绵羊肺纤维化模型中内质网应激和细胞凋亡水平的增加是由在活的有机体内阻断KCa3.1离子通道

摘要

特发性肺纤维化(IPF)是一种致命的肺间质性疾病，其特征是肺组织的进行性损害。II型肺泡上皮细胞(AECs)和肺巨噬细胞的凋亡和内质网应激(ER应激)与IPF的发生有关。因此，细胞凋亡和内质网应激靶向治疗作为治疗IPF的潜在途径引起了人们的关注。钙活化钾离子通道KCa3.1被认为是包括IPF在内的纤维化疾病的潜在治疗靶点。虽然KCa3.1在AECs和巨噬细胞中表达，但其在疾病过程中对内质网应激和凋亡的影响尚不清楚。我们利用一个新的绵羊肺纤维化模型来证明凋亡和内质网应激发生在博莱霉素诱导的绵羊肺纤维化的II型aec和巨噬细胞中。通过标记核DNA片段的TUNEL方法鉴定了II型AEC和巨噬细胞的凋亡，而内质网应激的特征是GRP-78内质网伴侣蛋白的表达增加。我们证明，在最后一次博莱霉素输注后2周，II型aec和巨噬细胞的凋亡和内质网应激显著增加，并在博莱霉素损伤后7周内保持高水平。Senicapoc治疗显著降低了居住在博莱霉素灌注肺段的II型aec和巨噬细胞的内质网应激率。经senicapac处理的绵羊肺段II型AECs和巨噬细胞的凋亡率也显著降低。 In vivo blockade of the KCa3.1 ion channel alleviates the ER stress and apoptosis in type II AECs and macrophages, and this effect potentially contributes to the anti-fibrotic effects of senicapoc.

1.简介

特发性肺纤维化(IPF)是一种致命的肺间质性疾病，其特征是肺组织进行性损害，进而导致肺的气体交换功能受损[1- - - - - -3.］．吡非尼酮和尼达尼布是目前FDA批准用于减缓IPF进展的两种药物[4- - - - - -7]，这些药不能治这种病[4- - - - - -7］．由于对肺纤维化的发病机制缺乏了解，研究抑制持续纤维化的潜在治疗靶点仍然是一个重大挑战。

IPF的进展涉及许多疾病因素，包括转化生长因子的激活β(TGF -β)和其他趋化因子、II型肺泡上皮细胞(AECs)凋亡、凋亡细胞的无效清除、伤口愈合异常和内质网(ER)应激[8，9］．内质网是一种特殊的细胞器，通常负责折叠合成的蛋白质和随后的蛋白质到高尔基体的囊泡运输。Ca等因素^{2 +}损耗、氧化还原稳态改变、营养剥夺和环境损害都会影响这些折叠过程，最终导致未折叠蛋白的积累，从而破坏内质网功能，导致内质网应激[10］．

内质网应激可启动细胞凋亡途径[11]通过激活caspase-12。Caspase-12能够特异性切割caspase-9，这与下游效应一起最终导致凋亡[11］．

II型AECs中的内质网应激是IPF的突出特征之一，常见于家族性和散发性IPF患者[12］．石棉肺患者肺部的巨噬细胞中也观察到内质网应激[13］．内质网应激诱导炎症信号、上皮细胞-间充质细胞转变、肌成纤维细胞激活、巨噬细胞极化和T细胞分化，这些可能有助于IPF的疾病进展[14- - - - - -17］．

钙活化钾离子通道KCa3.1被认为是包括IPF在内的纤维化疾病的潜在治疗靶点[18- - - - - -21］．KCa3.1离子通道在肺部和其他组织的多种细胞类型中表达[18，20.，22］．重要的是，KCa3.1离子通道的刺激激活了参与IPF疾病过程的成纤维细胞、巨噬细胞和上皮细胞等细胞[18］．我们最近报道了使用senicapoc (ICA-17043)阻断KCa3.1离子通道可在绵羊肺纤维化模型中减弱间质性肺纤维化，改善肺顺应性，并减弱微血管重塑[23，24］．在本研究中，我们利用绵羊模型分析了KCa3.1离子通道在II型AECs和纤维化疾病巨噬细胞中的调节功能。

