文摘
糖尿病心肌病(DCM)是许多糖尿病并发症之一。扩张型心肌病导致心功能不全和心肌重塑,是糖尿病患者死亡的主要原因。异常脂质代谢中发挥着重要作用扩张型心肌病的发生和发展。黄芪Shengmai阴(公司)曾被证明能够减轻心脏病的迹象。公司在这里,我们调查是否可以改善心肌病引起的1型糖尿病(T1DM)和改善脂质代谢异常在糖尿病的心。链脲霉素(STZ)是用于建立T1DM老鼠模型,和T1DM老鼠公司随后治疗8周。心脏传导系统的变化、组织病理学、血液心肌损伤指标,脂质含量和表达的蛋白质与脂质代谢进行了评估。我们的研究结果表明,公司可以改善心电图;减少水平的血清LDH和法国巴黎;减轻心脏组织组织病理学变化; and decrease myocardial lipid content in T1DM mice. These results indicate that HSY has a protective effect against T1DM-induced myocardial injury in mice and that this effect may be related to the improvement in myocardial lipid metabolism.
1。介绍
糖尿病(DM)是一种代谢性疾病,其特征是慢性高血糖产生的胰岛素分泌受损和/或胰岛素抵抗[1]。预计到2030年,全球糖尿病患病率上升到3.66亿人2]。糖尿病患者死亡的主要原因是扩张型心肌病,导致左心室功能障碍,心肌肥大,心肌纤维化,微血管损伤(3,4]。糖尿病的病因是复杂的交互影响涉及遗传和环境两方面的因素。然而,尽管几个细胞过程在扩张型心肌病的发病机制中发挥作用,包括能量代谢的不平衡、氧化应激、线粒体功能障碍,内质网压力,受损的胰岛素信号,心肌纤维化和炎症(5- - - - - -8),一个特定的诱发因素尚未确定。
心肌细胞的脂质代谢异常是扮演着一个关键的角色在病理结构和功能变化的发生和发展与扩张型心肌病(9]。特别是,在心肌细胞基质代谢改变DCM;因此,葡萄糖的利用率降低,脂肪酸(FAs)吸收和利用率是增加10,11]。利用FAs过剩可能导致受损的线粒体脂肪酸氧化(FAO),进而增加FAs积累(12,13]。这种FAs的积累增加心肌耗氧量和线粒体功能障碍,导致心肌细胞死亡和心室功能障碍(14]。因此,解决异常心肌代谢底物通过纠正失衡的吸收和氧化FAs可能是一个潜在的糖尿病心肌病的治疗方法。
黄芪Shengmai阴(公司)是一种中草药组成黄芪,种植党参,用麦冬,五味子属对,五味子属sphenanthera。这个现代草药公式演变的基本处方Shengmai粉。黄芪和种植党参属于能源推广中医,这可能促进脂质氧化和降低胰高血糖素消耗。Yin-promoting中药,用麦冬和五味子属对,可以促进心肌代谢,减少耗氧量,增加ATP和胰高血糖素的内容15]。根据先前的研究,公司的主要成分是套,Lobetyolin, Ophiopogonin D, Schisandrin B, Schisantherin (16,17]。公司被报道能显著改善心肌纤维化引起的辐射(18]。第四套,主要的组成部分黄芪已经证明,以减轻心肌脂质代谢障碍,从而提高2型糖尿病引起的心肌损伤(19]。然而,公司是否有保护作用T1DM尚未报道。脂类代谢的有效监管的基础上,每个组件在优处方,我们推测公司可能发挥保护作用,减轻T1DM的脂质代谢障碍。在目前的研究中,小鼠模型的链脲霉素(STZ)诱导T1DM成立调查公司的潜在的保护作用对糖尿病引起的心肌损伤,及其潜在的作用机制决定。
2。材料和方法
2.1。药品和试剂
