斯里兰卡毛细血管扩张共济失调患者ATM基因的6个新变异

摘要

简介．共济失调毛细血管扩张症是一种罕见的遗传疾病，估计发病率为四万分之一至十万分之一。这种情况主要影响神经和免疫系统。其特点是儿童早期开始出现进行性共济失调。与此相关的神经系统缺陷会影响一个人的平衡、协调、行走和说话能力，并可能伴有舞蹈病、肌阵挛和神经病变。他们也可能有眼部毛细血管扩张和高水平的血液甲胎蛋白(AFP)。共济失调毛细血管扩张突变基因(ATM)与这种情况相关，并编码ATM蛋白，这是一种磷脂酰肌醇3激酶。该基因位于11q22-23染色体上，占150kb，包含66个外显子，编码13kb转录本。ATM是一种相对较大的蛋白质，分子量为350 kDa，含有3056个氨基酸。方法．四名斯里兰卡籍的患者表现为毛细血管扩张共济失调，我们将他们转到我们的遗传中心进行专门的遗传咨询和检测。采用全外显子组测序和Sanger测序来确认候选变异。对已鉴定的变异进行蛋白质建模和基因型与表型的相关性研究。结果．我们在4例毛细血管扩张共济失调患者中观察到6个新的ATM基因变异。已鉴定的变异如下:纯合子c.7397C >a (p.Ala2466Glu)和c.510_511delGT (p.Tyr171fs)和复合杂合子c.5347_5350delGAAA (p.Glu1783fs)和c.8137A > T (p.Arg2713 ）和C . 1163a > C (p.Lys388Thr)和C . 5227a > C (p.Thr1743Pro)。变异分析之后，建模的自然和改变的蛋白质结构。结论．我们报告的小说自动取款机对毛细血管扩张共济失调的分子诊断有意义的基因变异。

1.简介

共济失调毛细血管扩张突变基因(ATM)编码ATM蛋白，这是一种响应DNA损伤的磷脂酰肌醇3激酶。它是DNA修复和细胞周期控制的关键基质[1，2］．ATM基因在11q22-23号染色体上占据150kb的空间，包含66个外显子，编码13kb的转录本。ATM是一种相对较大的蛋白质，分子量为350 kDa，含有3056个氨基酸。许多ATM转录本具有几乎相同的9.2 kb的开放阅读框，并表现出大量的5 ' -非翻译区域(5 ' -UTRs)，这些区域是由复杂的可变剪接和若干可变的3 ' -UTRs组成的。3.，4］．共济失调毛细血管扩张(量T;MIM# 208900)是一种由ATM基因双等位基因失活引起的常染色体隐性遗传病[5］．该病的主要特征是小脑退化，以小脑皮质逐渐萎缩为主，并从儿童早期开始导致进行性共济失调。神经功能缺损会影响一个人的平衡、协调、行走和语言能力，并可伴有舞蹈病、肌阵挛、神经病变以及眼部毛细血管扩张，有时还会出现面部皮肤。胸腺退行性变、免疫缺陷、反复肺部感染、躯体生长迟缓、过早衰老、性腺发育不良、淋巴网状恶性肿瘤易感性和对电离辐射的急性敏感性是其他一些相关特征。据报道，AT携带者可能因基因组不稳定或DNA损伤反应综合征而易发生癌症。在世界范围内，AT的流行率估计为四万分之一和十万分之一[6，7］．在本研究中，我们利用下一代测序技术，对4例具有毛细血管扩张共济失调临床特征的患者描述了6个新的ATM基因变异。

2.方法

2.1.选择的病人

经临床诊断患有AT的四名患者被转诊到科伦坡大学医学院人类遗传学部门进行基因检测和咨询。根据斯里兰卡科伦坡大学医学院伦理审查委员会批准的方案，获得患者父母的书面知情同意。

