FOXO1在抗结核药物肝毒性作用中的遗传和功能评价

摘要

背景．氨基乙酰丙酸合成酶1 (ALAS1)激活引起的肝毒性物质原卟啉IX (PPIX)的积累是抗结核药物肝毒性(ATDH)的重要机制之一。叉头盒蛋白O1 (FOXO1)可能激活ALAS1转录。然而，对其在ATDH中的作用知之甚少;必威2490我们进行了一项研究，以确定这两个基因的多态性与ATDH易感性之间的关联。然后，我们通过细胞功能实验验证了这种可能的关联。材料和方法．对746例肺结核患者进行了这两个基因的标记单核苷酸多态性(TagSNPs)基因分型。比较病例组和对照组的等位基因频率、基因型、遗传模式和单倍型分布。L-02细胞和HepG2细胞在指定浓度的异烟肼(INH)和利福平(RIF)孵育所需时间后，检测ALAS1和FOXO1 mrna和蛋白的表达水平。将FOXO1 siRNA瞬时转染HepG2细胞，观察FOXO1表达变化对细胞存活率和ALAS1表达的影响。结果．FOXO1基因中rs2755237的C等位基因和rs4435111的T等位基因与ATDH风险降低相关。INH/RIF共给药后，ALAS1在L-02细胞和HepG2细胞中的表达均增加(600/200μM) 24小时。虽然FOXO1的表达在相同处理下略有降低，但其在细胞核中的含量却显著增加。但下调FOXO1对HepG2细胞的存活率和ALAS1表达水平无明显影响。结论．FOXO1基因rs4435111和rs2755237位点变异与ATDH易感性相关。INH/RIF共给药促进FOXO1从细胞质向细胞核转移，但其核易位的功能意义有待进一步验证。

1.简介

古老的传染病结核病仍然严重威胁着人类的健康。根据《2020年全球结核病年度报告》，2019年约有1000万人罹患结核病，其中估计有120万人死于结核病。必威2490中国结核病患者约占全球的8.4% [必威24901］．异烟肼(INH)和利福平(RIF)是世界卫生组织推荐作为一线抗结核治疗的主要药物。该方案有效率高达85%，但同时给药INH和RIF引起的不良反应不可忽视。在这些不良反应中，以抗结核药物致肝毒性(ATDH)最为常见和严重，发生率为5.0-28.0%，死亡率为0.042-0.07‰[2- - - - - -4］．ATDH的发生没有明显的剂量依赖性报道，其发病率、临床症状和严重程度在个体间存在较大差异[5］．虽然近几十年来研究者报道了许多研究成果，但其机制尚未完全阐明。由于缺乏特异性症状和诊断性生物标志物，ATDH的诊断目前仍是一个具有挑战性的临床问题。

药物基因组学是研究不同个体因遗传背景导致药物代谢和转运能力差异的重要工具。药物基因组学研究通过分析靶基因易感位点与药物反应表型之间的相关性，已确定个体中存在的基因突变是ATDH的独立危险因素[6，7］．单核苷酸多态性(Single-nucleotide polymorphisms, SNPs)是药物基因组学中的主要分子标记物，已被证明具有潜在的临床应用价值。例如，由于n -乙酰转移酶(N-acetyltransferase, NAT2)基因“慢乙酰化”表型与INH血药浓度升高有关，并伴随肝毒性发生率增加，FDA已将NAT2基因表型纳入INH药品标签中[6］．PHARMGKB数据库还推荐重要的NAT2基因变异作为预测结核病患者因INH引起ATDH风险的临床标记物[8］．研究参与ATDH发病机制的关键信号通路的基因多态性，有助于筛选特异性靶点作为诊断、治疗效果和预后的生物标志物。

2012年，Li等人发现INH/RIF共给药导致内源性肝毒性物质原卟啉IX (protoporphyrin IX, PPIX)在人源化表达孕烷X受体(PXR-)的小鼠肝脏中积累。INH/RIF共给药引起PXR/ALAS1轴的激活导致PPIX积累是ATDH的重要机制之一。在ATDH机制的研究历史上具有里程碑意义[9，10］．氨乙酰丙酸合成酶1 (Aminolevulinate synthase 1, ALAS1)是血红素生物合成途径中第一个限速酶。ALAS1的产物氨基乙酰丙酸(ALA)是PPIX的前体。ALA的合成速率与血红素的合成速率呈正相关，以保证细胞色素酶生物合成所需的血红素供应[11］．不仅ALAS的转录激活与haem的含量相协调，而且肝脏中haem的含量也负向调控ALAS1的转录激活。例如，细胞色素酶合成的需求增加导致血红素的相对缺乏会激活ALAS的转录;过量的血红蛋白直接降低ALAS1 mRNA的稳定性，抑制ALAS1 mRNA的转录。ALAS1转录和血红素含量之间的平衡保证了ALAS1转录保持低基线激活状态，以防止过量游离血红素和血红素前体积累造成的潜在损伤[12，13］．