公司(生产批号。190916年,还没有批准。魏建辉Z36020369)购买记生制药厂(中国南京)。从Sigma-Aldrich STZ购买(圣路易斯,密苏里州,美国)。乳酸脱氢酶(LDH)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL)测定包被购自南京建成生物工程研究所(江苏,中国)。脑利钠肽(BNP)和肌酸激酶isoenzyme-MB(水平)从江苏酶获得免费的实业有限公司,有限公司游离脂肪酸(FFA)酶联免疫试剂盒购自R & D系统(明尼阿波利斯,美国)。ATP是购自Beyotime生物技术研究所(上海,中国)。主要抗体PPARα,FGF21 LKB1 CPT1α,Glut4购买生物合成生物技术有限公司有限公司(中国,北京)。主要抗体AMPKαSirt1, PGC-1αCD36,β肌动蛋白是来自Proteintech集团有限公司(武汉,中国)。主要抗体p-AMPKα是购买的亲和力生物科学(哦,美国)。
2.2。动物和治疗
雄性ICR小鼠体重20 g,从长春Yisi购买实验动物科技有限公司有限公司(吉林,中国)。老鼠经常安置和美联储在标准环境(22±1°C;12 h光/暗周期)实验前一周。DM是诱导使用单一的160毫克/公斤STZ腹腔内注射溶解在0.1 mol / L柠檬酸缓冲(pH值4.5)。同样体积的柠檬酸缓冲控制小鼠腹腔注射。小鼠空腹血糖浓度≥16.7更易/ L和烦渴症状,多尿症,多食症在两周后注射STZ被认为是糖尿病。建立糖尿病模型后,小鼠随机分为以下四组:糖尿病小鼠接收蒸馏水(DCM;n= 10),并接受公司糖尿病鼠2毫升/公斤/ d (DCM + HSY-L;n= 10),治疗糖尿病鼠的公司在4毫升/公斤/ d (DCM + HSY-M;n= 10)和糖尿病小鼠接受公司在8毫升/公斤/ d (DCM + HSY-H;n= 10)。控制老鼠的一半收到4毫升/公斤/ d公司(控制+ HSY-M;n= 10),收到控制老鼠的另一半同样体积的蒸馏水,胃内的日常管理(控制;n= 10)。通过急性毒性实验研究,我们公司证实,不同剂量的使用在这个实验中是安全的(补充1)。8周后,小鼠麻醉用腹腔内注射戊巴比妥(45毫克/公斤),和心脏、血液、胰腺和肾脏收获进行后续分析。所有的实验都是实验动物伦理委员会批准长春中医药大学(批准号20190115)并根据指导方针进行的国家健康研究所的指导护理和使用实验动物。
2.3。血液采样和生化分析
每周收集血液样本小鼠尾静脉的禁食过夜,和老鼠的血糖浓度测量使用数字血糖仪(Sinocare,长沙,中国)。在实验的最后,腹主动脉血管的血液收集小鼠禁食过夜然后离心机在1500 x g (4°C),持续15分钟。血清收集和储存在−20°C到分析。水平的血清LDH,法国巴黎,TG, TC,高密度脂蛋白,低密度脂蛋白,和FFA显示测量设备指令。
2.4。心电描记法测量
老鼠麻醉用腹腔内注射戊巴比妥(45毫克/公斤),然后在仰卧位固定在桌子上。皮下针电极连接到肢体的小鼠铅在位置2和心电图记录使用Biopac MP150数据采集系统(美国加州Biopac系统,Inc .)。
2.5。测定心脏重量指数
在实验的最后,每只小鼠的体重和心脏重量测量和记录。心收获,冲洗在磷酸盐,排水滤纸,然后重。心脏肥大的程度是评估通过计算心脏重量指数(注热水= HW /体重(BW)]。
2.6。组织病理学检查
与4%多聚甲醛固定后24 h,老鼠的心是嵌入在石蜡和切割5点μm。部分然后脱蜡、水化和沾hematoxylin-eosin(他)。被观察到的部分使用光学显微镜和图像。心脏纤维化被马森染色评估。部分与马森孵化的三色的染色后常规方法,和心肌纤维化的程度定量分析使用Image-Pro + 6.0图像分析软件(媒体控制论,罗克维尔市,医学博士,美国)。