本研究的目的是首先确定在实验诱导纤维化的羊肺中是否观察到内质网应激和II型aec和巨噬细胞凋亡率的增加。其次，我们研究了在肺纤维化大型动物模型中，使用特定抑制剂senicapoc阻断KCa3.1离子通道是否会延缓ER应激和II型aec和巨噬细胞的凋亡速率。

2.材料与方法

2.1.用羊模型评价博莱霉素诱导肺纤维化中II型AEC和巨噬细胞内质网应激和凋亡的体内实验设计

所有与绵羊实验和样本收集有关的实验程序均经墨尔本大学(Parkville, VIC, Australia)动物实验伦理委员会批准，并遵守《澳大利亚科学目的动物护理和使用行为准则》。绵羊肺组织样本取自另一项研究[25]，实验设计简要如下。

8只雌性美利奴羊(n= 8)在9-12个月内陈化，使用硫酸博莱霉素(Hospira, Melbourne, Victoria, Australia)，以0.6 U博莱霉素/ml生理盐水配制[25］．从制备好的博莱霉素溶液中，5 ml经光纤支气管镜活检口注射到所需肺段(总剂量3u /肺段)。同样，对侧尾肺段给予5ml 0.9%无菌生理盐水作为内对照(图1)．14天后，同一肺段给予第二剂量博莱霉素/生理盐水(图1(一)而且1 (b))．然后，这些羊又被养了14天，让它们患上肺纤维化。第28天，通过静脉注射巴比妥酸盐(Lethabarb, Virbac Animal Health, Australia)处死所有绵羊。

2.2.尸检和组织取样

在尸检过程中切除肺，确定目标肺段。将目标肺叶的尾段分离出来，通过暴露细支气管，用最佳切割温度(OCT)和无菌PBS溶液1:1的混合物在约20 cm/H的压力下充气₂O，以便在处理过程中保存肺组织结构。然后将0.5 cm厚的肺组织标本用4%多聚甲醛固定，再用70%乙醇固定，石蜡处理，进行组织病理学分析。

2.3.II型AEC和巨噬细胞内质网应激的评价

对II型aec和肺巨噬细胞的持续性损伤可能诱导内质网应激，进而发展为细胞凋亡。葡萄糖调节蛋白(GRP) 78是最具代表性的内质网伴侣蛋白之一，是评价内质网应激的经典标志物。采用兔单克隆抗grp78一抗(Abcam (ab108615))免疫组化评价石蜡肺切片上II型aec和巨噬细胞的内质网应激。每次试验均采用阴性对照，不添加一抗。

2.4.抗grp78免疫组化染色

石蜡切片用二甲苯浸泡3次5 min，再用无水乙醇浸泡2次5 min，再用70%乙醇浸泡5 min，进行脱蜡和复水处理。使用预热的柠檬酸缓冲液(pH-6)加热15分钟进行抗原提取，然后将载玻片冷却10分钟，然后用PBS洗涤。然后将载玻片保存在3% H中₂O₂用PBS彻底冲洗10分钟，以阻断内源性过氧化物。在每张载片中加入未稀释的胎牛血清(FCS)，孵育1小时，以阻断与抗原的非特异性结合。加入FCS 1:50稀释的抗grp78抗体(Abcam, ab108615)，孵育1小时。用PBS和EnVision轻轻冲洗载玻片^TM双链系统hrp(辣根过氧化物酶)(Dako, North America Inc.， CA, USA)应用并孵育30分钟。为了可视化抗原-抗体反应，将Nova RED过氧化物酶底物(Vector Laboratories Inc.， CA, USA)添加到每个样品中并孵育3分钟。然后用蒸馏水冲洗样品停止反应，用苏木精反染色。