PXR是诱导ALAS1转录的重要转录因子[9- - - - - -11］．然而，ALAS1基因的转录平衡并不完全依赖于PXR。不同的外部或内部刺激诱导相应的信号通路的激活以协调PXR/ALAS1轴，如对生长激素脉冲敏感的肝细胞核因子4 (HNF4)通路:对胰岛素敏感的叉头盒蛋白O1 (FOXO1)通路;过氧化物酶体增殖物激活受体γcoactivator-1α(PGC-1α)通路，对高血糖敏感[12，14］．值得注意的是，高浓度葡萄糖输注可有效快速缓解急性卟啉发作的临床症状，提示血糖或血糖相关激素水平可能通过FOXO1或PGC-1将内源性代谢信号转化为ALAS1转录调控信号α维持卟啉平衡[14，15］．在小鼠和家禽中，ALAS1基因的启动子包含一个ALAS1药物应答增强子序列(ADRES)，这是一个与糖异生基因的胰岛素应答元件(IRE)区域高度同源且保守的DNA序列。FOXO1通过结合IRE结构域启动糖异生相关基因的转录[16］．FOXO1在细胞核中与PGC-1相互作用α形成异二聚体，通过与ADRES结合以一种熟悉的方式促进ALAS1转录。该异源二聚体在小鼠体内的表达水平与ALAS1 mRNA表达水平呈正相关，提示FOXO1以FOXO1/PGC-1的形式参与了诱导ALAS1转录调控α异质二聚体(14，17］．人类ALAS1基因启动子区域也包含一个类似的区域，具有结合FOXO1/PGC-1的潜在能力α异二聚体，尽管机制尚不清楚[13，15，18- - - - - -20.］．然而，研究人员尚未明确FOXO1是否以及如何将抗结核药物的刺激转化为ALAS1基因表达。

PXR与PGC-1关系的研究α与ATDH风险相关的基因多态性已被报道[21- - - - - -23］．然而，据我们所知，FOXO1和ALAS1变异与ATDH易感性之间的遗传关联尚未被报道。因此，鉴于中国结核病的严峻形势，本研究旨在探讨FOXO1和ALAS1基因多态性与中国汉族人群ATDH发病风险之间的可能关联，并通过细胞功能实验验证其相关性。

2.材料和方法

2.1.患者的招募和肝毒性的定义

本研究纳入746例确诊为结核病的患者，均为2014年12月至2018年4月在华西医院招募的患者，根据我们既往研究的纳入和排除标准[21，24］．简单地说，ATDH组的入选标准如下:(a)治疗前正常血清谷丙转氨酶(ALT) (0-40 IU/L)和谷草转氨酶(AST) (0-40 IU/L)水平;(b) ALT和/或AST水平≥3 ×有肝炎症状的正常(ULN)上限(120 IU/L);(c) ALT和/或AST水平≥5 × ULN (200 IU/L)，有或没有症状;总胆红素(TBIL)水平≥1.5 × ULN (42μmol / L);(e)未服用其他潜在肝毒性药物;及(f)无感染肝炎病毒或人类免疫缺陷病毒的历史[25，26］．非atdh组的入选标准为治疗前后正常血清ALT、AST、TBIL水平。报名过程如图所示S1．本研究已获得四川大学华西医院机构审查委员会的伦理批准。本研究中药物致肝毒性的定义基于美国国立卫生研究院和不良事件通用毒性标准v5.0 (CTCAE v5.0) [24，25，27］．肝毒性程度的定义依据WHO药品不良反应术语:轻度肝损伤，ALT水平<5 ×正常上限(ULN) (200 IU/L);中度肝损伤，ALT大于5 × ULN小于10 × ULN;ALT水平≥10 × ULN (400 IU/L) [27］．