心脏脂质积累被油红O染色评估。Cryosections (10μ米)从OCT-embedded心脏组织用70%乙醇洗净了5 s。幻灯片被浸在油红O 8分钟的工作解决方案。与70%乙醇洗涤后去除多余染料,幻灯片和苏木精复染色为2分钟。心肌组织脂质积累的程度定量分析使用Image-Pro + 6.0软件。
2.7。透射电子显微镜(TEM)
心肌组织在4%戊二醛固定,使用一系列梯度乙醇脱水,嵌入Eponate 12环氧树脂。切片后,样本double-stained与醋酸双氧铀及柠檬酸铅。最后,TEM观察到心肌细胞超微结构的变化。
2.8。免疫组织化学
5μm心肌组织的石蜡切片脱蜡、水化、孵化与内源性过氧化物酶阻断剂10分钟。抗原被微波加热检索。阻塞与BSA 30分钟后,部分与PPAR孵化α第三,上校,上校(1:10 0)抗体在一夜之间在4°C。山羊anti-rabbit免疫球蛋白就一滴一滴地补充了一句,于是30分钟的部分被孵化。与南非广播公司孵化后30分钟,用显色的解决方案是添加到染色的程度进行评估。的部分是2分钟然后用苏木精复染色。组织化学评分(h)随后计算使用Image-Pro + 6.0软件,用于蛋白质的水平的一项指标。h =强阳性的比率3 + moderate-positive的比例2 +弱阳性的比例3所示。
2.9。心肌组织ATP含量的测定
心肌组织ATP含量测量根据制造商的指示。
2.10。西方墨点法
左心室心肌组织细胞溶解在冰冷的里帕缓冲区(北京叮郭常盛生物科技有限公司)和蛋白质提取。蛋白质的浓度是量化使用BCA蛋白质化验设备。等量的蛋白质被分开使用10% sds - page凝胶。解析后的蛋白质被从凝胶转移到一个聚乙二烯二氟化物膜(美国微孔有限公司)。膜被5%的脱脂牛奶在37°C 2 h,然后孵化主要抗体在一夜之间在4°C。主要的抗体使用如下:anti-PPARα(1:50 0),anti-FGF21 (1:50 0), anti-LKB1 (1:50 0), anti-p-AMPKα(Thr172) (1:50 0), anti-GLUT4 (1:50 0), anti-CPT1α(1:50 0),anti-AMPKα(1:1000)anti-Sirt1 (1:1000) anti-CD36 (1:1000) anti-PGC1α(1:1000)和反β肌动蛋白(1:1000)。膜被洗TBST和孵化与辣根peroxidase-conjugated二级抗体(1:1)37°C 1 h。最后,抗体绑定可视化使用化学发光成像系统和带密度定量分析使用Image-J软件(贝塞斯达国立卫生研究院,医学博士,美国)。
2.11。统计分析
所有的实验结果进行了分析使用GraphPad棱镜8 (GraphPad软件、圣地亚哥、钙、美国)。结果提出了均值±标准差(SD)的连续变量。学生的双尾t以及用于比较两组确定统计学意义,和单向方差分析被用于多个组之间的比较。结果与< 0.05被认为是具有统计学意义的价值。
3所示。结果
3.1。糖尿病小鼠的病理特征
STZ政府两周后,观察空腹血糖水平大幅上升相比,在控制和控制+ HSY-M组(图1(一))。此外,体重下降(图1 (b))和症状烦渴、多尿症,多食症被观察到。这些结果说明STZ诱导T1DM模型成功建立。
(一)
(b)
3.2。公司对体重和空腹血糖的影响
糖尿病的明显特征是一个相对的减少身体体重和血糖的增加。如图2对照组小鼠的体重稳步增加,血糖水平正常。之间没有显著差异的控制和控制+ HSY-M组。相比之下,体重增加相对缓慢,DCM组血糖水平显著提高。优治疗后,身体体重增加与DCM组相比,但没有统计学意义。然而,血糖水平依旧很高。因此,公司待遇可能没有对血糖水平的影响。
(一)
(b)
3.3。公司的影响治疗心肌损伤和心肌肥厚
