传统葛缕子配方对白癜风实验模型的影响及黑色素形成机制

摘要

背景。香菜片(CWT)是一种传统的药物配方，在中国新疆广泛用于治疗白癜风，这是一种常见的自身免疫性疾病，目前尚无令人满意的治愈方法。临床干预包括用补骨脂素进行药物治疗，通常与UVA辐射联合使用，但毒副作用限制了这种应用。关于CWT的活性和机制的研究很少。客观的。研究CWT在白癜风B16细胞系及动物模型中的体内外作用，进一步探讨其调节黑色素生成的机制。方法。研究了CWT对蘑菇B16细胞黑色素合成及酪氨酸酶活性的影响。Western blotting检测小鼠B16黑色素瘤细胞黑色素形成的信号通路。采用两种不同的动物模型，对苯二酚诱导的小鼠模型和过氧化氢诱导的豚鼠模型。测定血液及皮肤组织相关生化指标，并对治疗部位进行目视检查、组织病理学及免疫组织化学分析。结果。α，β-EP和cAMP在血液和/或皮肤组织中调节黑色素生成。经CTW处理后，动物皮肤颜色、含黑色素毛囊以及皮肤中TYR、TRP-1、TRP-2的表达均受到显著影响。结论。CWT减轻了两种白癜风模型的许多有害影响。B16细胞中的酪氨酸酶活性和黑色素含量增加，至少部分是通过激活PKA p38 MAPK信号通路。我们的研究结果表明，CWT对白癜风的参数产生有益的影响，值得进一步研究，用于目前尚无有效治愈的这种令人痛苦的自身免疫性疾病。

1.介绍

白癜风是一种色素沉着的自身免疫性皮肤病，其特征是皮肤和粘膜上出现界限分明的白色斑块[1]。目前，这种令人痛苦的疾病还没有令人满意的治疗方法。

白癜风的特点是破坏黑色素细胞和抑制黑色素合成途径[2]。白癜风患者皮肤的黑色素细胞与正常黑色素细胞的比较[3.，4]，更容易因外源性氧化应激而死亡，其活性氧水平升高[5，6]和更大的内质网应激。将皮肤暴露于酚类物质，如4-叔丁基酚和对苯二酚单苯醚(即单苯酮)，可重复这些影响，使白癜风患者的临床脱色恶化[7]。

白癜风的治疗包括药物和手术干预、光疗和美容措施。大多数都是昂贵的，有些是痛苦的，没有一个是完全有效的。使用长波紫外线辐射(P-UVA)的补骨脂素无疑是有效的，但与皮肤癌的高风险有关[8]。补骨脂素有明显的副作用，包括肝毒性、恶心呕吐和光敏性[9]，其影响是累积的[10]。

草药通常用于治疗白癜风，并作为其他治疗的辅助手段，如果能够证明其安全性和有效性，则有可能得到更广泛的应用。许多白癜风的草药配方包括含补骨脂素的草药，结合其他植物提取物，包括CWT。其他草药的存在是为了提供一种多目标的治疗方法，提高疗效，减轻其他成分的副作用，这是传统医学理论的一部分。因此，我们研究了CWT在几种药理学模型中的作用，并将其与白癜风胶囊(BC或白癜风胶囊)进行了比较，白癜风胶囊是一种在中国广泛使用的治疗白癜风的专利中药配方。BC的主要活性成分是补骨脂素，但这个配方也含有其他草药。

“葛缕子”或“葛缕子”(葛缕子片，CWT)是中国西部用于治疗白癜风的传统草药配方[11]。CWT含有香菜，Carum carviL作为主要成分，与补骨脂l刺蒺藜lTrachyspermum ammi(l)斯普拉格,Operculina turpethumL.比例为2:1:1:1:1。CWT的组成依据传统医学原理，其成分均为知名药用植物，已进行了一定程度的化学和药理学研究。其中一些研究为将其纳入白癜风的公式提供了有限的证据。