2.2.候选单核苷酸多态性的选择和基因分型

使用以下策略选择候选snp:(1)通过搜索dbSNP数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)及千人基因组计划(http://www.1000genomes.org/) [28];(2)微小等位基因频率(MAF)≥0.02且连锁不平衡(LD)的snpr²南方汉族(CHS)人群≥0.8;(3)根据既往研究，优先纳入可能与ATDH风险相关或具有潜在功能意义的snp [21，29］．

本研究使用的样本和数据均来自中国四川大学华西医院检验科“结核病研究”生物库资源，如前所述[29］．根据制造商说明，使用QIAamp®DNA血液迷你试剂盒(Qiagen，德国)提取基因组DNA。如前所述，SNP基因分型工作使用定制设计的2 × 48-Plex SNP扫描TM Kit (Cat#: G0104, Gene sky Biotechnologies Inc, Shanghai, China)进行[30.］．为保证基因分型结果的重复性和稳定性，随机抽取30只样本进行双盲实验，所有基因型召唤成功率均大于99.0% [23］．

2.3.细胞培养与化学

实验所用的HepG2细胞和L-02细胞分别购自中国武汉凯西莫生物科技有限公司和中国武汉赛尔生物科技有限公司。INH和RIF购自Sigma (St. Louis, MO)。L-02细胞和HepG2细胞在Dulbecco改良的Eagle培养基(HyClone;Logan, UT)添加10%胎牛血清，100单位/ml青霉素G, 100 mg/ml链霉素，在5% CO的湿化气氛中₂在37°C。INH和RIF溶解于二甲亚砜(DMSO)中，最终浓度为30/10μ米,75/25μ米,150/50μ米,300/100μ米,600/200μ米,1200/400μ米,2400/800μ米(31］．

2.4.MTT细胞毒性试验

L-02和HepG2细胞(5 × 10^3.细胞/孔)接种于96孔板，在达到60%汇合后的指定时间点暴露于所需浓度的INH/RFP或空白对照。然后，细胞与3-(4,5 -二甲基噻唑-2-基)- 2,5 -二苯四唑溴化铵(MTT) (0.5 mg/mL)在37℃孵育4 h，形成甲氮杂晶体。去除上清液后，formazan晶体溶解于DMSO (150 ml/孔)中。在490 nm处测量光密度。细胞活力以对照的百分比归一化。实验独立进行，一式三份[31］．

2.5.定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)

分别用适当浓度的INH/RIF或空白对照处理L-02和HepG2细胞24 h，提取RNA。RNA (1μg)用cDNA合成试剂盒(Roche, Switzerland)逆转录。利用20个cDNA模板进行PCRμ根据制造商说明，在Bio-Rad CXF实时PCR检测系统(Bio-Rad，美国)中使用SYBR预混料Ex Taq(瑞士罗氏公司)。RT-PCR引物序列见表S1．用归一化值计算对照组与INH/ rif处理细胞的表达变化，以倍变= 2计算^−ΔΔCt计算放大产物的相对含量。所有检测均在3个重复中进行[32］．

2.6.西方墨点法(WB)

用含有0.1 mol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解缓冲液(GIBCO BRL，美国)裂解细胞。采用BCA蛋白法测定总蛋白表达量。蛋白质(500μg)细胞裂解液通过SDS-PAGE分离，使用10% tricine凝胶，在4°C转移到PVDF膜上1.5小时，用5%脱脂牛奶在含有0.1% Tween 20的tri缓冲盐水中封闭，随后使用抗alas1(1:10 00)和抗foxo1(1:30 00)抗体和辣根过氧化物酶结合二抗(Proteintech，美国)进行免疫印迹。蛋白质定量的方法是计算样品中亮度值蛋白质条带与相应内参(GAPDH)条带亮度值的比值。调整蛋白条带亮度值后，以对照组为标准值[31］．

2.7.核蛋白提取与制备

分别在L-02或HepG2细胞中添加相应浓度的INH/RIF或对照。用PBS清洗细胞2次，刮入300μl的RIPA缓冲液。离心收集细胞，重悬400次μL冷低渗缓冲液，在冰上孵育10分钟。离心成球，200重悬μ取L的裂解缓冲液，在冰上孵育20分钟。悬浮液收集并保存在−80°C。冷低渗缓冲液含1ml低渗缓冲液+ 5μL的磷酸酶抑制剂+ 10μL (PMSF + 1μ二硫苏糖醇L (DTT) [33］．

