19例腮腺源性涎腺肿瘤的细胞基因组异常分析

摘要

腮腺起源的唾液腺肿瘤(SGTs)是一组因其罕见和形态相似而难以分类的多样化肿瘤。染色体分析可以检测克隆异常，阵列比较基因组杂交(aCGH)分析可以定义肿瘤标本的拷贝数改变(CNAs)。在提交进行细胞基因组分析的19例不同类型的sgt中，9例(47%)检测到异常克隆，14例(74%)检测到CNAs。从这些病例中定义了包括PLAG1基因在8q12处的复发重排、包括6q、9p (CDKN2A)和17p (TP53)缺失、Y染色体丢失和7号染色体获得在内的复发性CNAs。结合核型分析和aCGH分析可以提高诊断率。进一步研究SGT分型与细胞基因组异常的更精确相关性，将有助于更好的诊断和治疗。

1.简介

唾液腺包括三个主要的配对腮腺、下颌腺和舌下腺和位于上颚、嘴唇和颊黏膜的小腺;唾液腺肿瘤是一种罕见的肿瘤，每十万人中约有0.4-13.5例[1］．2005年世界卫生组织(世卫组织)将sgt分为10种良性上皮肿瘤实体和23种恶性上皮肿瘤实体，世卫组织2017年的最新分类列出了新的实体和关键基因组改变[1，2］．

早期的细胞遗传学分析有助于唾液腺肿瘤的诊断[3.- - - - - -6］．在某些类型的sgt中已检测到经常性的染色体异常，如6号染色体长臂的缺失、7号和8号染色体额外拷贝的增加、8q12易位和Y染色体的丢失。采用荧光标记肿瘤和参照dna与正常中期共杂交的比较基因组杂交(CGH)方法分析石蜡包埋sgt的染色体失衡[7，8］．已经报道了一些使用高分辨率阵列CGH (aCGH)检测基因组拷贝数改变(CNAs)和进一步绘制sgt中的候选癌基因和肿瘤抑制基因的研究[9- - - - - -14］．使用细胞遗传学诊断SGT需要反复克隆异常与肿瘤分类的准确关联。有些肿瘤类型属于清晰的细胞遗传学分类，有些肿瘤包含多种不同的异常，而其他的则具有明显正常的核型。在这些情况下，用其他技术补充核型分析可能是有益的。aCGH的使用可以确定可见的染色体失衡和隐性畸变的基因组坐标和基因含量，否则通过染色体分析可能看不到这些。在本研究中，我们对19例sgt进行了核型分析和aCGH分析，以进一步评估其技术应用和临床意义。

2.临床发现和细胞基因组学结果

在腮腺切除术后，收集19例腮腺源性不同类型SGT的肿瘤标本，进行病理和细胞基因组学分析。使用实验室的标准化程序对这些肿瘤的中期扩散进行细胞培养建立、中期准备和核型分析[15］．使用Gentra Puregene Kit (Qiagen)从肿瘤标本中提取DNA。aCGH分析采用SurePrint G3 Human CGH 8 × 60 K Microarray Kit(安捷伦技术公司)，如前所述[16，17］．

这些病例的病理结果包括6例多形性腺瘤(PA)，基底细胞腺瘤(BCA)， Warthin瘤(WT)，嗜酸细胞瘤，唾液管癌(SDC)，霍奇金淋巴瘤(HL)，梅克尔细胞癌(MCC)，鳞状细胞癌(SCC)和6例未指明的sgt标本。核型分析发现9例(47%)克隆异常，aCGH分析发现14例(74%)CNAs。通过人类基因组组合NCBI36/hg18 (https://genome.ucsc.edu/)列于补充表1。19例患者的年龄、性别、病理诊断、腮腺部位、核型结果和主要aCGH表现汇总于表中1。


