肝移植后血清角蛋白浓度的时间变化:角蛋白-18和角蛋白-19片段的对比结果

摘要

客观的．正常情况下，成人肝细胞仅表达角蛋白-8 (K8)和角蛋白-18 (K18)，而胆管细胞也表达K19。在本研究中，我们描述了肝移植后血清K19和K18水平的正常时间过程变化模式。患者和方法。在11名成年患者的肝移植后，在基线和定期间隔(长达6个月)测量了K19片段CYFRA 21-1和K18片段组织多肽特异性抗原(TPS)和M30(一种在凋亡过程中caspase裂解后产生的新表位)的血清水平。结果．移植后血清K19浓度较基线值逐渐下降，其时间过程模式与血清胆红素相似。相反，K18片段的血清浓度在移植后不久显著升高，随后逐渐下降，其时间过程模式与血清转氨酶相似。TPS的升高比M30更早，提示移植后第1天肝细胞坏死为主，细胞凋亡为主。5例患者出现移植后并发症(3例急性排斥反应，2例HCV复发)。所有病例均观察到早期血清K19浓度升高。在2例HCV复发患者中观察到K18片段(M30和TPS)的血清浓度增加，在3例急性排斥反应患者中变化更大。结论．肝移植后血清K19和K18片段浓度的时间变化模式不同。这些正常模式变异的诊断价值应在未来的研究中得到解决。

1.简介

角蛋白是在上皮细胞中发现的中间纤维蛋白[1- - - - - -6］．它们位于细胞内，并在肝损伤(包括坏死和凋亡)时释放到血液中[3.，5，6］．在细胞凋亡过程中，角蛋白是caspase降解的底物，随后角蛋白片段释放到细胞外空间[3.，6，7］．在临床实践中，血清角蛋白浓度通常被用作上皮性肿瘤的肿瘤标志物[7- - - - - -9用于检测角蛋白的免疫分析可大致分为两种:一种是识别完整角蛋白(或其片段)中的表位，另一种是识别细胞凋亡过程中产生的特定表位[6］．其中，细胞角蛋白片段(CYFRA) 21.1对应于角质蛋白-19 (K19)中的一个特异表位[10］．同样，组织多肽特异性抗原(tissue polypeptide specific antigen, TPS)和M65与K18中的特异性表位相对应[8，11］．上皮细胞坏死或凋亡后，所有这些角蛋白片段的血清浓度均升高[7，12］．在后者中，M30检测到一个K18片段，其中包含一个新表位Asp396-NE，它是在凋亡过程中caspase裂解后产生的(图1) [13- - - - - -15］．仅在细胞凋亡后增加的角蛋白片段与在坏死或凋亡后增加的角蛋白片段之间的比例，可能为了解每种病理过程在特定疾病中的相对贡献提供了见解[3.，15- - - - - -17］．

角蛋白是肝脏健康和疾病的重要蛋白质，正如其他地方所述[1- - - - - -6］．成人肝细胞仅表达K8和K18 [5，6］．在胚胎发生过程中，肝细胞也表达不同水平的K19, K19也与K7一起在成人胆管细胞中表达[5，6］．角蛋白在肝脏中含量很高，约占总蛋白质的0.3% [6］．它们的丰度和细胞内的分布使它们有希望成为非恶性肝病的血清学标记物[6］．事实上，在大多数肝脏疾病患者中，TPS (K18)的血清浓度是升高的[18，19]，特别是急性肝炎[19］．脂肪性肝炎患者血清TPS浓度也显著升高，两者均为酒精性[19- - - - - -22]和不含酒精的[23- - - - - -25］．在酒精性肝病患者中，血清TPS水平可用于区分是否患有酒精性脂肪性肝炎[20.];血清TPS浓度与肝脏标本中Mallory-Denk小体的数量相关，这是脂肪性肝炎的一个标志[20.，21］．此外，基于K18 (M65)的MELD评分修正可提高急性肝损伤后自发生存的预测[26］．细胞凋亡标志物M30的血清浓度也被广泛研究，作为肝损伤的测试[27- - - - - -41］．在非酒精性脂肪性肝病或非酒精性脂肪性肝病患者中，K18片段M30的血清浓度可作为脂肪性肝炎的标记物[28- - - - - -30.]或酒精性肝病[31]，作为酒精性肝炎的预后标志物[32]，并作为慢性丙型肝炎患者组织学严重程度的标志[33- - - - - -35]或乙型肝炎[36- - - - - -38］．在接受骨髓移植的患者中，血清M30水平也有助于区分移植物抗宿主病与肝脏表现相似的无关疾病[39］．

