杜仲叶水提物促进成骨细胞样MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化

摘要

杜仲的叶子是干叶杜仲长期以来被认为是一种治疗高血压、高胆固醇血症、脂肪肝、骨质疏松的功能性保健食品。随着中药的发展，杜仲叶被广泛用于补肾健骨。然而，杜仲叶增强骨骼的具体分子机制仍不清楚。成骨细胞是骨形成的主要功能细胞;因此，有必要研究杜仲叶对成骨细胞的影响，以便更好地了解其作用机制。本研究制备了杜仲叶水提物(ELAE)，并采用高效液相色谱法(HPLC)测定其含量。采用CCK-8法、碱性磷酸酶(ALP)、茜素红S染色法，结合RNA测序(RNA-seq)和qRT-PCR验证，研究ELAE对MC3T3-E1细胞的影响。我们发现ELAE对MC3T3-E1细胞的增殖有显著的促进作用，并显著增强细胞外基质的合成和矿化，这是通过调控多种功能基因和相关信号通路实现的。ELAE显著提高了促细胞增殖基因Rpl10a、Adnp、Pex1、Inpp4a、Frat2、Pcdhga1的表达水平，降低了抑制细胞增殖基因Npm1、Eif3e、Cbx3、Psmc6、Fgf7、Fxr1、ddx3、Mbnl1、Cdc27的表达水平。ELAE还提高了成骨细胞中Col5a2、Ubap2l、Dkk3、Foxm1、Col16a1、Col12a1、Usp7、Col4a6、Runx2、Sox4、Bmp4等基因标志物的表达水平。 Taken together, our results suggest that ELAE could promote osteoblast proliferation, differentiation, and mineralization and prevent osteoblast apoptosis. These findings not only increase our understanding of ELAE on the regulation of bone development but also provide a possible strategy to further study the prevention and treatment of osteogenic related diseases by ELAE.

1.简介

杜仲又称杜仲、土司皮、杜仲、四中、四仙。杜仲在中国广泛分布[1]，其叶片具有较高的药用价值和商业价值，在国内外得到广泛应用。杜仲叶茶被认为是健康食品，具有很高的药用价值[2］．研究表明杜仲叶具有丰富的药理活性，包括抗氧化作用[1]，抗菌、消炎作用[3.，降血压作用[4，5，以及骨骼生长[6］．

MC3T3-E1是一种来源于小鼠顶骨区的成骨前体细胞;常被用作评估成骨分化和增殖能力的实验模型[7］．在分化过程中，成骨细胞可以表达细胞外基质蛋白，如碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素等骨基质蛋白[8］．

天然药物的发现对于应对全球卫生挑战和实现可持续卫生发展目标具有重要意义[9］．天然药物的开发方法有很多种，其中RNA测序(RNA-seq)是一种重要的方法。RNA-seq因其高通量、检测速度快、分析方法简单而被应用于药物筛选和药物的生物标志物检测[10］．此外，RNA-seq也被广泛应用于骨生物学研究，以解决骨发育和骨病等问题[11］．

以杜仲叶为原料，以最佳得率为标准制备杜仲叶水提液。采用高效液相色谱法测定水提物的主要成分。Cell Counting kit-8 (CCK-8)实验表明杜仲叶对成骨细胞有增殖作用。茜素红染色和碱性磷酸酶染色也显示杜仲叶对成骨细胞的影响。采用先进的RNA-seq技术对杜仲叶对成骨细胞MC3T3-E1的影响进行转录组分析，并通过生物信息学分析筛选差异表达基因。这些结果为揭示杜仲叶水提物对成骨细胞及成骨细胞相关骨病的作用提供了思路。

2.材料和方法

2.1.植物的收集和鉴定

杜仲叶杜仲(图S1)采集自中华人民共和国湖南省张家界市，由萧静蕾教授在长春中医药大学鉴定。

2.2.ELAE制备及HPLC分析

水提液在最佳条件下煮沸制备，滤液用Heto PowerDry LL3000冷冻干燥机(Thermo, USA)冷冻干燥，保存在−80°C。采用高效液相色谱法测定杜仲叶提取物的成分和含量。标准化学品(桃红素、京尼平苷酸、肌肽、儿茶素、异槲皮苷、绿原酸、黄芪甲苷)购自上海源业生物科技有限公司。ELAE的高效液相色谱分析采用2695液相色谱系统，配备倒置C18柱(Waters，美国)。流动相为含乙腈(a)-0.1%磷酸溶液(B)的水梯度洗脱体系，流速为1 ml/min，柱温为35℃。乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)梯度洗脱(0-7 min, 5% A;7-9分钟，5% A⟶8% A;9-28分钟，8% A;28-30分钟，8% A⟶20% A;30-42分钟，20% A; 42–43 min, 20% A ⟶ 50% A; 43–63 min, 50% A; 63–64 min, 50% A ⟶ 5% A). A photodiode array (PDA) detector was set at 254 nm, and the online UV spectrum was recorded within the range of 200–300 nm.