公司的影响心电图参数如图3(一个)。之间没有显著差异的控制和控制+ HSY-M组。心率下降和QT间隔和QRS波群长期DCM组与对照组相比(图3 (b))。优治疗8周后,心率明显增加和QT间隔和QRS波群缩短与DCM组相比。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
心肌染色是用来评估公司对心肌结构的影响。在控制和控制+ HSY-M组(图3 (c),心肌细胞的形态正常,心肌纤维有序地排列,细胞边界清晰可见。DCM组心肌纤维无序,心肌细胞核溶解或缺席,以及细胞之间的边界是模糊的。这些变化是伴随着炎症细胞浸润。公司与DCM组相比,治疗8周这些病理变化明显减轻。
心脏血液标记的支柱是心脏损伤诊断。之间没有显著差异的控制和控制+ HSY-M组。显著增加心肌损伤标记物的水平在DCM组与对照组(数字3 (d)和3 (e))。血清水平和LDH水平明显低于DCM组治疗后与公司。
心脏肥大的程度进行了血清BNP水平和心脏重量指数。如数据所示3 (f)和3 (g)没有显著差异,BNP水平和HW / BW之间的控制和控制+ HSY-M组,而BNP水平和HW / BW DCM组与对照组相比显著增加。公司与DCM组相比,治疗显著降低和HW / BW BNP水平。
3.4。公司待遇对脂质代谢障碍的影响
功能障碍在脂质代谢中发挥着重要作用在扩张型心肌病的发生和发展。评估对脂质代谢障碍、心脏脂质积累是衡量油红O染色。之间没有显著差异的控制和控制+ HSY-M组。心肌脂质含量显著增加在DCM组与对照组(数字4(一)和4 (b))。然而,优治疗8周显著降低心肌中脂质含量与DCM组。此外,血清脂质代谢剖面是评估。TC、TG、LDL(数字4 (c)- - - - - -4 (e))和FFA(图4 (g))显著增加DCM组与对照组相比,而高密度脂蛋白的水平(图4 (f))显著降低。优治疗显著降低TC、TG、LDL、FFA和增加高密度脂蛋白的水平相比,DCM组。之间没有显著差异的控制和控制+ HSY-M组。这些结果表明,公司可以减轻扩张型心肌病引起的脂质代谢障碍。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
3.5。公司的影响治疗心肌线粒体的结构性损伤和功能障碍
FAs的过度积累会导致线粒体的结构性损伤和功能障碍。心肌细胞线粒体超微结构的形态学和脂滴堆积在透射电镜观察到。如图5(一个)之间没有显著差异,控制和控制+ HSY-M组。DCM组表现出线粒体肌丝排列无序,模糊的肌节,线粒体膜结构不完整,广泛的嵴损失,和过多的脂滴分布与对照组相比。DCM组心肌细胞ATP含量也与对照组相比显著降低(图5 (b))。这些结果表明,过度积累FAs心肌细胞结构损伤和功能障碍有关的线粒体。这些特征被公司大幅缓解治疗。这些结果表明,公司可以防止心肌细胞线粒体结构扩张型心肌病引起的损伤和功能障碍。
(一)
(b)
3.6。优治疗心肌纤维化的影响
心肌纤维化被马森染色(图评估6(一))。纤维化的程度没有显著差异之间的控制和控制+ HSY-M组,而DCM组纤维化程度与对照组相比显著增加,表明心肌纤维化可能DCM的一个重要病理过程。优治疗显著降低心肌纤维化的程度与DCM组进行比较。进一步探索公司在心肌纤维化的影响,两个纤维化因素的表达(我和坳坳III)用免疫组织化学分析测量。表达我和上校卡扎菲三世没有明显不同的控制和控制+ HSY-M组之间。与对照组相比,卡扎菲的表达我和坳三世DCM组显著增加(数据6 (b),6 (c))。然而,优治疗显著降低坳的表达我和坳三世与DCM组相比。这些结果表明,公司可以逆转心肌纤维化引起扩张型心肌病。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.7。公司的影响治疗PPAR的表情α