细胞凋亡是肝脏疾病的相关病理特征[40- - - - - -43］．这也是肝移植后的一个显著特征，特别是在缺血-再灌注损伤期间[44- - - - - -46]和拒绝[47］．细胞凋亡可能是多种疾病治疗的靶点[48]，包括肝病[41，42，49］．针对缺血-再灌注损伤中防止凋亡的抗凋亡分子正在研究中[41，48，50］．据我们所知，只有两项研究关注肝移植后的血清角蛋白水平。Ulukaya等人测定了肝脏再灌注24小时后血清中M65和M30的浓度[51］．在他们的研究中，死亡肝脏捐赠者的肝移植后，细胞凋亡和坏死在短期内都很突出[51］．布伦纳等人[52]评估了肝再灌注后和肝移植后第1天血清中K18片段(M65和M30)的水平。他们的研究还显示，移植后1小时内K18、M30和M65升高，与缺血/再灌注损伤引起的显著坏死和凋亡相对应。此外，他们还观察到移植后并发症(如感染或灌注障碍)中角蛋白水平的升高[52］．

肝脏疾病患者的血清K19浓度研究较少。在之前的一项研究中，我们发现在酒精性肝病患者中，血清K19水平的升高程度低于K18水平[22］．据我们所知，血清K19浓度在肝移植中尚未被研究过。本研究的目的是描述移植后中期(6个月)血清K19 (CYFRA 21-1)的正常进化，并将其与K18 (TPS和M30)的正常进化进行比较。

2.患者与方法

2.1.参与者和研究设计

这项描述性观察性研究包括11名连续成年患者(年龄40-64岁，7名男性)，他们在我们中心接受了3个月的来自已故捐赠者的原位肝移植。所有患者均书面知情同意参与该研究，该研究由机构审查委员会审查和批准，并符合现行的赫尔辛基宣言。患者的主要特征见表1．所有患者均为晚期肝硬化。8例有酗酒史。所有参与者的标准免疫抑制包括皮质类固醇和他克莫司。

在肝移植后基线(移植前)和定期(24小时、3天、6天、10天、20天、1个月、2个月、4个月和6个月)采集血清样本测定角蛋白浓度。一例患者移植后24小时的血清样本无法获得。标准肝脏标记物在ADVIA 1650分析仪(拜耳诊断，勒沃库森，德国)中进行分析。样品在- 40°C冷冻，直到测试角蛋白浓度。

2.2.血清决定

2.2.1.角蛋白19 (CYFRA 21-1)

血清CYFRA 21-1水平通过商业电化学发光免疫分析法测定(Elecsys CYFRA 21-1;Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)在Roche Elecsys免疫分析分析仪中。该测试采用针对K19片段的两种单克隆抗体(Ks 19.1和BM 19.21)的组合[10］．这些抗体识别的表位序列位于Ks 19.1抗体的311-335序列和检测抗体BM 19.21的346-367序列[10］．血清CYFRA 21-1的上限被认为是3.3 ng/mL。

2.2.2.Keratin-18 (TPS)

采用商业化学发光免疫法(Immulite-TPS;西门子医疗解决方案诊断，格温内德，英国)在一个自动化平台(Immulite-2000，西门子)。本试验采用M3单克隆抗体，该抗体针对K18中322-340残基[8，11)(图1）．该方法检测阈值为15 U/L。正常参考水平的上限值为100u /L。

2.2.3.Keratin-18 (M30)

血清M30水平通过商业免疫分析(M30- apoptosis sense;PEVIVA AB, Bromma，瑞典)遵循制造商的说明。该测试使用M30检测抗体，该抗体识别映射到K18 387 - 396位置的新表位(图1)．这种所谓的K18-Asp396-NE仅在caspase切割蛋白后才被发现，并被认为是细胞凋亡的选择性生物标志物[13，14］．用m30抗原参考浓度校准测定方法。用ELISA分析仪在450nm处测定吸光度。该方法的检测阈值为25 U/L。正常的上参考水平被认为是260 U/L。

2.3.组织学研究

石蜡包埋的肝脏标本按照标准程序用苏木精-伊红染色。在免疫组化研究中，在抗体孵育前，用ChemMate蛋白酶K (Dako, Glostrup，丹麦)消化去亲和的肝脏标本切片10分钟。一抗(见下图)在室温下涂抹30分钟。EnVision System (Dako)是一种含有过氧化物酶和二抗小鼠抗体的葡聚糖聚合物，然后应用30分钟。在孵育之间，切片在缓冲溶液(ChemMate buffer kit, Dako)中清洗。以二氨基联苯胺(DAB, Dako)为显色剂，阳性反应，切片用Harris苏木精(Panreac, Barcelona, Spain)反染2分钟。一抗包括K19(克隆RCK 108, Dako)、K18(克隆DC10, Dako)和M30单克隆抗体(M30 CytoDEATH;Alexis Biochemicals，诺丁汉，英国)。每50个随机显微镜视野(40x)含有m30反应性包体的肝细胞数量被认为是“凋亡评分”[34，53］．