2.3.MC3T3-E1细胞增殖实验

采用Cell Counting kit-8 (CCK-8, Sigma, USA)和克隆形成法分析增殖情况。传代次数少于10次的MC3T3-E1成骨细胞进行传代培养，获得细胞悬液。然后是3 × 10^3.细胞/毫升(100μL /孔)接种于96孔细胞培养板，37℃，5% CO孵育₂培养箱(Thermo, USA) 24小时达到种群倍增时间(PDT)。将不同浓度的ELAE(0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35 mg/mL)分别作用于MC3T3-E1细胞μL /孔)，在培养箱中培养24 h。随后,10μ在黑暗中，每孔加入L CCK-8试剂，孵育60分钟。我们通过使用酶标仪(Tecan，瑞士)测量450 nm处的吸光度来评估细胞活力。

2.4.碱性磷酸酶测定

用ELAE将MC3T3-E1细胞置于6孔板中处理24 h。细胞在室温95%乙醇中固定20分钟，用PBS冲洗，按照制造商说明用BCIP/NBT碱性磷酸酶(ALP)染色试剂盒(Beyotime，中国)染色。照片是用光学显微镜(奥林巴斯，日本)和数码相机拍摄的。为测定碱性磷酸酶活性，按上述方法处理MC3T3-E1细胞，提取蛋白。使用碱性磷酸酶测试试剂盒(Beyotime，中国)，按照制造商的说明来测量碱性磷酸酶酶活。使用酶标仪(Tecan，瑞士)在405 nm处测量碱性磷酸酶活性的吸光度。

2.5.茜素红染色法

根据细胞增殖试验的结果，用最佳浓度的ELAE处理细胞，或用普通培养基(Thermo，美国)处理细胞，孵育24小时。去除所有培养基，用磷酸盐缓冲盐水缓冲液(Thermo，美国)洗涤细胞。4%多聚甲醛室温孵育15 min固定细胞。用Millipore纯化水洗涤3次后，用茜素红S染色液(Solarbio, China)在室温下染色30 min，用纯化水洗涤3次。照片是用光学显微镜(奥林巴斯，日本)和数码相机拍摄的。用氯化十六烷基吡啶一水化物试剂(Solarbio, China)在室温下溶解1 h后，用平板仪(Life science, USA)在光密度(OD) 562 nm下进行定量分析。

2.6.RNA纯化和Illumina测序

MC3T3-E1细胞接种1 × 10⁶细胞/孔置于6孔细胞培养板中，置于37°C, 5% CO培养箱中₂) 12小时。然后，根据细胞增殖试验的结果，将最佳浓度的ELAE或普通培养基(Thermo, USA)添加到相应的6孔细胞培养皿中，孵育24小时。去除所有培养基，用预冷磷酸盐缓冲盐水(Thermo，美国)轻轻冲洗细胞。TRIzol (Invitrogen, USA)用于总RNA的分离。使用安捷伦2100生物分析仪(美国安捷伦科技公司)评估RNA的完整性。根据制造商的建议，使用Tru-Seq单链mRNA试剂盒(Illumina，美国)生成了一对端信使RNA文库。在Illumina Hi-Seq 2500平台(美国Illumina公司)上进行高通量测序。

2.7.RNA-Seq数据分析

经过RNA-seq后，通过base调用将输出的图像数据转换为FASTQ格式的原始数据。对原始读取进行修剪，以删除低质量的读取和适配器序列，并生成干净的读取。数据集被上传到NCBI Sequence Read Archive (SRA)数据库(加入号:PRJNA690876)。随后，读取的数据与鼠标对齐(亩骶)参考基因组使用HISAT计划[12］．采用FPKM算法测量基因表达水平[13］．利用BLAST程序对NR和Swiss-Prot蛋白数据库进行标注。差异表达基因采用DEG-seq程序分析[14］．带有原木的基因₂折叠变化≥1或≤−1，且带a值≤0.001为差异表达基因(DEGs)。