香菜,Carum carvi，种子(果)是CWT的主要成分。香菜在世界各地都是一种食物，在许多传统医学体系中都起着重要作用。它含有一种主要由香芹酮组成的精油，含量高达60%，具有驱风、消炎、抗氧化和抗菌作用[12]。葛缕子在皮肤病中的使用并没有充分的证据，但Kang等人最近的一项研究。[13表明香芹酮有可能成为治疗黑色素瘤和相关疾病的有效方法。香菜的抗氧化作用可能对黑素细胞有保护作用，并且其通便作用可以抵消其他泻剂的紧抓作用。

补骨脂种子在中国和印度草药中用于促进皮肤色素沉着。它含有补骨脂素和异补骨脂素，这是众所周知的治疗白癜风的方法。这种种子还含有查尔酮、异黄酮，如菊苣素和大豆苷元，以及一种单萜酚及其二聚体bakuchiol [14]。这是CWT中唯一含有补骨脂素的成分，作为已知的活性成分，它们被测量了。

Trachyspermum ammi在食品和阿育吠陀和其他医学系统中用作抗痉挛和驱风剂。它含有一种精油，其主要成分是百里酚(约60%)和对伞花烃(约15%)，γ-萜烯等。除了作为局部防腐剂外，没有充分的文献证明它用于皮肤病。然而，一项测量其对大鼠皮肤厚度影响的研究证实了其在皮肤组织中的免疫调节和免疫刺激活性[15]。

刺蒺藜水果(TTF)中含有皂苷、地皮素，其基础是原薯蓣皂苷、植物甾醇等β-谷甾醇，豆甾醇和类黄酮提取物传统上用于治疗炎症性和过敏性皮肤病，包括特应性皮炎(AD)。AD的病因复杂，涉及免疫和炎症途径的激活。Kang等。[16发现蒺藜水果提取物通过阻断炎症细胞如T细胞和嗜酸性粒细胞的浸润来抑制AD患者的皮肤炎症。这些特性可能与将TTF纳入CWT用于白癜风有关。

Operculina turpethum在印度阿育吠陀(Ayurveda)的医学体系中，黑石头根是一种重要的草药，它有很长的药用历史，用于治疗各种疾病，包括皮肤病，特别是白癜风。17]。它含有树脂苷，包括α- - -β-松脂素，松脂酸，香豆素，如东莨菪碱，植物固醇，包括β-谷甾醇、芦皮醇、东莨菪素、白介木苷和水杨酸，以及一系列被称为桂皮苷的达玛烷皂苷。提取物已被证明具有抗炎和抗菌特性，皂苷具有保护肝脏的作用[17]。水杨酸是一种广泛用于皮肤疾病的角化剂。大剂量的树脂有很强的泻药作用。

这个公式的科学原理还没有得到证实，尽管存在补这是意料之中的。然而,补是配方的一小部分，没有其他成分草药含有补骨脂素。因此，CWT的作用可能是由多种机制引起的，包括由补骨脂素诱导的机制，也可能通过抗氧化和免疫机制。

尽管其使用历史悠久，但CWT作用背后的药理学机制尚未阐明。我们分别在对苯二酚和过氧化氢诱导的白癜风小鼠和豚鼠模型中研究了这些问题，并研究了其调节黑素生成和参与PKA信号传导的机制。在补充资料中可以看到显示设计和研究核心结果的示意图。

2.材料与方法

2.1.样品制备

2.1.1.葛缕子片的制备

牛蹄草，补骨草，蒺藜,Trachyspermum ammi种子和Operculina turpethum根鉴定，凭证标本保存在新疆理化技术研究所，乌鲁木齐。CWT提取物的制备是在前人方法的基础上进行的(专利号:CN 107569532 A)。葛缕子片的制备方法见补充资料。

2.1.2.CWT中补骨脂素和异补骨脂素的定量测定

CWT溶解于甲醇中，超声提取后，使用高效液相色谱(高效液相色谱，SHIMADZU，日本)和甲醇-水流动相(55:45， ）1 mL min⁻¹30°C, 245 nm紫外检测。对三个样品进行了分析，发现平均含有2.21毫克/克补骨脂素和1.54毫克/克异补骨脂素。