PPAR的表达水平α用免疫组织化学分析测量。如图7没有显著差异,PPAR的表达水平α之间的控制和控制+ HSY-M组。PPARα表达在DCM组与对照组相比显著降低。公司待遇增加PPARα表达式与DCM组相比。这个结果表明,公司可以增加PPARα在DCM表达式,这个结果也证实了西方墨点法。
(一)
(b)
3.8。影响公司的治疗影响脂质代谢的蛋白质的表达
探索公司的可能机制调节脂质代谢,我们评估的关键蛋白质的表达参与脂质吸收,合成和氧化。如图8没有统计学意义,表达的蛋白质之间的控制和控制+ HSY-M组。PPAR的表达α,FGF21 p-AMPKα,Sirt1 LKB1 PGC-1α,CPT1α,Glut4 DCM组显著减少,而CD36的表达与对照组相比显著增加。这些结果表明,扩张型心肌病导致葡萄糖摄取减少和氧化,增加了脂质吸收,粮农组织受损。公司处理显著增加PPAR的表达α,FGF21 p-AMPKα,Sirt1 LKB1 PGC-1α,CPT1α,Glut4和减少CD36的表达与DCM组。这些结果表明,公司可以提高蛋白的异常表达与脂质代谢途径,从而减少心肌脂质积累引起扩张型心肌病。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
4所示。讨论
糖尿病心肌病是糖尿病患者发病和死亡的主要原因(20.,21]。然而,有效的药物治疗这种情况是有限的。在这项研究中,我们使用STZ成功建立T1DM的小鼠模型。我们的结果表明,公司可以改善DCM改善脂质代谢障碍的小鼠模型。
糖尿病患者糖尿病心肌病的发生率高,它的特点是复杂的变化在心脏的机械和电气性能22]。在这项研究中,有一个降低心率和延长T1DM QT间隔和QRS波群的老鼠,说明心脏传导系统的功能障碍。这些发现与之前的研究结果是一致的(23]。然而,公司大大减毒心电图异常。
在STZ-induced扩张型心肌病动物模型,升高血糖和血脂水平与血液中心肌损伤指数(增加有关24]。水平和LDH作为心脏生物标记物检测心脏损伤。在这项研究中,水平的水平和LDH DCM组都显著增加。此外,他染色显示,心肌纤维无序,心肌细胞核溶解或丢失,细胞之间的界限是模糊的DCM组。这些变化也伴随着炎症细胞浸润。组织病理学和心脏标记酶的结果证实,公司减轻心脏损伤由扩张型心肌病引起的。
心肌肥大和纤维化是最具代表性的改变DCM (25,26]。在扩张型心肌病,合成和沉积之间的动态平衡心肌细胞外基质干扰,和过度沉积的胶原蛋白和胶原蛋白比例的不平衡导致心脏重构(27- - - - - -29日]。法国巴黎是最相关的分子标记之一心脏肥大的30.],DCM组BNP水平的增加。观察到的HW / BW比率增加DCM组可能与体重损失和增加心肌细胞外基质。此外,马森染色显示明显的心肌间质胶原沉积和相对高度纤维化DCM组。我和上校上校三世,ECM的两个主要组件,扮演了重要的角色在维持心脏的结构和功能(31日]。糖尿病引起的心肌纤维化与上校的积累我和坳三世(32]。我们的免疫组织化学结果证实胶原蛋白的表达I / 3 DCM组显著增加。这项研究的结果表明,公司改善扩张型心肌病引起的心肌肥大和纤维化。
根据先前的研究,心脏中的胰岛素信号T1DM病人减少,所以心脏更依赖粮农组织获得能量;因此,心肌代谢转换从粮农组织葡萄糖氧化33- - - - - -35]。然而,脂质吸收最终超过了脂质间隙,导致显著的脂质积累的糖尿病的心。油红O染色结果表明,心肌脂质积累显著增加T1DM老鼠。血清TC、TG、LDL和FFA也增加,高密度脂蛋白的水平降低了。优治疗显著降低心肌脂质积累的水平。此外,TEM证实,公司可以减少心肌线粒体脂质积累和相关的伤害。进一步评估线粒体的状态,我们测量了心肌ATP含量,发现公司可以反向T1DM引起的ATP含量下降。因此,公司可以保护心肌线粒体通过减少心肌脂质积累。上述结果证实我们的假设,公司可以减轻T1DM引起的异常脂质代谢的影响。