2.8.实时荧光定量PCR验证

采用实时荧光定量PCR (Quantitative real-time PCR, qRT-PCR)对所选基因的RNA水平进行验证。利用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad, USA)从总RNA中获得cDNA。PCR反应使用带有基因特异性引物的SsoAdvanced Universal SYBR®Green Supermix (Bio-Rad，美国)制备，并在CFX Connect实时系统(Bio-Rad，美国)上进行，循环条件如下:95°C 30秒，95°C 39次10秒，60°C 30秒。另外还增加了从65°C加热到95°C的步骤，以生成熔化曲线。相对mRNA水平用2^−ΔΔCT法，以Gapdh为内参基因。

3.结果

3.1.ELAE化学质量控制

ELAE化学质量控制结果如图所示1和表1．化学成分，除了肌肽和异槲皮苷，显示出与先前报道的相同的成分，包括桃金叶苷、京尼平苷酸、芦丁、马钱子苷、绿原酸和黄芪甲苷。

3.2.ELAE对MC3T3-E1增殖的影响

CCK-8法检测杜仲叶水提物对MC3T3-E1细胞增殖的影响。以普通培养基为对照组(空白组)。如图所示2与对照组(0 mg/mL)相比，ELAE组MC3T3-E1成骨细胞存活率显著升高，且呈剂量依赖性，对细胞存活率的影响在0.15 mg/mL时达到峰值。因此，后续实验选择浓度为0.15 mg/mL。

3.3.ELAE对MC3T3-E1细胞分化和矿化的影响

为了评估ELAE是否影响成骨细胞的分化和成熟，我们检测了碱性磷酸酶(ALP)活性并进行了茜素红S染色。与对照组相比，ALP和茜素红活性显著增加3.而且4）.

3.4.测序，基因组图谱和转录注释

如表所示2，经Illumina测序和数据处理后，经普通培养基处理(空白组)和ELAE处理(ELAE组)的MC3T3-E1细胞分别获得41,725,632和39,110394条clean reads。质量评价表明，占比为问30的含量大于93%，GC含量约为52%。必威2490对于Blank和elae处理的样本，分别有39579,052和37,268,736条clean reads被映射到小鼠基因组。总共有13,395个(空白组)转录本和13,471个(ELAE组)转录本分别通过NR NCBI非冗余蛋白数据库和Swiss-Prot数据库进行注释。

3.5.差异表达基因分析

我们鉴定了elae处理组和空白组之间有显著差异表达的634个基因₂Fold change≥1≤−1和 )，其中与空白组相比，ELAE组有30个基因表达上调，641个基因表达下调，见表3.．

3.6.DEGs的功能富集分析

根据对DEGs的功能富集分析，鉴定出的DEGs被划分为以下三类GO:细胞组分、分子功能和生物过程，如图所示5．细胞成分分类显示，大多数DEGs位于细胞外基质、细胞内部分和细胞器区域。分子功能分类表明，这些DEGs的主要功能与结合活性有关，如蛋白质结合和离子结合。生物过程的分类表明，这些DEGs主要参与生物过程，包括代谢过程的调节、单细胞多细胞生物过程和发育过程。

3.7.DEGs途径富集分析

我们进一步在KEGG数据库中搜索已识别的deg。DEGs主要定位于以下信号通路:TNF信号通路、tgf - β信号通路、剪接体、RNA转运、真核生物核糖体生物发生、过氧化物酶体、p53信号通路、核苷酸切除修复、非同源末端连接、nod样受体信号通路、mRNA监测通路、柠檬酸循环(TCA循环)、细胞周期、AMPK信号通路，如图6．

3.8.ELAE对细胞增殖正调控基因表达水平的影响

在已鉴定的DEGs中，以下积极调节成骨细胞增殖的DEGs上调:核糖体蛋白L10A (Rpl10a)、活性依赖性神经保护蛋白(Adnp)、过氧化物酶体生物发生因子1 (Pex1)、肌醇多磷酸-4-磷酸酶I型(Inpp4a)，在晚期T细胞淋巴瘤2 (Frat2)中频繁重排，以及原钙粘蛋白γ亚家族A, 1 (Pcdhga1)，见表4．