2.4.统计分析

采用Wilcoxon检验比较配对样本值。相关性采用Spearman秩检验。<0.05为差异有统计学意义。

3.结果

3.1.肝移植后血清K18和K19浓度的演变

大多数患者移植前CYFRA 21-1、TPS和M30水平升高;移植前中位浓度分别为3.6 ng/mL、201 U/L和403 U/L(图2)．K18片段(TPS和M30)的血清浓度在移植后立即显著增加(图2)．TPS和M30的增加是并行发生的，尽管总体而言，TPS浓度峰值出现的时间比M30浓度峰值更早(在+1天)，M30浓度峰值在+3天达到更高的中位数(图3)2)．因此，移植后即刻TPS: M30比值在+1天最高，+3天最低(图3.)．血清TPS和M30浓度均降低。在大多数病例中，血清TPS浓度的下降相当突然，而M30浓度随时间的下降则较为稳定(图2)．移植后6个月，血清TPS和M30浓度均明显低于移植前样本(图2)．

总的来说，K18片段TPS和M30浓度的时间过程变化与血清转氨酶天门冬氨酸转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)的变化相似(图)2)．事实上，TPS和M30的血清水平往往与AST和ALT的血清水平相关，TPS的K18片段与血清转氨酶的相关性大于M30, AST的相关性高于ALT，至少在移植后立即是这样(表2)2)．

血清K19 (CYFRA 21-1)水平随时间的变化与K18片段不同。在肝移植后，CYFRA 21-1水平没有明显的峰值2)．相反，随着时间的推移，CYFRA 21-1浓度从移植前值稳步下降。从移植后+6天开始，血清CYFRA 21-1浓度显著低于移植前值(图2)2)．总体而言，血清K19 (CYFRA 21-1)水平的时间过程变化与血清胆红素的时间过程变化相似(图2)．事实上，CYFRA 21-1的血清水平往往与血清胆红素水平相关，至少在移植后不久是这样(表21-1)2)．

3.2.案例报告

5例患者发生移植后并发症导致肝活检(表2)1)．其中，2例HCV复发，另外3例发生急性排斥反应。其中一例HCV复发患者的个人资料见图4．在这种情况下，在复发时观察到K18 (TPS和M30)和K19 (CYFRA 21-1)片段的血清水平升高。血清角蛋白水平的升高，特别是K19的升高，往往比标准肝脏标志物的改变更早发生(图4)．肝活检与HCV复发一致(图4)．免疫组化研究显示m30阳性肝细胞遍布肝小叶(凋亡评分，17)。正常对照肝脏的免疫组化研究为阴性(数据未显示)。K19的免疫组化染色显示，该蛋白的表达几乎完全局限于胆管细胞(图4)．另一名HCV复发患者的生化和组织学结果相似(数据未显示)。

其中一例急性排斥反应患者的个人资料见图5．在这种情况下，在发病期间血清K18片段(TPS或M30)水平没有显著增加。相反，我们观察到血清K19片段(CYFRA 21-1)的短暂增加(图5)．免疫组化研究M30阴性(凋亡评分为零)。K19的免疫组化染色显示它几乎完全局限于胆管细胞(图5)．另外2例急性排斥反应患者(1例发生在第30天，另1例发生在第50天)，组织学结果非常相似，生化研究也显示K19片段(CYFRA 21-1)和K18片段(TPS和M30)短暂性增加(数据未显示)。

4.讨论

肝移植是晚期肝病的标准治疗方法。提高对缺血再灌注损伤和晚期并发症机制的认识，可作为预防或治疗的基础。此外，早期、准确地发现肝移植术后可能发生的并发症具有明显的重要性。在本研究中，我们试图描述肝移植后短期和中期血清角蛋白(K19和K18)的正常时间过程变化。