2.5.II型AEC和巨噬细胞凋亡的评价

点击它^TM比色法末端脱氧核苷酸转移酶- dutp缺口末端标记(TUNEL)试验^TM在石蜡肺组织切片上进行TUNEL比色免疫组化检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific, USA)，以评估博莱霉素诱导的绵羊肺纤维化模型中II型AECs和巨噬细胞的转化(图2)．每次试验均在不添加TdT反应混合物的阴性对照下进行。根据制造商的说明，石蜡切片脱蜡，用二甲苯和分级系列乙醇再水化^TMTUNEL比色免疫组化检测试剂盒，赛默飞世尔科学公司，美国)。将载玻片浸在1% H中₂O₂10分钟，阻断内源性过氧化物酶。每个样品中加入稀释的蛋白酶K(稀释率1:50)，孵育5分钟。然后用阻断缓冲液(1%牛血清白蛋白(BSA) + 5%正常羊血清(NSS) + PBS)阻断样品30分钟。每一步前用PBS彻底清洗载玻片3次，每次5分钟。对于末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)反应，载玻片在TdT反应缓冲液中孵育10分钟。按照制造商的规程制备TdT反应混合物，添加到每张载玻片中，孵育60分钟。用PBS冲洗TdT反应完全淬灭后，将载玻片浸泡在柠檬酸盐钠(SSC)缓冲液中15分钟，然后浸泡在PBS和click-iT TUNEL比色溶液中。按厂家推荐制备Click-iT TUNEL比色反应鸡尾酒(Click-iT反应缓冲液+ CuSo4，叠氮生物素+反应缓冲添加剂)，添加到每个样品中，孵育30分钟。用PBS和Click比色水洗样品。然后用链霉亲和素过氧化物酶孵育30min, PBS和去离子水冲洗。 DAB was diluted 1 : 200 with DAB substrate buffer and added to each sample and kept for 30 seconds to facilitate the reaction. Then, the sections were washed with deionized water to stop the reaction and counter-stained with methyl green. 2 g of methyl green was dissolved in 100 ml of distilled water and extracted in chloroform to remove the crystal violet. Working solution was prepared by mixing 1 : 1 methyl green with 0.1 M acetate buffer. Slides were then counter-stained with methyl green for 10 min, followed by quick dehydration with 70% and 100% ethanol and fixed in xylene.

2.6.Senicapoc和吡非尼酮对博莱霉素诱导肺纤维化II型AEC和巨噬细胞内质网应激及凋亡的体内实验设计

羊肺组织来源于我们之前的研究[24，26]和一个简单的描述实验设计如下。30只美利奴羊(n= 30)，年龄9-12个月，使用博莱霉素，如上所述(图3(一个)而且3 (b))．绵羊的肺纤维化再持续2周。然后这些羊被随机分为三组(n= 10)。然后，每组分别给予30 mg/kg senicapoc (Icagen Inc.， Durham, NC)/吡非尼酮(Selleckchem, USA)或甲基纤维素(Control) 0.5%甲基细胞MC (Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia)口服，每日两次。在治疗结束时，通过静脉注射巴比妥酸盐(Lethabarb, Virbac Animal Health, Australia)处死绵羊，并收集肺组织，如上所述进行处理。如上所述，分别采用anti-GRP78染色和TUNEL法评估II型AECs和巨噬细胞的内质网应激和凋亡。

2.7.定量图像分析

图像采用徕卡DM500显微镜拍摄。选择20个具有代表性的非重叠场，在40倍放大下进行捕获。每个野区计数棕色染色细胞，用均数和均数的标准误差(均数±SEM)表示。II型aec和巨噬细胞经形态学鉴定。II型aec为立方体细胞，细胞核位于中央，细胞被基底膜覆盖，一小部分暴露在肺泡表面[3.］．巨噬细胞形状不规则，细胞核突出，细胞质呈颗粒状。

2.8.统计分析

使用GraphPad Prism版本8.0.1 for Windows软件(GraphPad software, La Jolla California USA)进行统计分析。采用D 'Agostino-Pearson综合正态性检验进行正态性检验。t-试验评价绵羊肺组织中II型aec和巨噬细胞的内质网应激和凋亡。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)和Tukey事后检验(post - hoc test)评价西尼卡泊克和吡非尼酮对内质网应激及II型aec和巨噬细胞周转的影响，进行组间多因素比较。观察到值小于0.05 (< 0.05)为差异有统计学意义。

3.结果

3.1.博莱霉素诱导绵羊肺纤维化模型的内质网应激

通过测定死后采集的不同处理的肺段样本中GRP78免疫阳性细胞的数量来评估内质网应激(图)1(一)而且1 (b))．红色细胞质染色显示II型AECs和肺巨噬细胞内质网应激，提示GRP78蛋白表达升高(图1 (c))．注射博莱霉素两周后，II型AECs肺组织内质网应激率显著增加(博莱霉素1.16±0.17 vs生理盐水0.27±0.06个细胞/场，= 0.0002)(图1 (d))．同样，与对照组/生理盐水肺段相比，灌注博莱霉素后巨噬细胞内质网应激率显著增加(博莱霉素3.30±0.84 vs生理盐水0.46±0.24细胞/野，= 0.006)(图1 (e))．