情况下没有。	性别	年龄(年)	肿瘤分类	核型分析结果	aCGH结果(NCBI36/hg18)	可能的因果/复发性CNAs

1	F	29	多形性腺瘤	46, XX, t (5;8)(p13;q12) [10］	问	LIFR-PLAG1基因融合
2	F	52	多形性腺瘤，右腮腺	46, XX, inv (4)(p11;q25) [15］	问	- - - - - -
3.	米	44	多形性腺瘤，右腮腺深叶	47 xy +r(10/46, xy [5］	问	FGFR1-PLAG1融合可能(8)(p12q12.1)
4	F	75	右腮腺多形性腺瘤	46, XX, inv (8) (q12q24) [6/46, idem, del (6) (q22q25) [7/46, xx [2］	6q23.1-q25.3的29.182 Mb del, 1q、3q、11q、21q和Xp的cna	可能与8q12 (PLAG1)重排，del 6q
5	米	28	左腮腺多形性腺瘤	46, xy [18］	CNAs为10q, 17p, 17q和21q	Del 17p (TP53)
6	米	47	右腮腺多形性腺瘤	46, XY, in (12;2)(q13;p25.1p21) [15］	2q, 3p, 3q, 16q和21q的CNAs	可能是12q13q15 (HMGA2, MDM2)重排
7	F	48	基底细胞腺瘤，左侧腮腺	46, xx [15］	扩增15个，Xp缺失，多个染色体上有大量的cna	Del 6q, dup 17p13.1 (TP53)
8	F	76	Warthin的肿瘤，左侧腮腺	46, xx [18］	6p, 7p, 7q, 16p和18q的CNAs	- - - - - -
9	F	69	嗜酸细胞瘤，右腮腺	47, xx，+7 [5/46, xx [10］	7q、10q和16p的CNAs	+ 7
10	米	65	唾液管癌，右腮腺	46, xy [18］	4q、8q、11q、15q和21q的Y和cna损失	损失Y
11	F	49	霍奇金淋巴瘤，右腮腺	46, xx [18］	问	- - - - - -
12	米	42	默克尔细胞癌，右腮腺	46, xy [18］	3p和10的缺失，3q和5p的获得，以及多条染色体上的cna	- - - - - -
13	米	84	右腮腺鳞状细胞癌	46, xy [18］	问	- - - - - -
14	F	84	未分化,腮腺	61∼66 < 3 n - >, XXX, + X + 1, +德尔(1)(奔跑),德尔(1)(问),我(1)(p10),我(1)(q10)−2,德尔(2)(p13),德尔(3)(p13), + 4 x2,德尔(4)(问),添加(4)(p15),德尔(5)(问),我(6)(p10),德尔(6)(温度系数),−7,添加(7)(第22位)−8日添加(9)(第22位),10−x2 + 11,德尔(11)(q23处)x2−12日添加(12)(p13),添加(14)(侯)−15 x2−17日添加(17)(p13)−18日−19日添加(19)(p13)−21 x2 + 4∼8 3月(cp6)	5q和6q的大量删除，以及9p、9q、10q、17p和18p的CNAs	Del 6q, Del 9p (CDKN2A)
15	米	62	腮腺肿块，淋巴瘤	46, XY, t (4;7)(q12;q22) [5/46, xy [10］	7p、7q、9p和10q的cna	- - - - - -
16	米	77	右腮腺肿块	45, x，−y [3./46, x，−y， +7 [3./46, xy [9］	损失Y	损失Y +7
17	F	69	唾液，基底细胞和腺样体	46, xx [15］	3p的CNA	- - - - - -
18	米	80	腮腺	46, xy [18］	8q的CNAs	- - - - - -
19	F	46	左腮腺	46, xx [18］	3p, 6q, 7q, 16q和21q的CNAs	德尔6问

问:正常;CNAs:拷贝号更改。

6例PA患者均检出细胞基因组异常。病例1有一个异常克隆，表现为周期性易位t (5;8)(p13;q12)，可能与LIFR-PLAG1基因重排导致PA;aCGH正常显示平衡易位。病例2在第4号染色体中有一个异常克隆，其中心倒置，被认为是aCGH与正常结果的平衡重排。病例3克隆异常，有环状染色体，aCGH正常;这种异常克隆可能在组织标本中所占百分比较低，且低于aCGH的检测阈值。病例4有一个茎系克隆，在8q12-q24区域有明显的旁中心倒置，一个副线克隆，在6q处有一个缺失的额外像差;aCGH定义了29.182 Mb的6q23.1-q25.3和6个额外的cna的删除(图1(一))．病例5为正常男性核型和CNAs, 10q21.1、10q23.1-q23.3和21q22.11-q22.12重复，17p13.2-p13.1和17q21.2缺失;17p13.2-p13.1的删除包括TP53基因。病例6克隆异常，在12q13中插入2p25.1-p21片段;aCGH检测到2q33.2-q33.3、3p14.1、3q11.2、16q21重复的CNAs, 21q22.11缺失。