2.1.3.血液和皮肤样品的制备

血样采集后，离心分离血清，- 70℃保存。

皮肤组织样品匀浆，在振荡器中4℃下混合60 min, 4℃下离心15 min，收集上清。

2.2.动物和治疗

2.2.1.动物

雄性和雌性各50∶50，饲养于新疆医科大学，温度18-25°C，湿度40-60%，食物和水自由供应。简单地说，将它们随机分为6组:正常对照组(NC，未治疗组)、模型组(疾病对照组)、阳性对照组(BC组)和低、中、高剂量CWT (CWT- l、CWT- m和CWT- h)组(表2)1-2)。从背部皮肤剃毛，用蒸馏水涂抹50天(正常对照组)，并口服纯净水30天;所有其他组用对苯二酚或过氧化氢(5%)涂抹50天，并从第21天开始口服纯净水和BC或CWT 30天。末次给药后12 h处死动物，取血和皮肤组织。

2.2.2.剂量的选择

CWT粗提物的临床剂量为0.9 g/人/天，相当于小鼠约200 mg/kg，豚鼠约80 mg/kg [18]。在我们的实验中使用的低剂量是它的一半，高剂量是它的两倍，接近于补骨脂素在CWT-M (200 mg/kg)中0.44 mg/kg和在CWT-H (400 mg/kg)中0.88 mg/kg的剂量。

BC的临床剂量为3.6 g/人/天，相当于小鼠720 mg/kg和豚鼠270 mg/kg，其中补骨脂素的剂量约为1.33和0.5 mg/kg。

2.2.3.含黑色素毛囊的测量

用常规组织学方法观察含黑色素毛囊[14]。切开一部分皮肤，用10%中性缓冲福尔马林固定，然后石蜡包埋。在约5mm的切片上进行苏木精和伊红染色，光镜下观察50个毛囊(×100) (Olympus Optical Co, Ltd, Tokyo, Japan)，并对含黑色素的毛囊进行计数。

2.2.4.生化测量

使用microplate reader (Multiskan Go 1510, USA)分别在520 nm、242 nm和532 nm处测定AChE的吸光度。

2.2.5.IL-6、IFN-的测定γ， TYR, cAMP，和βep

细胞因子的浓度，即干扰素- γ (IFN-)γ)，白细胞介素- (IL-) 6，酪氨酸酶(TYR)，环磷酸腺苷(cAMP)，和β脑内啡(β采用酶联免疫吸附法(ELISA，南京建成生物工程有限公司，中国)定量测定血清和组织样品中-EP的含量。

2.2.6.组织病理学检查

如上所述制备皮肤切片，用苏木精和伊红(H&E)染色，或在光镜下进行左旋多巴染色。

2.2.7.免疫组织化学分析

TYR、TRP-1(酪氨酸酶相关蛋白1)、TRP-2(酪氨酸酶相关蛋白2)在皮肤剃除部位的表达[19，20.用酪氨酸酶、TRP-1和TRP-2单克隆抗体染色检测]，用Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc.， USA)检测蛋白表达。

2.3.细胞培养

小鼠B16黑色素瘤细胞系购于中国科学院(中国上海)。细胞在HG-DMEM (Gibco)中培养，并添加10%胎牛血清(BI, Biological Industries)， 100µg/mL链霉素和100 U/mL青霉素(Gibco)，在5% CO的加湿培养箱中₂37℃，每2天传代一次，保持对数生长。

2.4.细胞活力测定

采用MTT法测定细胞活力。B16细胞以5 × 10的密度接种于96孔培养皿中^3.每孔细胞数。24 h后，加入不同浓度的CWT提取物，孵育48 h。10µ每孔加入L MTT (5mg /ml PBS)溶液，在37℃下再孵育4小时。去除培养基后，150µ在每个孔中加入L DMSO(二甲基亚砜)，轻轻摇晃10分钟。在570 nm处用Spectra Max M5 (Molecular Devices, USA)测定吸光度。未处理的细胞吸光度为100%细胞存活率。每组5次，每组实验重复3次。