3.9.ELAE对细胞增殖负调控基因表达水平的影响

与上述结果一致的是，负调控成骨细胞增殖的DEGs表达下调，包括分泌型核素1 (Npm1)、真核翻译起始因子3、亚基E (Eif3e)、chromobox 3 (Cbx3)、蛋白酶体(prosome, macropain) 26S亚基、atp酶6 (Psmc6)、成纤维细胞生长因子7 (Fgf7)、脆性X智障基因1、常染色体同源物(Fxr1)、DEAD/H (Asp-Glu-Ala-Asp/His)盒多肽3、X-linked (ddx3)、肌盲样1 (Drosophila) (Mbnl1)、细胞分裂周期27 (Cdc27)如表所示5．

3.10.ELAE对成骨细胞标志物表达水平的影响

我们进一步分析了ELAE处理下成骨细胞标志物的表达水平。ELAE轻度上调了5型胶原α 2 (Col5a2)、泛素相关蛋白2样(Ubap2l)、dickkopf WNT信号通路抑制剂3 (Dkk3)、叉头盒M1 (Foxm1)、XVI型胶原α 1 (Col16a1)、XII型胶原α 1 (Col12a1)、泛素特异性肽酶7 (Usp7)、IV型胶原α 6 (Col4a6)、runt相关转录因子2 (Runx2)、SRY (sex- determination region Y)-box 4 (Sox4)， bone morphogenetic protein 4 (Bmp4)，如表所示6．

3.11.存在分析

我们使用qRT-PCR分析来验证RNA-seq结果的准确性。Rpl10a、Adnp、Pex1、Npm1、Eif3e、Cbx3、Col5a2、Ubap2l、Dkk3、Gapdh基因特异性引物序列如表所示7．mRNA相对表达量如图所示7．结果表明，qRT-PCR检测结果与RNA-seq分析结果一致。

4.讨论

杜仲叶味甘，微辣，性质温和。在《神农本草》中，据说它们对治疗腰膝疼痛、补中、补精、强健骨骼和肌肉都有疗效。在现代药理学中，杜仲叶对高血压、骨质疏松、高血糖、肥胖、阿尔茨海默病、衰老、糖尿病和性功能障碍的体内和体外作用备受关注[16- - - - - -21］．此前通过中药研究发现，黄酮类化合物、木脂素、环烯醚萜苷等活性成分可治疗骨质疏松等骨病[22］．然而，具体的调控机制还有待进一步明确。在本研究中，我们鉴定了ELAE的主要成分为黄酮类化合物和环烯醚萜类化合物，如桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、芦丁、马钱子苷、绿原酸和黄芪甲苷。我们证明ELAE处理的MC3T3-E1成骨细胞的存活率较未处理的对照组明显提高，且呈剂量依赖性，这与之前发表的结果一致[23］．ALP和茜素红染色进一步表明ELAE显著增加MC3T3-E1细胞的基质合成和矿化。我们还通过RNA-seq技术和qRT-PCR验证方法探讨了ELAE对MC3T3-E1细胞基因表达的影响，发现ELAE促进MC3T3-E1细胞的增殖，并调控多种功能基因。这些结果提示ELAE可能成为预防和治疗骨病的一种替代方法。

Rpl10a、Adnp、Pex1、Inpp4a、Frat2、Pcdhga1等已鉴定的对细胞增殖具有正向调控作用的基因中，Rpl10a是核糖体60s亚基的组成部分。既往研究表明Rpl10a在前成骨细胞分化过程中协调基因表达，MC3T3-E1的增殖分化伴随着Rpl10a的增加[24］．最近的研究表明，完全缺乏Adnp的小鼠会导致大脑无法形成。Adnp还调节一个与骨形成相关的基因家族，从而影响成骨细胞的发生[25，26］．研究表明，Pex1表达的增加对应于MC3T3-E1成骨细胞中碱性磷酸酶活性的发育性上调，并且Pex1通过调控MMP-9表达调节细胞外基质周转[27，28］．Inpp4a作用于细胞内钙水平，可作为破骨细胞分化的负调控因子[29］．研究表明，Wnt信号通过刺激成骨细胞系细胞的有氧糖酵解、谷氨酰胺分解代谢和脂肪酸氧化，直接重编细胞代谢[30.］．Frat2和Pcdhga1通过影响Wnt信号通路，促进成骨细胞增殖而影响成骨细胞[31，32］．因此，这些发现提示ELAE调节成骨细胞的增殖和分化，从而促进骨形成。