3.2.II型AEC和巨噬细胞凋亡的评价

由于内切酶的激活，核DNA的广泛碎片化是晚期凋亡的一个标志。II型aec和巨噬细胞的棕色核染色显示DNA片段(tunel阳性)(图2(一个))．如图所示2 (b)，与盐水灌注肺段相比，博莱霉素灌注肺段II型aec的凋亡率明显增加(博莱霉素1.64±0.25 vs盐水0.28±0.07个凋亡细胞/野，= 0.0001)。与对照肺段相比，博莱霉素灌注肺段中凋亡巨噬细胞数量也显著增加(博莱霉素1.06±0.20 vs生理盐水0.22±0.08个凋亡细胞/野，= 0.0001)。

3.3.KCa3.1离子通道阻断显著减弱博莱霉素诱导肺纤维化II型AEC和肺巨噬细胞内质网应激和凋亡

KCa3.1离子通道已被证明在II型aec和肺巨噬细胞内质网应激和凋亡的发展中发挥关键作用[18］．因此，我们研究了阻断Ca通路是否可以降低II型aec和肺巨噬细胞的内质网应激和凋亡^{2 +}激活K⁺使用KCa3.1特异性离子通道阻断药物senicapoc。在本实验中，我们在最后一次输注博莱霉素7周后评估各组肺组织内质网应激和细胞凋亡。图中给出了实验过程的组结构和实验时间轴3(一个)而且3 (b)。

内质网应激标记物GRP78在巨噬细胞和aec中的细胞质表达在不同处理的肺段中见图3 (c)。甲基纤维素处理的对照组，grp78阳性II型aec数量增加(生理盐水0.19±0.04个，博莱霉素0.68±0.12个/场，n= 10,= 0.0003)(图3 (d))和巨噬细胞(生理盐水0.32±0.10 vs博莱霉素1.46±0.42细胞/场，n= 10,= 0.005)(图3 (e))在注入博莱霉素的肺段与注入盐水的肺段进行比较。这表明疾病模型功能正常。当用森尼卡泊克或吡非尼酮处理的绵羊组与甲基纤维素对照组进行比较时，森尼卡泊克或吡非尼酮处理的绵羊肺段中表达GRP78蛋白的aec数量显著减少(森尼卡泊克0.26±0.06 vs 0.68±0.12 cells/field)。n= 10= 0.002;吡非尼酮0.36±0.04 vs 0.68±0.12 cells/field，= 0.01)(图3 (d))．此外，在senicapoc和吡非尼酮治疗的绵羊中，博莱霉素灌注肺段中grp78阳性aec的数量与盐水灌注肺段中grp78阳性aec的数量没有显著差异(图3 (d))．这些数据表明，由博莱霉素损伤引起的aec内质网应激的增加在吡非尼酮或森尼卡波克治疗后减弱。

对于巨噬细胞而言，仅用senicapoc治疗可显著减少博莱霉素损伤肺段内质网应激中的巨噬细胞数量，与对照肺段受博莱霉素损伤的对照肺段相比(senicapoc 0.47±0.11 vs 1.46±0.42 cells/field，= 0.017;吡非尼酮0.86±0.11 vs 1.46±0.42 cells/field，= 0.2)(图3 (e))．在senicapap处理的绵羊中，博莱霉素灌注肺段中grp78阳性巨噬细胞的数量与盐水灌注肺段中grp78阳性巨噬细胞的数量无显著差异(图3 (e))．吡非尼酮处理绵羊肺段博莱霉素灌注的grp78阳性巨噬细胞数量高于盐水灌注的肺段，但数据也无显著差异(图3 (e))．

图中，tunel阳性片段DNA在II型aec和巨噬细胞中以棕色核染色显示4(一)。甲基纤维素处理的对照组，tunel阳性II型aec数量增加(生理盐水0.23±0.04个，博莱霉素0.94±0.16个/场，n= 10,< 0.0001)(图4 (b))和巨噬细胞(生理盐水0.14±0.04 vs博莱霉素0.53±0.07个细胞/场，n= 10,= 0.0001)(图4 (c))在注入博莱霉素的肺段与注入盐水的肺段进行比较。这表明疾病模型功能良好，2型AECs和巨噬细胞凋亡在最后一次博莱霉素输注后7周仍保持较高水平。