2.8.CCK-8细胞存活率测定

将对数生长期细胞胰蛋白酶制备细胞悬液，接种于96孔板(每孔10000个细胞，每孔100个细胞)μl培养基)，在5% CO湿化的培养箱中培养₂一夜之间在37°C。边缘孔填入无菌PBS。电镀时间为接种后24 h，转染时间为48 h，测量时间为96 h。每孔加入10微升CCK-8溶液，孵育1小时。用酶标仪在450 nm处测量吸光度值。实验结果由六个独立实验计算得出。

2.9.RNA干扰与瞬时转染

一个打乱序列的siRNA作为阴性对照(NC siRNA)。HepG2细胞接种于6孔板中，培养至70%合流，使用Lipofectamine™2000转染试剂(Invitrogen, USA)将含有100 pmol FOXO1 siRNA或NC siRNA的转染混合物转染到细胞中，方法为之前报道的[32］．转染后的细胞再培养24小时，收集细胞以测定mRNA和蛋白水平。本研究中针对FOXO1的小干扰RNA (siRNA)序列如表所示S2．

2.10.统计分析

独立样本t-测试和曼-惠特尼U根据数据的正态性对连续变量进行检验。分类变量的分析采用卡方检验。采用单因素方差分析(One-way ANOVA)比较各组与对照组的平均值。使用IBM SPSS统计软件22.0对上述统计分析进行评估。使用Plink软件版本1.07评估snp的Hardy-Weinberg平衡(HWE)以及snp与年龄和性别调整后的ATDH之间的关联。采用haplotype软件4.2版本进行连锁不平衡(LD)和单倍型分析[29］．比值比(OR)与相应的95%置信区间(CI)被用作关联的衡量标准，并且是双向的 被认为是显著的[34］．

3.结果

3.1.研究对象的一般特征

与非ATDH组相比，ATDH组发热患者较少。同时，ATDH组患者总胆红素(TBIL)、结合胆红素(DBIL)、天冬转氨酶(AST)、ALT、碱性磷酸酶(ALP)、谷氨酰基转移酶(GGT)的基础水平较高，尿酸(UA)的基础水平较低(均为TBIL) )，如我们之前的文章所述[21］．患者的人口学和临床特征如表所示S3．

3.2.SNP等位基因，基因型，遗传模型和单倍型分析

本研究在746名参与者中筛选出3个ALAS1 snp (rs353556、rs3852071、rs352169)和5个FOXO1 snp (rs2755237、rs2701891、rs3751436、rs4435111、rs7325594)并成功分型。SNP基因型分布均未偏离Hardy-Weinberg平衡(HWE) ( 对于所有位点)。FOXO1和ALAS1基因候选单核苷酸多态性的基本特征见表S4．

FOXO1基因rs2755237位点C等位基因的携带者发生ATDH的风险低于a等位基因的携带者(OR = 0.631;95%置信区间:0.423—-0.942, ）在调整了年龄和性别之后。FOXO1基因rs4435111位点T等位基因携带者发生ATDH的风险低于C等位基因携带者(OR = 0.572;95%置信区间:0.372—-0.879, ）在调整了年龄和性别之后。rs2755237位点CC/CA/AA基因型分布频率在ATDH组与非ATDH组间呈边缘显著性差异(3.41%/38.46%/58.12% vs. 6.40%/46.88%/46.72%; ）.rs4435111位点TT/CT/CC基因型频率在两组间差异有统计学意义(1.69%/27.12%/70.33% vs. 4.61%/37.10%/58.28%， ）.FOXO1基因中其他位点和ALAS1基因中所有位点的等位基因频率和基因型频率在两组间均无显著差异 ．等位基因和基因型频率如表所示1．

两个基因的遗传模型分别采用加性模型、显性模型和隐性模型进行分析。rs2755237基因座优势模型显示，CC + CA基因型患者发生ATDH的风险较AA基因型患者降低36.9% (OR = 0.631;95%置信区间:0.423—-0.942, ）.rs4355111基因座优势模型显示TT + CT基因型患者发生ATDH的风险比CC基因型患者降低42.8% (OR = 0.572;95%置信区间:0.372—-0.879, ）.两个基因座的加性模型也显示ATDH风险降低(OR = 0.658;95%置信区间:0.464—-0.932, OR = 0.591, 95% CI: 0.401-0.869， ，分别)。候选snp的遗传模型分析结果如表所示2．