在已鉴定的Npm1、Eif3e、Cbx3、Psmc6、Fgf7、Fxr1、ddx3、Mbnl1、Cdc27等细胞增殖负调控基因中，核磷蛋白基因Npm1参与调控多种肿瘤细胞因突变、失调或染色体易位而死亡，其表达降低可促进成骨细胞增殖和破骨细胞消融[33］．Eif3e是一种血管生成抑制剂，参与RNA转运，在骨质疏松症中高表达，影响成骨细胞凋亡[34］．Cbx3是异染色质蛋白1的核心成分，可抑制成骨细胞分化，而敲除其表达可增加骨相关标志物的表达[33］．Psmc6是一种在骨骼中高表达的蛋白，敲除Psmc6基因增加了OVX骨质疏松小鼠的骨密度(bone mineral density, BMD)和PI3K蛋白磷酸化，增加了cleaved caspase-3/-9蛋白水平[35］．ddx3是DEAD-box家族的atp酶/RNA解旋酶，其表达的增加会影响细胞周期，加重细胞凋亡[36］．Mbn11是RNA代谢的调节因子，其下调可促进成骨细胞增殖，抑制细胞凋亡[37］．有研究发现，Cdc27可通过下调促进细胞增殖和骨生长以及愈合，对成骨细胞有反向调节作用[38］．综上所述，这些发现表明ELAE可以防止成骨细胞凋亡，维持成骨细胞稳态。

我们进一步发现ELAE可轻度提高成骨细胞标志物的表达水平，包括Col5a2、Ubap2l、Dkk3、Foxm1、Col16a1、Col12a1、Usp7、Col4a6、Runx2、Sox4和Bmp4。胶原蛋白分子对成骨细胞的作用已被大量研究证实[39］．在本研究中，我们发现Col5a2, Col16a1, Col12a1, Col4a6有不同程度的增加。Ubap2l是泛素样蛋白家族的重要成员。泛素或泛素样蛋白对细胞蛋白的翻译后修饰可调控许多细胞过程，如细胞增殖、分化、凋亡和信号转导[40]，包括mc3t3细胞[41］．Wnt /β-catenin信号通路在骨发育和内稳态中至关重要[42］．Foxm1过表达可部分激活Wnt/β-catenin信号通路，从而促进间充质干细胞的分化，促进成骨细胞的增殖分化[43］．泛素特异性蛋白酶7 (Usp7)，又称疱疹病毒相关泛素特异性蛋白酶(HAUSP)，是研究最广泛的dub之一。Usp7可以针对不同的蛋白质调控一系列的生物过程。例如，它可以通过催化活性在人类成骨细胞的成骨分化中发挥重要作用[44］．Runx2是骨骼发育的重要转录因子，在多能间充质细胞、成骨细胞系细胞和软骨细胞中表达;它是骨形成的主要标志[45］．SOX蛋白家族在骨形成中也起着重要作用。Sox4在成骨祖细胞中高表达，敲除成骨细胞中的Sox4可以降低祖细胞的增殖，延缓成骨细胞的分化[46］．Bmp4是骨形态发生蛋白家族的一员，是促进成骨细胞增殖分化、骨形成和稳定的重要刺激因子[47］．综上所述，这些发现进一步支持了ELAE在促进成骨细胞增殖、分化、矿化以及骨形成和修复方面的积极调控作用。

5.结论

本研究制备了杜仲叶(ELAE)的水提物，并对其主要成分进行了鉴定，包括秋茄素、京尼平苷酸、芦丁、马钱子苷、绿原酸和黄芪甲苷。通过RNA-seq分析结合增殖实验、基质染色检测验证基因表达水平，以及ELAE调控成骨样细胞系MC3T3-E1的分子机制，探索并破译MC3T3-E1。基于我们的研究发现，ELAE具有促进成骨细胞增殖、巩固骨形成和稳定的潜能，对骨质疏松等骨功能障碍引起的疾病具有一定的预防作用。这些发现增加了目前对ELAE在调控骨发育方面的认识，并为发现骨相关疾病的替代预防和治疗方案提供了理论支持。

数据可用性

在当前研究中使用和/或分析的数据集可以根据合理的要求从通信作者处获得。

信息披露

资助发起人在研究的设计、数据的收集、分析和解释以及手稿的撰写中没有任何作用。

的利益冲突

作者声明，关于这篇论文的发表不存在利益冲突。

作者的贡献

关梦琪和潘岱安对这部作品都有贡献。

致谢

国家重点研究与发展计划(批准号:)资助。2018YFC1706605)、吉林省骨病中医临床研究中心(批准号:2018YFC1706605);20180623048 tc)。资助机构提供资金支持，获奖者进行研究。

补充材料

图S1:植物和叶子的图片杜仲．（补充材料）

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