(一)

(b)

(c)

图1

19例sgt检测到细胞基因组异常。(a)病例4的代表性核型为异常克隆，6号染色体长臂缺失，8号染色体长臂旁中心倒置(左);aCGH基因组图显示缺失6q和21q的CNAs, 1q、3q、11p、21q和Xp的重复(右，绿条为缺失，红条为重复)。(b)病例7，染色体分析显示正常女性核型(左);aCGH基因组视图显示多个染色体上存在大量的CNAs(右)。(c)从14例病例中检出的核心细胞分布情况。

病例7为BSA，其女性核型正常，但15号染色体增加，Xp缺失，aCGH使多条染色体上出现大量CNAs(图1 (b))．WT病例8女性核型正常，但CNAs有6p21.1、7q22.1和16p11.2重复，7p21.3和18q21.2-q21.31缺失。例9为嗜酸细胞瘤，7号染色体获得异常克隆;aCGH检测到7q22.1、16p13.3和16p11.2重复的CNAs，在10q11.23-q21.1处有一个缺失。SDC患者10例男性核型正常;aCGH在4p、8q、11q、15q和21q检测到Y染色体丢失和额外的CNAs。HL患者11例女性核型正常，aCGH检查结果正常。MCC患者12例，男性核型正常;aCGH检测到10号染色体的3p, 5p和一个拷贝的大量片段丢失，3q的增加，以及多条染色体上额外的CNAs。SCC 13例男性核型正常，aCGH检查结果正常。

6例腮腺来源不明的SGT, 3例经染色体分析发现异常克隆，aCGH均检出CNAs。病例14为异常的低三倍体无性系，具有复杂的数值和结构重排;aCGH检测到5q21.1-q31.1有33.478 Mb的删除，6q11.1-q27有103.653 Mb的删除，9p22.1-p21.2有多个CNAs的删除(CDKN2A基因)，9q31.1, 10q26.13-q26.3, 17p13.1-p12和18p11.32-p11.21。病例15有一个异常克隆，明显平衡易位t (4;7)(q12;q22)和7q22.1和16p13.3的重复CNAs，在10q11.23-q21.1处有一个缺失。病例16有一个缺失Y染色体的茎系异常克隆和一个附加畸变的7号染色体的副线克隆;aCGH检测到Y染色体缺失。17-19例核型正常，aCGH检测到少量CNAs。

从14例病例中绘制这些CNAs的基因组视图，以确定其在基因组中的分布和复发(图1 (c))．这些CNAs的重叠区域可以用来识别复发片段，用于定位候选癌基因和抑癌基因。除去整个染色体或整个臂的增益和损失，共检测到90个CNAs;38例复发性CNAs位于15个染色体位点2)．

3.讨论

aCGH分析已广泛应用于产前和产后体质拷贝数变异的检测，并显示出显著提高的诊断效能和准确性[19］．然而，由于难以从CNAs中分离克隆异质性，以及缺乏解释异常发现的支持数据库，aCGH在各种癌症中检测体细胞CNAs的应用进展缓慢[16，17］．在该病例系列中，aCGH异常检出率为74%，核型异常检出率为47%。aCGH在检测核型检测不出的隐性CNAs和确定CNAs的基因组坐标和基因含量方面具有明显的优势。然而，结合核型和aCGH的几个技术问题已经被注意到。首先，aCGH不能检测到平衡重排，如病例1、2、4和15所示。其次，aCGH可以通过核型检测到异常的茎系和副系克隆，如病例3和病例16所示。这可能是由于aCGH在检测30%或更少的镶嵌图案时的分析截止[20.］．第三，正常染色体与多个CNAs结果不一致，引起人们对体外细胞培养下肿瘤细胞有丝分裂指数低的担忧。必威2490尽管存在这些技术限制，aCGH的整合确实在定义肿瘤异质性和识别候选肿瘤相关基因的基因组不平衡方面有所改善[18］．