2.2.样本采集和DNA提取

取患者静脉血样本，采用EDTA管，按照制造商的规程使用QIAamp DNA Mini Kit从外周血白细胞中提取基因组DNA [8］．

2.3.新一代测序

患者在Illumina HiSeq平台上进行全外显子组测序，然后根据制造商的协议，使用安吉伦SureSelect人类全外显子+ UTR试剂盒制备文库[9］．利用内部生物信息学管道对配对末端测序数据进行遗传分析。使用BWA‐mem算法和基因组分析工具包(Genome Analysis Tool Kit, GATK)将FASTQ文件与(GRCh37/hg19)人类参考序列进行映射。使用SNP-eff和Refseq、临床数据库和在线人口频率数据库对VCF文件进行注释[10- - - - - -12］．所有序列变异均通过目视比对确认，然后进行Sanger测序。

与AT表型相匹配的基因(ATM、MRE11A和NBS1)和小脑性共济失调相关的其他基因(RAD50、RNF168、APTX、SETX、TWNK、POLG)，4例先证者均进行ABCB7)分析。根据ACMG标准指南(https://www.acgs.uk.com/media/11631/uk-practice-guidelines-for-variant-classification-v4-01-2020.pdf)．In-silico采用功能预测工具研究已鉴定变异的致病性。

2.4.蛋白质建模

使用SWISS-MODEL服务器对ATM蛋白的固有结构和截断结构进行建模。http://swissmodel.expasy.org)．从GenBank中以FASTA格式检索丝氨酸蛋白激酶/共济失调毛细血管扩张症突变ATM蛋白的mRNA序列，GenBank ID: U33841.1。

3.结果

3.1.案例展示

病例1是一名6岁女童，代表非近亲婚姻的两个受影响的兄弟姐妹之一(图1)1(一))．她是在正常妊娠后足月出生的，没有并发症。她在3岁左右出现小脑性共济失调(肌肉之间缺乏协调)和痉挛(肌腱反射增加)。她的脑部核磁共振没有显示异常。甲胎蛋白(AFP)水平为172.2μ克/毫升(升高)。然而，其他血液检查均在正常范围内。她被临床诊断为AT。她没有任何眼部毛细血管扩张或免疫学特征。她的哥哥在早年也表现出类似的小脑性共济失调症状。父母双方都没有受到影响。然而，随着年龄的增长，他们的症状逐渐减轻。目前，这个先证者的书写和行走困难很小，她的弟弟几乎没有症状。

病例2为一名9岁女童，父母是近亲结婚(图2)1 (b))．她正常怀孕，足月出生，没有并发症。她的姐姐和父母都没有受到影响。患者2岁时被诊断为癫痫，7岁左右出现行走困难和其他小脑体征。目前，她经常晕厥发作。她还患有语言障碍、肌张力障碍、震颤、眼部毛细血管扩张和反复呼吸道感染。她的AFP水平在200-300之间μ克/毫升。她的其他血液参数在正常范围内，她的大脑核磁共振扫描没有异常。然而，多年来，她的病情越来越严重。

病例3为一7岁男童，非近亲受孕，妊娠正常，无意外1 (c))．他在童年早期表现出小脑共济失调和行走困难的迹象。2岁时被临床诊断为At。他的血AFP水平升高到320.1μ克/毫升。他的其他血液参数和大脑核磁共振成像都正常。目前，他患有构音障碍、肌张力障碍、眼部毛细血管扩张和反复呼吸道感染。父母及兄弟姐妹无症状，身体健康。

病例4是一个24岁的男性出生的非近亲父母平安无事的怀孕。他表现为迟发性共济失调、构音障碍、肌张力障碍和行走困难。他没有眼部毛细血管扩张或免疫学特征。他还表现出肌张力障碍的迹象。他的症状在过去2年没有任何进展或改善。他的血甲胎蛋白水平只有轻微升高49μG /ml，其他血液参数在正常范围内。他的MRI大脑正常，父母和兄弟姐妹未受影响(图1 (d))．

表中描述了基因型到表型特征以及甲胎蛋白(AFP)水平、神经系统、免疫紊乱和癌症的家族史1．

3.2.变体识别

我们在4例AT患者中观察到6个新的ATM基因变异。变异如下:纯合子c．7397C >a (p.Ala2466Glu)和c.510_511delGT (p.Tyr171fs)与复合杂合子c.5347_5350delGAAA (p.Glu1783fs)， c.8137A > T (p.Arg2713 ）和C . 1163a > C (p.Lys388Thr)和C . 5227a > C (p.Thr1743Pro)。这些变异通过Sanger测序得到证实。