血清角蛋白水平随时间的变化表明肝细胞坏死和凋亡是肝移植后即刻发生的显著特征。术后3天内K18片段TPS和M30血清浓度显著升高。相反，K19的血清浓度在同一时期内没有增加。需要注意的是，K19在肝细胞中不是组成型表达[1，3.，6］．TPS和M30水平的时间过程变化相似，但并不严格平行。TPS峰值出现的时间早于M30。因此，TPS: M30比值在+1天最高，在+3天最低。提示早期缺血再灌注肝损伤包括肝细胞坏死和细胞凋亡，移植后1小时内坏死为主，移植后数天内细胞凋亡为主。Ulukaya等人也报道了肝细胞坏死优于凋亡的早期优势。[51]和Brenner等人[52］．细胞凋亡和坏死的相对贡献可能对未来预防移植术后早期肝功能障碍的方法研究很重要，包括抗凋亡药物的开发[48，50］．K18片段的增加量在随后几天内迅速下降，TPS水平下降速度比M30水平更快。移植后6个月，两种标志物的浓度均显著低于移植前基线。总体而言，K18片段水平的时间过程变化与血清转氨酶AST和ALT等肝细胞损伤标志物的时间过程变化相似，与以往研究结果相似，血清转氨酶与血清K18片段浓度的统计学相关性在AST中高于ALT [19］．

移植后K19片段(CYFRA 21-1)浓度的时间过程变化与K18片段完全不同。血清K19浓度较移植前呈稳定下降趋势，移植后无明显峰值。在正常肝脏中，K19的表达仅限于胆道上皮，而K18和K8是肝细胞中的主要角蛋白[1，3.，6］．总的来说，K19片段浓度的时间过程变化与血清胆红素的时间过程变化相似。

个别病例报告中，2例HCV复发患者血清K18片段(TPS和M30)水平升高，提示发病期间坏死和凋亡增加。免疫组化研究也显示肝细胞凋亡评分增强。有趣的是，血清K18片段的增加早于标准肝脏标志物的增加。在3例急性细胞排斥反应患者中，1例血清K18片段增加不明显，另1例无K18片段增加。此外，免疫组化研究在这三个病例中未发现凋亡的肝细胞。综上所述，这些发现表明，细胞凋亡与移植后并发症(如HCV复发)的相关性大于与细胞排斥反应的相关性。事实上，细胞凋亡是慢性丙型肝炎的一个相关特征[33，34］．值得注意的是，在HCV或急性排斥反应期间，血清K19片段水平显著升高。在某些情况下，K19的增加比标准肝脏标志物发生得更早。K19在正常情况下仅在胆道上皮细胞中表达，但在应激条件下也可在肝细胞中表达[3.，6］．胆管是HCV复发和急性排斥反应中众所周知的靶点．同样地，K18水平的变化也与移植后感染和灌注障碍有关[52]， K19水平时间变化的典型模式(从移植前的值稳步下降)可能更容易识别可能表明移植后并发症的异常变化。

这项研究也有一定的局限性。它被用来定义血清角蛋白时间过程变化的标准模式。对患者进行了严格的定期随访，表明移植后时间过程的变化是一致的。研究设计不允许我们检测在预定的采样间隔之间可能发生的变化，特别是在移植后的最初几天，这段时间变化最大。样本量显然很小，不足以评估血清角蛋白在这种特殊情况下的诊断价值。尽管对个别病例观察的数据应谨慎解释，但我们的初步结果可作为进一步研究血清角蛋白在肝移植并发症检测和诊断中的诊断效用的基础。值得注意的是，角蛋白在大多数简单上皮细胞中表达，因此不是肝脏特异性的[3.，6］．然而，肝细胞中角蛋白的高浓度及其与移植后特定事件相关的血清角蛋白浓度的时间过程变化强烈表明，在我们患者中测量的血清角蛋白主要来源于肝脏。

测定血清角蛋白片段水平可提高我们对肝脏疾病的认识[3.，6］．从机制的角度来看，血清角蛋白提供了一种测量坏死和凋亡的方法，这两者都是肝脏疾病的重要特征。在这方面，开发抗凋亡药物以预防早期肝移植相关的肝损伤将具有重要意义。从诊断的角度来看，血清角蛋白片段是肝脏疾病有希望的标记物。为此，与酶活性等标准标志物相比，关键肝细胞蛋白(如角蛋白)可能是更可靠的指标，而酶活性在没有真正肝损伤的情况下可能受到药物等因素的影响[54］．测定角蛋白片段浓度的测定方法可以在市面上买到，用临床使用的标准平台可以很容易地测定浓度[25］．在这里，我们描绘了肝移植后K18和K19片段的正常进化。从单个病例报告中无法得出结论，但可能会引发讨论，以评估肝损伤病例中的这一生物标志物，特别是移植后并发症(包括排斥反应)。进一步的研究需要评估角蛋白片段作为肝移植患者疾病标志物的效用。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据可根据要求从通讯作者处获得。

利益冲突

作者宣称他们没有利益冲突。

致谢

本研究由Consellería de Sanidade (Xunta de Galicia，西班牙)的基金(PS 08/69)支持。

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