将senicapoc或吡非尼酮处理的绵羊组与甲基纤维素对照组进行比较，senicapoc处理的绵羊肺段中注入博莱霉素的tunel阳性aec数量显著减少(senicapoc 0.43±0.06 vs 0.94±0.16个细胞/场，n= 10,= 0.003)(图4 (b))．虽然吡非尼酮治疗组aec的凋亡数量较低，但与甲基纤维素对照治疗组相比，差异不显著(吡非尼酮为0.65±0.07 vs 0.94±0.16个/场细胞，n= 10,= 0.2)(图4 (b))．在senicapoc和吡非尼酮治疗的绵羊中，博莱霉素灌注肺段中tunel阳性aec的数量与盐水灌注肺段中tunel阳性aec的数量没有显著差异(图4 (b))．

对于巨噬细胞而言，与对照组相比，senicapoc治疗显著减少了博莱霉素损伤肺段中暴露的巨噬细胞的凋亡数量(senicapoc 0.31±0.04 vs 0.53±0.07个细胞/野，n= 10,= 0.04;吡非尼酮0.35±0.04 vs 0.53±0.07 cells/field，n= 10,= 0.1)(图4 (c))．

4.讨论

本研究首次报道博莱霉素治疗增加了II型AECs和肺巨噬细胞的内质网应激和凋亡，并通过在活的有机体内用senicapoc阻断KCa3.1离子通道。我们之前使用绵羊肺纤维化模型的研究报道，经senicapoc治疗的绵羊肺纤维化和微血管重塑显著减少[23，24］．经senicapop治疗的绵羊的肺病理减弱与这些动物的肺功能改善相一致[24］．目前的研究结果表明，阻断KCa3.1离子通道可以减少II型AECs和巨噬细胞的内质网应激和凋亡，这一效应可能有助于在该羊肺纤维化模型中观察到的病理减轻和肺功能改善。

慢性内质网应激介导的II型aec和巨噬细胞凋亡已被确定为IPF的主要致病机制之一[12，27］．但内质网应激介导的细胞凋亡的潜在机制很复杂，尚未完全了解[28］．我们的结果显示，输注博莱霉素后2周，II型AEC和巨噬细胞内质网应激和凋亡的发生率较高，并在博莱霉素损伤后至少7周内保持显著的高水平。

值得注意的是，这些结论是基于不同处理的肺样本中相对较少的凋亡细胞和内质网应激细胞。在我们的研究中观察到的内质网应激或凋亡阳性细胞的范围在每个野区0-6个细胞之间。虽然这些指标在药物治疗中有统计学意义上的显著降低，但需要问的问题是，这些观察到的指标降低是否具有临床相关的结果。与其他器官相比，肺实质细胞总密度较低，这是由于肺气体交换区域的空气-组织-空间比相对较高所致。在先前关于肺特发性间质性肺炎的研究中，与培养细胞相比，tunel阳性细胞在肺上皮细胞总数中的比例相对较低，占总肺上皮细胞的1%至3% [29］．作者认为，凋亡细胞被迅速吞噬，因此在光镜或电子显微镜下只存在相对较短的时间。因此，虽然tunel阳性凋亡细胞在组织标本中可见的频率较低，但这一小部分可能仍然反映了相当大的细胞损失[30.］．总的来说，在目前的绵羊研究中，吡非尼酮和senicapoc观察到的细胞凋亡和内质网应激的减少应该与我们之前使用这些药物的临床发现相结合。我们之前已经证明，用KCa3.1通道阻滞剂senicapoc和fda批准的药物吡非尼酮治疗绵羊的肺顺应性、纤维化评分、血管重塑和胶原沉积有显著改善[23，24，26］．在目前的研究中，这些药物治疗后细胞凋亡和内质网应激的减少是其整体临床疗效的一部分。