2.5.黑色素测量

将B16细胞以1.8 × 10的密度接种于6孔板⁵细胞/。孵育24小时后，细胞用CWT或8-MOP(8-甲氧基补骨脂素)50处理48小时µM(阳性对照)，和2µL DMSO溶液。用PBS (PH 7.4)洗涤细胞2次，在100分钟内裂解µL RIPA缓冲液在4°C下离心40 min，在4°C下离心12000 g，离心20 min。用BCA法测定上清液的蛋白质含量，将微球与190混合µL的1m NaOH(含10% DMSO)在60℃下反应2小时。用多板读取器(Spectra Max M5/M5e)在405 nm处检测黑色素含量，并校正蛋白质浓度。

2.6.酪氨酸酶活性

将B16细胞以2.5 × 10的密度接种于6孔板⁵细胞/。24 h后，用8- mop50用CWT处理24 hµM为阳性对照，车辆对照组2人µL DMSO溶液。用含有1% Triton X-100和1%脱氧胆酸钠的PBS在- 20℃下裂解细胞30分钟，12,000 × g离心15分钟。90年µL的细胞裂解液和10µ每孔加入10 mM L- dopa，在37°C黑暗条件下孵育20 ~ 60分钟，在490 nm处检测多巴色。计算每个样品的酪氨酸酶活性，并根据蛋白质浓度进行校正。

2.7.Western Blot分析

黑色素含量测定的蛋白样品用于Western blot分析。裂解物在SDS-PAGE蛋白加载缓冲液5x(武汉博斯特生物技术有限公司)中变性，在10% SDS-PAGE上在80 V下分离，在400 A下转移到聚氟乙烯膜上2小时。将5%脱脂牛奶溶解在含有1% Tween-20 (TBST)的TBS中，在室温下阻断膜1小时，将膜与一抗以1:10 00的稀释度在4℃下孵育过夜。用TBST洗涤后，用辣根过氧化物酶结合的二抗(1:20 00)孵育1小时，再用TBST洗涤。采用增强型化学发光Western blotting检测试剂(GE Healthcare, Chicago, IL, USA)对蛋白进行可视化检测。使用Quantity One version 3 (BioRad Laboratories, Inc.)进行密度分析。

B16细胞用H89 (10µM)在加入CWT (100µg/mL)，然后孵育48 h用于测量黑色素含量或孵育24 h用于测量TYR活性。B16细胞分别用0.1%二甲亚砜和8-MOP作为阳性对照或CWT处理5、50和100µM作用12 h，用cAMP- elisa试剂盒测定cAMP含量。分别用5、50和100处理B16细胞µM CWT 48 h, Western blot检测总CREB和磷酸化CREB水平。B16细胞用H89 (10µM)在加入CWT提取物(100µg/mL)，孵育48 h。Western blot分析了磷酸化的CREB和MITF表达水平以及PKA诱导的CREB水平，这可能激活MITF转录水平。

2.8.细胞内cAMP水平测定

B16黑色素瘤细胞在0、5、50或100时用CWT粗提取物处理µM在37°C下放置12小时。使用cAMP ELISA试剂盒(Cell Biolabs, Inc.， San Diego, CA, USA)测定细胞内cAMP水平。

2.9.统计分析

取小鼠72只，豚鼠96只，随机分为6组进行统计学检验。对小鼠和豚鼠的多项参数进行了统计研究。所有数据均以mean±SEM表示。采用单因素方差分析进行统计分析，并对多项比较检验进行Tukey事后检验。同时，我们使用描述性统计来获得平均值和标准差(SD)。大多数显著差异被接受时 ，在某些情况下，当 或 。体外实验相关指标采用重复计量统计检验。结果部分使用表格或图表描述了所有结果。