连锁失衡和单倍体分析有助于探索目标snp对关注疾病的联合效应[35］．连锁不平衡分析显示FOXO1基因rs3751436和rs4435111位点处于强连锁不平衡(D' = 0.92;r²= 0.81)，该基因座形成的TT单倍型在ATDH组的分布频率低于非ATDH组(15.2% vs. 22.6%， )，提示这些位点可能与ATDH易感性有关。ALAS1基因中没有一个snp显示紧密连锁，不适合进行单倍型分析。单倍体分析如图所示1，单倍型分布与ATDH风险的相关性如表所示3.．

我们寻找目标SNP位点与ATDH临床特征之间的关联。rs2755237基因座CC基因型携带者白细胞计数和血糖水平较低，ALT水平较高，rs4435111基因座TT基因型携带者红细胞沉降率(ESR)高于CC基因型携带者，Dbil水平低于CC基因型携带者，见表S5而且S6．但两个位点的不同基因型与肝毒性的严重程度无相关性，如表所示S7．

3.3.INH/RIF对L-02和HepG2细胞的细胞毒性作用

我们采用MTT法检测L-02细胞在不同浓度的INH/RIF联合作用24 h或48 h后的活力，以选择合适的药物浓度和处理时间进行后续实验。细胞存活率在150/50μ米,300/100μ米,600/200μM组孵育24 h后分别为79.45%、72.93%和66.84%。孵育48 h后，细胞存活率更低。基于此结果，L-02细胞的活力以药物浓度和时间依赖性的方式降低。INH/RIF (600/200μM)孵育24 h后显著降低细胞活力。我们还进行了MTT试验来检测HepG2细胞的活力，避免了使用单细胞系的选择偏差，结果表明，细胞活力为600/200μM组孵育24 h后降至60.89%(必要时可获得数据)。以上结果表明，INH/RIF对两个细胞系的细胞毒性相似。因此，我们选择24 h为合适的INH/RIF给药时间点，600/200μM作为后续实验的合适浓度，除非另有说明。

3.4.INH/RIF处理后细胞中ALAS1和FOXO1 mRNA及蛋白表达的变化

INH/RIF组L-02细胞ALAS1 mRNA表达水平(8.521±0.9036)高于空白组(1.000±0.01549)、INH组(2.762±0.1005)和RIF组(3.63 ~ 0.2291) ．由此可见，INH/RIF增加了L-02细胞中ALAS1 mRNA的表达。同样，INH/RIF可增加HepG2细胞中ALAS1 mRNA的表达水平。与空白组相比，INH/RIF组在L-02细胞和HepG2细胞中FOXO1 mRNA水平均略有降低。INH/RIF对L-02细胞和HepG2细胞中ALAS1和FOXO1 mrna水平的影响如图所示2．与mRNA数据一致的是，24 h后INH/RFP使ALAS1蛋白水平升高，FOXO1蛋白水平降低。INH/RIF对L-02细胞和HepG2细胞中ALAS1和FOXO1蛋白水平的影响如图所示3.．FOXO1的转录促进功能与其定位有关[14，15]，我们还检测了细胞核中FOXO1蛋白的含量。有趣的是，在L-02和HepG2细胞中，INH/RIF处理24 h后细胞核内FOXO1水平均显著升高，如图所示3.．虽然INH/RIF能轻微降低FOXO1在细胞中的总量，但其诱导FOXO1从细胞质向细胞核转移的机制尚不清楚。

3.5.FOXO1对细胞存活率及ALAS表达水平的影响

由于INH/RIF提高了FOXO1蛋白在细胞核中的表达水平，我们推测其可能通过调控ALAS1转录来影响细胞存活率。设计3种sirna (FOXO1 shF1、FOXO1 shF2和FOXO1 shF3)干扰FOXO1的表达水平。通过检测FOXO1 mRNA水平来测定干扰效率。与shF2组相比，shF1和shF3诱导的下调稳定且显著(必要时可获得数据)。因此，我们选择shF1和shF3，瞬时转染HepG2细胞，分别加入或不加入INH/RIF，验证FOXO1的表达是否与细胞存活率相关。CCK-8测定结果如图所示4．shF3组细胞存活率略高于对照组(0.9490±0.0549∶0.8559±0.0175， ）没有异烟肼/ RIF。INH/RIF处理组细胞存活率略高于对照组。遗憾的是，差异不显著(0.6410±0.03846 vs. 0.6136±0.02898， ）.INH/RIF处理后shF1组与对照组细胞存活率差异均无统计学意义 ．结果表明FOXO1可能对INH/ rif诱导的细胞毒性没有显著影响。