接下来,我们专注于在T1DM公司的保护作用机制。线粒体粮农组织正在参与FAs分解代谢的主要途径。几项研究已经证实,进一步增加粮农组织可以减少脂质积累和脂质毒性(36- - - - - -38]。PPARα醣脂类体内平衡的主要监管机构,可以通过改善脂质吸收调节脂质代谢和氧化39,40]。减少PPARα表达和连续暴露在高浓度的FFA增加脂质积累在DCM (41]。PPARα激活能上调线粒体粮农组织和促进FAs分解代谢(42]。几个额外的蛋白质的表达水平,包括FGF21 p-AMPKα,Sirt1 LKB1 PGC-1α,CPT1α也,Glut4影响脂质代谢和能源体内平衡。
FGF21是PPAR的下游中介α和能源体内平衡起着重要的作用42]。FGF21缺陷增加脂质吸收和减少粮农组织在糖尿病小鼠,导致脂质积累的心(43,44]。AMPK起着重要的作用在调节细胞的能量平衡。激活AMPK增加葡萄糖摄取和粮农组织代谢疾病如糖尿病(45,46]。LKB1 AMPK活化的主要监管机构,它可以直接使磷酸化AMPK刺- 172并激活其酶活性(47]。此外,特定的心脏LKB1删除会导致心肌纤维化和心脏功能障碍(48]。
Sirt1被认为是一个潜在的目标治疗扩张型心肌病,及其表达的减少而导致受损的胰岛素信号和异常线粒体动力学(49]。Sirt1直接结合PPARα它可以促进PGC-1之间的交互α和PPARα和调节心脏代谢50]。PGC-1α可以移植各种基因的表达在粮农组织和三羧酸循环和coactivate PPAR吗α提高粮农组织,积极受AMPK [51,52]。因此,激活PGC-1α可以防止糖尿病的发生(53]。CPT1的表达水平α一种关键酶,调节FAs进入线粒体的氧化,也减少了在糖尿病的心脏54]。的下降可能会导致线粒体粮农组织受损。
我们的研究结果提供的证据表明,粮农组织受损的心脏T1DM老鼠,导致脂质积累。此外,我们表明,优治疗可以显著降低心肌脂质积累。公司行动的潜在机制可以改善心肌粮农组织、减少心肌脂质积累,并通过AMPK / PPAR增加葡萄糖的利用率α/ FGF21信号通路,最终在T1DM引起的心肌损伤发挥保护作用。
CD36介导的运输和利用FAs的心(55]。心肌细胞在糖尿病的发展,吸收更多的FFA通过FAs提供能量转移酶CD36;然而,过度的FAs线粒体粮农组织吸收损失,导致线粒体功能障碍和脂质积累(56]。公司根据我们的研究,增加脂质间隙和减少CD36的表达T1DM小鼠的心脏。葡萄糖吸收的葡萄糖转运体介导,GLUT4。胰岛素抵抗和积累过度FAs可能产生负面影响的表达式和易位GLUT4在心肌细胞,从而进一步降低葡萄糖的吸收,在心肌细胞氧化。GLUT4正受AMPK [57,58]。根据我们的研究,公司可以增加GLUT4的表达心肌T1DM的老鼠。因此,公司待遇也可以减少心肌脂质吸收和增加心肌葡萄糖摄取和利用。
综上所述,我们的结果表明,该公司有一个有益的影响提高T1DM引起的心肌损伤,其机制可能与改善心肌脂质代谢密切相关。在未来的研究中,我们的目标是进一步研究公司的保护作用和作用机理在T1DM通过体外实验。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这个工作是由“托运人吴”教育部科学技术研究计划项目的吉林省[2017(34)],研究基金会对中国高等教育的博士项目(20132227120004),和健康卫生和计划生育青年科研项目委员会吉林省(2018 (087))。
补充材料
补充1。急性毒性测试黄芪Shengmai阴。老鼠intragastrically服用黄芪Shengmai阴3倍的剂量40毫升/公斤,和累积剂量是120毫升/公斤,相当于每天280次临床剂量(70年30毫升/公斤/天)。通过观察14天,没有不良反应和死亡。(补充材料)