3.3.变异与AT表型的比较

我们将表型严重程度与观察到的每个变异的功能预测进行了比较(表1)．In-silico研究人员利用工具推导出改变的蛋白质结构。

3.4.变异的致病性

本研究中观察到的变异在使用功能预测软件工具(如Mutation Taster、疾病突变)分析时被预测为具有破坏性;Provean有害;Polyphen2,破坏;过滤有害的。被预测为具有破坏性的变异很可能是致病的。

4.讨论和结论

毛细血管扩张共济失调是一种临床异质性神经系统疾病，其原因是ATM蛋白的缺失，这是一种相对较大的蛋白(350 kDa)。它由3056个氨基酸组成2(一个))，属于磷脂酰肌醇3激酶样蛋白激酶家族[13］．据观察，严重形式的AT与ATM蛋白的完全丧失相关，而轻度、缓慢进展或晚发病形式的AT是由非截断型变体引起的，如错义或剪接位点变体，这些变体使细胞内的一些ATM激酶活性残留[14］．到目前为止，ATM基因已有超过1700个变异被报道，其中超过800个变异被证明与AT表型相关(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/gene.php?gene=ATM)．导致ATM蛋白全部丢失的大多数致病变异约占AT表型的75% [必威249015，16］．针对ATM基因和ATM蛋白的完整开放阅读框的cDNA的分子克隆研究表明，该基因与跨物种的几个大蛋白有显著的序列相似性，例如:果蝇酵母和哺乳动物，因为它们都有类似的PI 3激酶结构域。它们的基因突变会产生多种表型，其特征与在受AT影响的人类细胞中观察到的相似[13］．因此，那些存在于物种间高度保守区域的错义变异更有可能是致病的。

在我们的研究中，我们观察到变异类型和表型严重程度之间有类似的相关性。因此，在情形1中，纯合子错义变异(c.7397C > A)位于第48外显子。这个区域有11个重叠的转录本;研究表明，48^th外显子，跨越114 bp，影响与共济失调毛细血管扩张相关的线粒体功能[17，18］．在2466年观测到^th突变蛋白中有一个氨基酸(Ala取代Glu)，而其他氨基酸保持不变(图2)2 (b))．还观察到，单个氨基酸的变化不影响蛋白质的二级和三级结构。然而，这种变化位于跨物种的高度保守的蛋白域(表2)．

在案例2中，纯合移码变体(c.510_511delGT)位于第3外显子上，跨越113 bps。我们观察到由突变mRNA编码的氨基酸在510之前保持不变^th的位置。但是，G和T核苷酸在510上的缺失^th和511年^th位置分别导致剩余mRNA序列中的移码。这一变化导致在511位点之后立即形成一个过早终止密码子^th因此合成了一个只有2708个氨基酸的截断蛋白，而野生型蛋白中有3056个氨基酸2 (c))．AT患者经常出现截断突变，提示基因3’端PI 3-激酶结构域是不可缺少的，因此导致更严重的表型。一些研究表明，截断变异会导致更严重的早期发病AT [19］．

在病例3中，观察到复合杂合子变异。一个是移码(c.5347_5350delGAAA)，另一个是错义变体(c.8137> T)。c.5347_5350delGAAA位于第33外显子上，其区段为96 bps。在mRNA序列的5347-5350位点上删除GAAA核苷酸会导致在5370位点之后立即形成一个终止密码子^th合成了一个1790个氨基酸的截断蛋白2 (d))．该病人的第二种变异是c.8137> T位于52外显子，全长159 bps，有12个重叠转录本。这个变体导致p.Arg2713 *位置的过早终止密码子进一步导致ATM蛋白的截断。在以前的研究中，类似的化合物、杂合子变异体显示了表型异质性和晚发型AT [20.］．然而，当变异位于PI 3-激酶结构域(aa 2857-2915)之外时，这主要被观察到。这表明，催化域外的错义突变可能导致ATM活性残留。然而，我们观察到，这一假设是主观的，因为移码变体位于该领域之外，也导致严重的早期发病形式的AT。