6例PA患者中，1例出现复发性t (5;8)(p13;q12)LIFR-难陀病例3的环状染色体可能来自r (8)(p12q12.1)FGFR1-PLAG1基因融合，病例4可能涉及inv (8) (q12q24)PLAG1基因重排在8q12，病例5在17p有一个缺失，包括TP53基因，病例6有一个ins (12;2)(q13;p25.1p21)，可能涉及重组HMGA2而且MDM212q13q15基因。使用一组探针对这些基因进行荧光原位杂交(FISH)可能非常有助于检测这些复发性重排[21，22］．病例4、病例7、病例14和病例19中6q缺失显示6q13和6q23.1q25.3两个重叠区域。获得性6q缺失是在先前研究中发现的几种sgt中出现的复发性CNAs [4，6- - - - - -8]，并指定了6q23.2和6q27两个关键区域[6］．在以前的研究中也注意到，病例10和16中Y染色体丢失，病例9和16中额外增加了一条7染色体[4，5］．删除9p22.1p21.2，包括CDKN2A病例14中的基因在多种类型肿瘤中是一个已知的复发性CNA。来自经常性CNAs(补充表)2)，在病例9和病例15中检测到10q11.23q21.2处有3 Mb的缺失，这可能涉及PRKG1-MBL2-PCDH15基因又截断了PRKG1而且PCDH15基因，但其临床意义尚不清楚;病例4和病例12在1q41处检测到2mb的缺失USH2A-ESRRG-GPATCH2-SPATA17-RRP15-TGFB2基因又截断了USH2A而且TGFB2基因。TGFB/SMAD通路的中断与多种人类癌症有关。

总之，对这19例sgt的细胞基因组分析发现14例存在克隆染色体重排和CNAs。通过对以往研究结果的比较，确定了复发性染色体重排和可能与sgt相关的CNAs。进一步整合核型、FISH和aCGH可以提高诊断准确性和结果解释。然而，异质细胞基因组异常的存在和缺乏专家共识或生物信息学数据库的支持证据，使得很难将这些结果与sgt关联起来，特别是未指明的sct。未来对具有良好分类的sgt的大量病例队列的研究将有助于建立细胞基因组异常与临床分型之间的精确相关性。