FOXO1与胰岛素一起通过PI3K/Akt信号通路调控ALAS1转录[15］．我们用shF1、shF3和siRNA对照转染HepG2细胞，检测ALAS1 mRNA和蛋白水平，以阐明FOXO1是否通过INH/RIF刺激转化信号诱导ALAS1转录。无论INH/RIF处理与否，两组干扰组与siRNA对照组之间的ALAS1 mRNA表达水平均无差异。与mRNA水平一致，干扰组的蛋白质水平与对照组也无显著差异，如图所示4．结果表明，FOXO1对INH/RIF刺激后ALAS1的表达水平影响不大。

4.讨论

本研究分析了FOXO1和ALAS1基因多态性与ATDH易感性的相关性。FOXO1基因rs4435111和rs2755237位点变异与ATDH易感性相关。INH/RIF共作用于L-02细胞或HepG2细胞后，ALAS1表达增加，FOXO1表达降低，但这些变化都伴随着细胞核内FOXO1水平的相对升高。我们用sirna干扰FOXO1表达水平，以明确FOXO1是否通过诱导ALAS1转录影响细胞存活，并没有观察到细胞存活率或ALAS1表达水平的显著变化。从这些结果来看，FOXO1可能并不是ATDH发病机制中的重要靶点，但FOXO1与ATDH发病风险确实存在一定的相关性。

ALAS1蛋白是肝脏中催化ALA产生原卟啉合成血红素的限速酶。然后在铁螯合酶(FECH)蛋白的作用下，原卟啉转化为血红素，血红素最终生成。ALAS1引起的卟啉代谢失衡已被证实与卡马西平、四氯对苯二酚、六氯苯引起的肝损伤有关[36- - - - - -39］．我们分析了ALAS1基因中的三个snp位点(rs353556、rs3852071和rs352169)，但没有观察到与ATDH易感性的相关性。下面描述了这一结果的可能解释。(1)本研究中标签snp的入选标准之一是中国南方汉族人群的MAF≥0.02。它可能排除MAF < 0.02 (CHS)的潜在相关snp。(2)由于ALAS1基因的遗传保守性，目前还没有明确发现ALAS1的遗传变异与卟啉病发作的临床表型或严重程度相关[14，39］．(3)卟啉平衡受多种因素的调节，如内部环境与身体的生理病理状态、外部环境(如药物或压力刺激)、内外环境的交互作用等。卟啉代谢异常的发生是由多种调控紊乱同时引起的，如强烈刺激、转录水平升高、转录后修饰和翻译后负反馈机制失活等机制，以“多重打击”的形式[14］．

FOXO1基因位于染色体13q14.11上，编码FOXO1蛋白，属于FOXO家族。FOXO1通过穿梭进入细胞核与启动子结合，激活靶基因的转录活性[40］．FOXO1在调节细胞内稳态、糖代谢、免疫应答、细胞周期进程、凋亡和衰老等方面发挥着多种重要作用[14，15］．FOXO1可能通过胰岛素刺激后诱导ALAS1基因转录来调节卟啉代谢，这可能是PXR/ALAS1轴的辅助机制[14］．ATDH组FOXO1基因rs4533111位点的等位基因频率、基因型频率、遗传模式和单倍型频率在ATDH组与非ATDH组之间存在显著差异。FOXO1基因rs2755237位点的等位基因频率和遗传模式在ATDH组与非ATDH组之间存在显著差异。主要基因型-组织表达(GTEx)项目数据库中来自多个组织的基因组表达定量性状位点(Genome-wide expression quantitative trait loci, eQTL)数据被广泛用于注释snp的生物学功能[41］．我们利用HaploReg version 4.1检索基因组eQTL数据，预测rs4435111和rs2755237的潜在生物学功能。https://pubs.broadinstitute.org/mammals/haploreg/haploreg.php)，发现rs4435111是WBP4基因在骨骼肌组织和皮肤中的表达的eQTL, rs2755237是SLC25A19基因在全血单个核细胞中的表达的eQTL。然而，我们还没有确定这两个位点是否与肝脏中任何基因的表达有关。生物功能注释如表所示S8．我们也从一个网站(http://bioinfo.bjmu.edu.cn/mirsnp/search/)，以寻找与rs2755237或rs4533111具有强连锁不平衡的潜在功能性snp，但没有获得任何有价值的线索(数据未显示)。SNP的位置往往与相应的功能有关:编码区SNP的突变可能会由于碱基的改变而改变遗传密码，或由于核糖体通过mRNA特定区域的速度而影响翻译动力学，最终改变编码蛋白的结构;基因调控区域的snp可能通过影响转录启动子或其他转录因子的结合来调控基因的功能;而位于基因内含子中的SNPs可能由于可变的剪接而发挥作用[42，43］．rs4435111和rs2755237均位于FOXO1基因的内含子区域。这些snp是否会通过选择性剪接影响基因的转录或翻译，还需要功能实验来验证。