3.结果

3.1.头发再生的颜色

各治疗组小鼠毛发颜色均较未治疗的疾病模型组变深。CWT-M (200 mg/kg)组和CWT-H (400 mg/kg)组以及BC阳性对照组观察到的变化更大1(一))。

3.2.小鼠皮肤组织学分析

数字1 (b)显示了CWT对氢醌诱导白癜风小鼠剃光皮肤区域含黑色素毛囊、基底黑色素细胞和含黑色素表皮细胞数量的影响。与正常对照组相比，疾病模型组黑色素含量明显降低，大部分毛囊几乎不含黑色素。在所有剂量的CWT和BC阳性对照组中，治疗区域含有黑色素的毛囊数量均增加( )。基底黑色素细胞和含黑色素表皮细胞显著增加( ）给药200和400 mg/kg CWT小鼠1例(图1 (b)和1 (c)、表3.)。

3.3.

疾病模型组大鼠血清中TYR浓度显著低于正常对照组( ）(图1 (d))， MDA含量升高。BC组和CWT-H组大鼠TYR水平显著高于模型组( )，但各组的丙二醛水平无明显变化( ）(图1 (e))。

2。与正常对照组相比，模型组TYR含量显著降低( ）;而在CWT组中，TYR含量呈剂量相关性升高，特别是在CWT- m和CWT- h组( ）(图2(一个))，这高于bc处理的阳性对照。 )。 )，但AChE的减少仅在CWT-H组出现( ）(数据2 (b)- - - - - -2 (d)。

3.4.

与正常对照组比较，疾病模型组皮肤组织中TYR水平显著降低( ）(数据1 (f)和2 (g))，而BC阳性对照组和CWT组的TYR含量显著升高( ）而且主要是剂量依赖性的。模型组大鼠皮肤组织MDA含量较高( ）与正常对照组相比，经BC和CWT ( ）(数据1 (g)和2 (h))。 ）在给药组略有下降(图2)1 (h)和2(我))。两种动物皮肤组织中乙酰胆碱酯酶水平的变化有很大不同。在疾病模型小鼠( ）(数据1(我)和2 (j))，而豚鼠的乙酰胆碱酯酶水平则高得多( ）(图2 (j))。CWT组和BC组乙酰胆碱酯酶水平降低，但差异不显著( )。

3.5.CWT对小鼠皮肤TYR、TRP-1、TRP-2蛋白表达的影响

模型组大鼠皮肤组织中TYR平均密度、TRP-1、TRP-2水平均显著降低( ）与正常对照相比。在BC和CWT组中，这些都大大增加了( )，CWT的作用呈剂量依赖性(图2)3(一个)- - - - - -3 (d))。

3.6.CWT对豚鼠皮肤和毛发颜色的影响

疾病模型组脱毛区皮肤和发色较正常对照组变浅。在CWT和BC处理组中，头发颜色逐渐恢复到接近正常水平(图2)4(一))。

3.7.CWT对豚鼠皮肤组织形态的影响

镜下观察，疾病模型组表皮增厚，角化过度明显，可见轻度炎症灶及嗜酸性粒细胞增多。皮肤棘层和基底层的色素含量减少或完全丧失。与未给药组比较，其他各组表皮可见轻微角化过度，模型组真皮零星分布淋巴细胞和嗜酸性粒细胞。(图4 (b))。

3.8.CWT对豚鼠皮肤表皮黑色素含量的影响

实验结果表明，空白组皮肤表皮的黑色素颗粒分布更均匀，棘细胞层和基底细胞层均含有黑色素颗粒，颜色较深。而模型组仅在基底层发现少量黑色素颗粒，且颜色较浅。在BC组，基底细胞和棘细胞层可见更多的黑色素颗粒。CWT各剂量组基底细胞层和棘细胞层均可见黑色素颗粒增多，颜色变深。CWT-H的治疗效果明显优于BC组(图2)4(一)- - - - - -4 (e))。