数据可用性

所有数据都包含在正文和补充材料中

利益冲突

作者声明本论文的发表不存在任何利益冲突。

补充材料

补充表1:19例腮腺源性sgt检测出基因组CNAs。补充表2:对复发CNAs和可能候选基因的重叠区域进行排序。（补充材料）

参考文献

A. Rousseau和C. Badoual，“头颈部:唾液腺肿瘤:概述”，唾液腺肿瘤， 2010年第10卷。视图:谷歌学者
R. R. Seethala和G. Stenman，《世界卫生组织头颈部肿瘤分类第四版更新:唾液腺肿瘤》，头颈病理，第11卷，no。1, pp. 55-67, 2017。视图:出版商的网站|谷歌学者
J. Mark, B. Wedell, R. Dahlenfors和G. Stenman，“腮腺多形性低级别腺癌的核型变异性和进化特征，”癌症遗传学和细胞遗传学第55卷第5期。1, 19-29页，1991。视图:出版商的网站|谷歌学者
金，F. Mertens, J. Limon等，“泪腺和唾液腺癌的核型特征，”英国癌症杂志，第70卷，no。1，第42-47页，1994年。视图:出版商的网站|谷歌学者
H. F. L. Mark, I. Hanna和D. R. Gnepp，“唾液腺型肿瘤的细胞遗传学分析”，口腔外科，口腔医学，口腔病理学，口腔放射学和牙髓学，第82卷，no。2，第187-192页，1996年。视图:出版商的网站|谷歌学者
L. Queimado, A. Reis, I. Fonseca等人，“与唾液腺癌相关的6q染色体上两个缺失区域的精确定位，”致癌基因第16卷第1期。1，第83-88页，1998。视图:出版商的网站|谷歌学者
T. Morio, Y. Morimitsu, M. Hisaoka, K. Makishima，和H. Hashimoto，“涎腺多形性腺瘤癌中DNA拷贝数的变化:一项比较基因组杂交研究，”病理学国际第52卷，no。第8页，第501-507页，2002。视图:出版商的网站|谷歌学者
K. Freier, C. Flechtenmacher, A. Walch等人，“通过比较基因组杂交和组织微阵列分析发现唾液腺腺样囊性癌22q13的拷贝数增加，”癌症遗传学和细胞遗传学第159卷第1期。1，页89-95,2005。视图:出版商的网站|谷歌学者
M. Giefing, M. Wierzbicka, M. Rydzanicz, R. Cegla, M. Kujawski，和K. Szyfter，“染色体的增加和减少表明唾涎腺肿瘤中的癌基因和肿瘤抑制基因候选。”赘生物第55卷第5期。1，页55-60,2008。视图:谷歌学者
H. Vékony, B. Ylstra, S. M. Wilting等，“生长因子及其受体在唾液腺腺样囊性癌位点的DNA拷贝数增加，”临床癌症研究第13卷第1期。11，页3133-3139,2007。视图:出版商的网站|谷歌学者
H. Vékony, C. R. Leemans, B. Ylstra, G. A. Meijer, I. van der Waal，和E. Bloemena，“唾液腺癌肉瘤:寡核苷酸阵列CGH显示上皮和间充质成分中相似的基因组谱，”口腔肿瘤，第45卷，no。3, pp. 259-265, 2009。视图:出版商的网站|谷歌学者
K. Uchida, A. Oga, T. Mano, H. Nagatsuka, Y. Ueyama，和K. Sasaki，“小唾液腺黏液腺癌DNA拷贝数畸变的筛查:两例报告，”癌症遗传学和细胞遗传学，第203卷，no。2, pp. 324-327, 2010。视图:出版商的网站|谷歌学者
F. V. Mariano, R. d. O. Gondak, A. S. Martins等，“原发性和继发性转移性多形性腺瘤的基因组拷贝数改变”，组织病理学第67卷第1期。3, pp. 410-415, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
J. Thielker, A. Weise, M. A. K. Othman等，“涎腺多形性腺瘤的分子细胞遗传学初步研究”，肿瘤的信，第19卷，no。2，第1125-1130页，2020年。视图:谷歌学者
R. Bajaj, F. Xu, B. Xiang等，“30例老年骨髓增生异常综合征和急性骨髓性白血病患者的染色体和隐性失衡的循证基因组诊断，”分子细胞遗传学，第4卷，no。3, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
F. Parisi, S. Ariyan, D. Narayan等，“在异质性肿瘤活检中检测拷贝数状态和发现亚克隆标记”，BMC基因组学2011年，第12卷第230页。视图:出版商的网站|谷歌学者
徐峰，吴伟，李鹏，许鹏，“子宫静脉平滑肌瘤病的复发性染色体畸变:高分辨率阵列比较基因组杂交研究，”人类病理学，第45卷，no。9, pp. 1885-1892, 2014。视图:出版商的网站|谷歌学者
F. Parisi, M. Micsinai, F. Strino等，“肿瘤样本的综合分析揭示了肿瘤的异质性，”耶鲁生物医学杂志第85卷第1期。3, pp. 347-361, 2012。视图:谷歌学者
H. Chai, A. DiAdamo, B. Grommisch等人，“一项对10年数据的回顾性分析评估了目前产前和儿科环境中细胞基因组异常的诊断准确性和有效性。”遗传学前沿，第10卷，第1162页，2019。视图:出版商的网站|谷歌学者
向斌，李安，D. Valentin, n.j . Nowak，赵红，李鹏，“全基因组寡核苷酸阵列比较基因组杂交在儿童智力发育迟缓和发育迟缓患者中的分析和临床有效性，”美国医学遗传学杂志A辑第146A期。第15页，1942-1954,2008。视图:出版商的网站|谷歌学者
R. R. Seethala和C. C. Griffith，《分子病理学》外科病理诊所第9卷第1期。3, pp. 339-352, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学者
J. Badlani, R. Gupta, D. Balasubramanian, J. Smith, P. Luk和J. Clark，“原发性唾液腺恶性肿瘤的临床病理演变、分子机制和治疗综述”，澳新外科杂志，第88卷，no。3, pp. 152-157, 2018。视图:出版商的网站|谷歌学者

遗传学病例报告