在案例4中，有一个复合杂合错义变体，分别位于第3和32外显子上，分别为C . 1163a > C和C . 5227a > C。根据我们的发现，我们手动改变了mRNA序列中1163A > C和5227A > C的核苷酸。在翻译后的蛋白序列中，发现Lys > Thr在388处有一个替代^th在1743的位置和> Pro^{理查德·道金斯}位置，但其余氨基酸不变。这些复合杂合子变异似乎对蛋白质的3D结构没有显著影响。然而，第二个氨基酸变化(p.Thr1743Pro)似乎发生在跨物种高度保守的区域(表2)．这个病人有晚发型的轻度症状。除了表现为轻度AT的变异外，其他临床特征如肌张力障碍也被描述为晚期表现[19］．

自下一代测序出现以来，ATM基因的变异检测有了很大的进步，因为它是一个相对较大的基因，有63个外显子，没有文献记载的热点区域[21］．目前的研究主要基于高加索人口[22，23］．在东南亚患者中进行的研究不多，也没有描述斯里兰卡AT患者的基因型。识别新的致病变异对基因检测越来越重要，这导致AT分子遗传分析的规模和敏感性发生重大变化。一种新的治疗方法有望逆转功能性ATM激酶缺失的影响[24］．与已经发表的文献一致，我们的研究结果表明，截断变异导致更早发病的疾病，严重程度增加，反之，错误义变异则存在ATM激酶的一些残留活性。总之，我们已经证明了在斯里兰卡患者中导致AT的6个新的ATM基因变异。

4.1.限制

本研究的主要局限性在于样本量。我们希望将WES扩展到其他临床诊断为AT的患者。此外，对于误义变体，功能研究可以补充in-silico分析其对ATM激酶的确切作用。

4.2.未来的工作

应该可以在出生后不久检测到AT，并优先进行早期的遗传研究以确认，因为这将为家庭成员，特别是携带ATM基因变异的家庭成员提供个性化的患者干预和遗传咨询。还可以对他们进行神经系统、免疫系统疾病和癌症的随访，因为他们患恶性肿瘤的风险更高。

缩写

ATM机:	共济失调毛细血管扩张突变
:	共济失调毛细血管扩张
韦斯:	Whole-exome测序
互补脱氧核糖核酸:	互补脱氧核糖核酸
SPDBV:	Swiss-PdbViewer。

