些基因是否与LUAD相关，我们分别使用GEPIA数据库和UALCAN数据库进行验证和生存分析。结果显示，与正常肺组织相比，这些基因均上调，MCM4、CDC20、CDC25C和BIRC5上调明显缩短了LUAD患者的生存时间。因此，我们认为这些枢纽基因在肿瘤的发生发展中起着关键作用，尤其是MCM4、CDC20、CDC25C和BIRC5这四个基因，似乎是未来研究LUAD诊断和预后的重要依据。

数据可用性

数据来自DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov/)和GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)．

利益冲突

作者声明，这篇论文的发表不存在利益冲突。

作者的贡献

王帅群对数据分析、方法论和文章写作有贡献。徐晓玲在调查、人物构建、验证等方面做出了贡献，与王帅群的贡献相当。孔伟参与了文章的监督和写作。所有作者都对这篇文章做出了贡献，并批准了提交的版本。

致谢

本研究得到国家自然科学基金(No. 61803257)和上海市自然科学基金(No. 18ZR1417200)的资助。

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