这些细胞内事件与KCa3.1离子通道之间的关系需要进一步阐明。我们报道了KCa3.1离子通道在肺泡上皮细胞中广泛表达[24］．膜电位与Ca^{2 +}肺泡上皮细胞的信号主要由KCa3.1通道调控，以维持关键的细胞功能，如激活、迁移和增殖[18，31］．KCa3.1离子通道是电压无关的K⁺当细胞内Ca^{2 +}水平升高，导致Ca^{2 +}激活K⁺流出。这一过程在细胞体积调节中起着重要作用。当有持续刺激时，KCa3.1离子通道被激活[18，32］．这将导致细胞内钾的大量损失⁺离子转移到细胞外腔室，细胞内K离子转移超过50%⁺可通过外排流失[18］．细胞内钾的消耗⁺离子通过caspase激活、细胞色素c释放和DNA降解诱导细胞凋亡[33- - - - - -35］．本研究中KCa 3.1通道的体内阻断可能维持了细胞内外腔室之间的离子平衡，从而导致细胞凋亡的减少[36］．

未折叠蛋白的积累，钙含量失衡^{2 +}内稳态、氧化应激和缺血是导致多器官退行性和纤维化疾病中内质网应激的一些因素[14，37］．GRP78是内质网应激伴侣蛋白，在维持内质网蛋白合成、折叠和细胞内钙稳态中发挥重要作用[10，38］．通过评估II型AECs和巨噬细胞中GRP78蛋白表达水平的增加，我们证明了用senicapoc阻断KCa3.1离子通道可以显著延缓II型AECs和巨噬细胞中的内质网应激速率。我们的发现与之前评估钙依赖内质网应激与KCa3.1通道之间相关性的工作一致，其中KCa3.1离子通道的阻断或遗传缺失被证明可以减少Ca^{2 +}人类和小鼠的星形胶质细胞超载和衰减内质网应激[39］．虽然这些实验处理的是人类和小鼠脑细胞，但这些发现与我们在用senicapoc治疗的绵羊中观察到的博莱霉素诱导的II型AECs和肺巨噬细胞内质网应激的减少一致。

我们发现，经批准的抗纤维化药物吡非尼酮也降低了II型aec和博莱霉素灌注段巨噬细胞的凋亡率。吡非尼酮抗纤维化作用的潜在分子机制尚不完全清楚。已知吡非尼酮抑制TGF-β受刺激的胶原合成、肌成纤维细胞分化和人肺成纤维细胞的成纤维活性[4- - - - - -6］．肺泡巨噬细胞、II型AECs、肌成纤维细胞、嗜酸性粒细胞是TGF-的主要来源β在肺纤维化中[40］．TGF -β吡非尼酮是II型AECs细胞凋亡的强诱导物，其作用可能通过抑制TGF-β途径。

5.结论

Kca3.1离子通道特异性抑制剂的体内阻断可减轻II型aec和巨噬细胞的内质网应激和凋亡。我们的数据提供了该药物如何与纤维化肺组织中的这些细胞类型相互作用的见解，从而有助于理解其在肺纤维化中的抗纤维化作用。

缩写

IPF:	特发性肺纤维化
呃:	内质网
原子能委员会:	肺泡上皮细胞
KCa3.1:	钙活化钾离子通道
GRP78:	葡萄糖调节蛋白78
食品药品监督管理局:	食品药品监督管理局
TGF -β：	转化生长因子β
10月:	最佳切削温度
PBS:	磷酸盐缓冲盐水
TdT):	末端脱氧核苷酸转移酶
BSA:	牛血清白蛋白
NSS:	正常羊血清
TUNEL:	末端脱氧核苷酸转移酶dutp缺口末端标记
轻拍:	Diaminobenzidine
扫描电镜:	平均标准误差
LC:	左尾
RC:	正确的尾
BLM:	博来霉素。

数据可用性

本研究的原始数据集可根据要求从通讯作者处获得。

伦理批准

所有与绵羊实验和样本收集有关的实验程序都得到了墨尔本大学(Parkville, VIC, Australia)动物实验伦理委员会的批准，并遵守了《澳大利亚科学目的动物护理和使用行为准则》。

利益冲突

作者宣称他们没有利益冲突。

作者的贡献

UEP是这项研究的主要研究人员;她进行了实验室工作，统计分析和解释。UEP和KJS参与了概念和研究设计，并准备了手稿。LO和SNVD建议研究方法。AS辅助免疫组化。AS和HBD协助编写稿件。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

致谢

作者要感谢墨尔本大学解剖病理学技术人员Paul Benham先生在绵羊免疫组化方面的协助。

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