数据可用性

数据在公共领域无法获得;它们将根据相关方的要求共享，这是为了维护患者的机密性。

的利益冲突

作者声明不存在利益冲突。

致谢

作者希望感谢他们的合作者和实验室工作人员的贡献。

参考文献

1. K. Savitsky, A. Bar-Shira, S. Gilad等人，“单个共济失调毛细血管扩张基因具有类似PI-3激酶的产物，”科学第268卷，没有。5218页，1749-1753页，1995年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. p·j·麦金农《ATM和共济失调毛细血管扩张症》EMBO报告第5卷，no。8，第772-776页，2004年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. K. Savitsky, T. Uziel, S. Gilad等人，“共济失调-毛细血管扩张:非翻译序列的结构多样性表明ATM基因表达的复杂转录后调控。”核酸的研究第25卷第1期。9，第1678-1684页，1997年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. G.罗特曼和S.优素福，“ATM:从基因到功能，”人类分子遗传学第七卷，没有。10，第1555-1563页，1998年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. A. Fiévet, D. Bellanger等人，“共济失调-毛细血管扩张症患者ATM变体的功能分类，”人类基因突变第40卷，没有。10, pp. 1713-1730, 2019年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. C. Rothblum-Oviatt, J. Wright, M. a . Lefton-Greif, S. a . McGrath-Morrow, T. O Crawford和H. M. Lederman，“共济失调毛细血管扩张症:综述，”罕见病杂志第11卷第1期。1159页，2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. M. F. Lavin和Y. Shiloh，“共济失调-毛细血管扩张症的遗传缺陷，”免疫学年度回顾第15卷，no。1, 1997年第177-202页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. Qiagen.Com, 2020年,https://www.qiagen.com/ch/resources/download.aspx?id=62a200d6-faf4-469b-b50f-2b59cf738962&lang=en．
9. Agilent.Com, 2020年,https://www.agilent.com/cs/library/datasheets/public/SureSelect%20V6%20DataSheet%205991-5572EN.pdf．
10. 指数/酒吧/ Clinvar / Vcf_Grch37”。Ftp.Ncbi.Nlm.Nih。2020年政府,https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/pub/clinvar/vcf_GRCh37/．
11. 基因组聚合数据库(gnomad) | gnomad博客”。Gnomad.Broadinstitute。2020年组织,https://gnomad.broadinstitute.org/blog/2017-02-the-genome-aggregation-database/．
12. 致病性clinvar变异的确切等位基因频率- dave tang的博客。Dave Tang的博客，2020年，https://davetang.org/muse/2017/01/30/exac-allele-frequency-pathogenic-clinvar-variants/．
13. N. J. H. Van Os, A. F. M. Jansen, M. Van Deuren等，“共济失调-毛细血管扩张:免疫缺陷和生存，”临床免疫学， vol. 178, pp. 45-55, 2017。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. M. M. M. Verhagen, J. I. Last, F. B. L. Hogervorst等人，“ATM蛋白和残余激酶活性与共济失调-毛细血管扩张症的表型相关:一项基因型-表型研究。”人类基因突变第33卷，no。3, pp. 561-571, 2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. V. Jacquemin, G. Rieunier, S. Jacob等，“携带ATM错义突变的共济失调毛细血管扩张症患者ATM产物表达不足和异常定位”欧洲人类遗传学杂志第20卷，no。3, pp. 305-312, 2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. a . Pourahmadiyan, P. Alipour, N. Golchin和M. a . Tabatabaiefar，“下一代测序揭示了ATM基因的一种新的致病变异，”国际神经科学杂志，第1-8页，2020。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. f.v. Pallardó， A. Lloret, M. Lebel等人，“一些氧化应激相关遗传疾病中的线粒体功能障碍:共济失调-毛细血管扩张症，唐氏综合征，范可尼贫血和沃纳综合征，”Biogerontology第11卷第1期。4, pp. 401-419, 2010。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. K. Nakamura, L. Du, R. Tunuguntla等人，“日本共济失调-毛细血管扩张症患者ATM突变的功能表征和靶向校正”。人类基因突变第33卷，no。1，第198-208页，2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. S. Gilad, L. Chessa, R. Khosravi等人，“共济失调-毛细血管扩张症和变异的基因型-表型关系，”美国人类遗传学杂志第62卷，no。3，第551-561页，1998年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. S. Saviozzi, A. Saluto等人，“一种迟发性共济失调-毛细血管扩张症的复合杂合子基因型，A8030G/7481insA，”医学遗传学杂志第39卷，没有。1，第57-61页，2002年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. S. Martin‐Rodriguez, a . calvoo - ferrer, N. Ortega-Unanue, L. Samaniego-Jimenez, M. P. Sanz-Izquierdo, and I. Bernardo-Gonzalez，“ATM基因的两个新变体导致共济失调毛细血管扩张，包括90kb的重复:靶向下一代测序在检测拷贝数变异中的应用。”人类遗传学年鉴， vol. 83, pp. 266-273, 2019。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. Y. Shiloh和Y. Ziv，“ATM蛋白激酶:调节细胞对基因毒性应激的反应，以及更多，”《自然评论分子细胞生物学第14卷第1期。4, pp. 197-210, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. E. susitsin, A. Sokolenko, I. Bizin等，“俄罗斯共济失调-毛细血管扩张症儿童ATM突变谱”，欧洲医学遗传学杂志第63卷，no。1、文章ID 103630, 2020。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. D. A. Ovchinnikov, S. L. Withey, H. C. Leeson等人，“修正两名失调性毛细血管扩张患者的iPS细胞ATM突变，恢复DNA损伤和氧化应激反应，”人类分子遗传学第29卷，no。6，第990-1001页，2020年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

betway赞助

betway赞助版权所有©2020 D. Hettiarachchi等人。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可，允许不受限制地在任何媒介上使用、分发和复制，前提是正确引用原作品。