由于FOXO1基因多态性与ATDH易感性相关，我们提出FOXO1表达通过调控ALAS1转录参与INH/RIF引起的肝毒性。用L-02细胞和HepG2细胞观察INH/RIF共给药对ALAS1和FOXO1表达的影响，验证这一假说。INH/RIF使ALAS1 mRNA和蛋白水平升高，提示卟啉合成途径被激活。尽管INH/RIF对FOXO1的表达水平影响不大，但这些处理显著改变了FOXO1的细胞亚定位，说明FOXO1蛋白是通过某种未知的机制从细胞质转移到细胞核的。既往研究证实FOXO1在正常或高血糖状态下的细胞内定位和激活主要与胰岛素水平有关。(1)胰岛素通过PI3K/AKT/FOXO1信号通路抑制糖异生从而降低血糖水平。胰岛素诱导FOXO1在thr24、Ser-256和Ser-322位点磷酸化，磷酸化的FOXO1可能从细胞核转移到细胞质，并通过细胞质中泛素介导的蛋白酶体途径降解。随着细胞核中FOXO1蛋白含量的降低，肝脏中糖异生相关基因的转录激活被抑制，导致糖异生减少[14］．(2)胰岛素可能会破坏FOXO1/PGC-1的形成α异二聚体，是通过结合ALAS1启动子中的药物反应元件来激活ALAS1基因转录所必需的[15］．然而，在胰岛素水平绝对或相对不足的情况下，如空腹或感染应激，FOXO1可能在jun - n-末端激酶(Jun-N-terminal kinase, JNK)信号通路的作用下从细胞质转移到细胞核内[14］．RIF通过一种未知的机制激活JNK通路[14，44］．因此，我们推测FOXO1可能在INH/RIF刺激下通过JNK通路被激活并转移到细胞核。

JNK通路在细胞应激调节中发挥重要作用，因此，JNK通路刺激的FOXO1易位可能与炎症调节一致，这与我们的假设有所不同。然而，这一发现与细胞功能实验的结果是一致的。我们发现FOXO1表达水平的变化对ALAS1 mRNA和蛋白水平没有显著影响。此外，它对细胞存活率的影响很小。越来越多的研究者注意到FOXO1不仅是葡萄糖和能量代谢的重要调控基因，也是调节炎症的重要靶点[45，46］．Brown等人假设脂多糖(LPS)可促进肿瘤坏死因子-的产生α(肿瘤坏死因子-α)和白细胞介素-6 (IL-6)通过FOXO1介导的机制，提示FOXO1是炎症反应的激活剂。Fan等发现FOXO1激活toll样受体4 (TLR4)及下游炎症因子启动炎症反应，激活FOXO1/TLR4轴通过磷酸化可逆地失活foxo1，从而阻碍炎症级联反应[47］．研究者推测FOXO1/TLR4将代谢应激转化为炎症反应，具有自限性负反馈，避免炎症的过度激活[47］．FOXO1可能在炎症反应中起双向调节作用。根据Jiang等人的研究，TNF-的产生α以及LPS通过FOXO1/TLR4诱导的IL-6依赖于JNK通路，进一步阐明了FOXO1的炎症调节与JNK通路相关[48］．根据文献和我们的研究结果，我们推测FOXO1表达和细胞亚定位的变化可能是继JNK通路激活后发生的，因此FOXO1的调控对细胞存活和ALAS1表达水平没有显著影响。

我们的研究有几个优势。(1)本研究仅纳入西部地区最优质医疗服务的华西医院的患者，以确保ATDH的监测标准严格，避免误分。(2)检测实验室经美国病理学家协会(CAP)认证，确保所有实验室数据质量好、可靠。(3)在分析遗传多态性与ATDH易感性相关性的基础上，我们进行了细胞功能测试，以验证可能的相关性。我们的研究也有一定的局限性。(1)与ATDH易感性相关的rs4435111和rs2755237位点均位于内含子区域，未发现与之存在强连锁不平衡的功能性snp。它们在ATDH机制中的功能意义在一定程度上难以通过基于细胞的实验来验证。(2) RNA干扰并不能明确降低FOXO1在细胞核中的含量。虽然sirna能有效降低FOXO1总蛋白水平，但其效果不如基因敲除。由于JNK通路被INH/RIF或其他机制激活，FOXO1从细胞质转移到细胞核。 As the ALAS1 gene usually maintains a low baseline level of transcription [13]， FOXO1在细胞核中可能足够有效地与PXR协同激活ALAS1。因此，需要更严格的实验设计来阐明FOXO1对ALAS1转录的影响。

综上所述，FOXO1基因rs4435111和rs2755237的遗传多态性与ATDH易感性相关。然而FOXO1可能并不是ATDH机制中重要的靶分子，其表达和亚细胞定位的变化可能是INH/RIF刺激后JNK通路激活以适应细胞应激的一种二级调控形式。FOXO1移入细胞核对ATDH的功能意义还有待进一步验证。

缩写

结核病:	肺结核
RIF:	利福平
异烟肼:	异烟肼
ATDH:	对公开药物引起的肝毒性
单核苷酸多态性:	单核苷酸多态性
NAT2:	N-Acetyltransferase
PPIX:	原卟啉IX
PXR:	孕烷X受体
ALAS1:	Aminolevulinate合酶1
阿拉巴马州:	Aminolevulinic酸
HNF4:	肝细胞核因子4
FOXO1:	叉头箱蛋白
PGC-1α：	过氧物酶体proliferator-activated受体-γcoactivator-1α
这条:	ALAS1药物响应增强子序列
愤怒:	胰岛素响应要素
CTCAE v5.0:	美国国立卫生研究院和不良事件通用毒性标准v5.0
ALT:	丙氨酸转氨酶
ULN:	正常上限
加:	轻微的等位基因频率
LD:	连锁不平衡
CHS:	南方汉族
麻省理工:	3-(4,5 -二甲基噻唑-2-基)- 2,5 -二苯四唑溴化铵
DMSO溶液:	二甲亚砜
rt - pcr:	定量逆转录酶聚合酶链反应
白平衡:	西方墨点法
PMSF:	Phenylmethylsulfonyl氟化
德勤:	二硫苏糖醇
治疗组:	总胆红素
DBIL:	结合胆红素
AST:	天冬氨酸转氨酶
高山:	碱性磷酸酶
GGT:	谷酰基转移酶
UA:	尿酸
HWE:	哈迪温伯格平衡
ESR:	红细胞沉降率
核:	小干扰RNA
他进来:	亚铁螯合酶
eQTL:	全基因组表达数量性状位点
GTEx:	Genotype-tissue表达式
物:	Jun-N-terminal激酶
有限合伙人:	脂多糖
肿瘤坏死因子-α：	肿瘤坏死因子-α
il - 6:	白细胞介素- 6
TLR4:	toll样受体4
帽子:	美国病理学家协会。

数据可用性

支持本研究结果的数据包含在文章和补充信息文件中。

伦理批准

本研究已获得四川大学华西医院机构审查委员会的伦理批准。

的利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

这篇文章是张经纬写的。应宾武对该研究的概念和设计做出了贡献。林娇、白皓和张经纬进行了实验。Tangyuheng Liu、Zhenzhen Zhao和Xuejiao Hu进行了数据采集。宋佳佳和吴涛对数据进行了分析。所有作者都参与了文章的起草和修改，并通过了文章的最终版本。

致谢

基金资助:国家自然科学基金(批准号:)81672095)，四川省卫生计委科技项目(19PJ163)，成都市卫生项目(20190679)。

补充材料

图S1:研究人群的流程图。表S1: RT-PCR引物序列。表S2:本研究中针对FOXO1的siRNA序列。表S3:入组患者的人口学、临床特征和实验室指标。表S4: FOXO1和ALAS1候选单核苷酸多态性。表S5:实验室各项指标与rs2755237位点基因型的相关性。表S6:实验室各项指标与rs4435111位点基因型的相关性。表S7:基因型分布与不同严重程度的相关性分析。表S8: ATDH相关snp的潜在生物学功能注释。（补充材料）

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