3.9.CWT对豚鼠左旋多巴阳性细胞分布的影响

L-DOPA氧化法染色结果显示，未处理组豚鼠皮肤表皮基底区L-DOPA阳性细胞分布均匀，颜色较深(图2)4 (d))。疾病模型组基底左旋多巴阳性细胞明显减少，颜色变浅。BC阳性对照显示基底层L-DOPA阳性细胞分布增加，且CWT-M和CWT-H剂量组作用更大且呈剂量依赖性。

3.10.CWT对IL-6、INF-的影响γ在血与β-EP，豚鼠皮肤中的cAMP

与未治疗组比较，IL-6、INF-含量γ在血液和β-疾病模型组大鼠皮肤组织ep含量显著升高( ）(数据2 (e)和2 (f))，而cAMP含量则减少( ）(图2 (k))。IL-6和INF-的水平γ与疾病模型组相比，CWT-H组血液中 )，和β-EP含量在各剂量CWT和BC组均降低( ）(图2(左))。BC和CWT-H组cAMP含量升高( ）(图2 (k))。

3.11.对蘑菇酪氨酸酶活性的影响

研究了CWT对香菇酪氨酸酶活性的影响。结果显示，三种不同浓度的CWT以剂量依赖的方式增加酪氨酸酶活性(图2)5)。

3.12.CWT对B16黑色素瘤和PIG3V细胞的细胞毒性研究

采用MTT法检测CWT对B16黑色素瘤细胞和PIG3V活力的影响。CWT浓度分别为5、10、50、100、150、200、250和300μ克/毫升。CWT处理48 h，在100℃时产生轻度细胞毒性μ在B16细胞和150μg/mL在PIG3V细胞中，但在较低剂量下没有(图2)5 (c)和5 (f))，所以浓度在5μg/mL和100μg/mL，测定对酪氨酸酶活性和黑色素合成的影响。CWT在B16细胞和PIG3V细胞中均以剂量依赖的方式增加黑色素水平。

3.13.CWT对B16细胞和PIG3V细胞黑色素合成的影响

为了排除CWT的细胞增殖效应可能导致黑色素含量升高的可能性，不同CWT浓度下相同数量细胞的吸光度(5-100)μg/mL)。CWT处理后，B16细胞和PIG3V细胞的黑色素水平均呈剂量依赖性增加(图2)5 (b)和5 (e))。50μ选取g/mL作为进一步实验的有效浓度。

3.14.CWT对B16细胞MITF和TYR蛋白表达的影响

由于CWT增加了黑色素的合成，我们探讨了这是否与MITF的表达有关，而MITF在TYR基因的表达和黑色素形成中起着关键作用[8]。Western blot分析了黑素基因的表达情况，结果表明CWT显著增加了黑素基因TYR、trp1、trp2和转录因子MITF的蛋白表达，并呈近似剂量依赖性(图2)5 (g))。CWT存在时，B16细胞中MITF、TYR、trp1和trp2的转录水平呈剂量依赖性显著升高。

3.15.CWT对PKA信号通路的影响

PKA信号通路参与黑色素形成并促进细胞cAMP水平激活PKA [21]。该通路是CREB的激活因子，并导致MITF转录上调[22]。为了阐明CWT对黑素形成的影响是否也通过PKA信号通路介导，我们使用PKA抑制剂H89进行了实验，包括黑色素含量测定、MITF表达和TYR活性。经H89预孵育后，CWT对黑素形成的影响被抑制(图2)6 (c)和6 (d))。MITF表达也降低，H89 (10μM)和CWT提取物(100μg / mL)(图6 (e))。cAMP含量(图6 (c))和CREB磷酸化对CWT的反应显著增加(图2)6 (d)和6 (e))以剂量依赖的方式。

4.讨论

白癜风是一种广泛存在的令人痛苦的自身免疫性皮肤病，目前尚无经证实的常规治疗方法。白癜风的发病机制及其病因复杂而不清楚。在中国新疆，“香菜片”(CWT)的配方已经被用来治疗白癜风几十年了。11]。我们研究了CWT对白癜风体外和体内模型以及B16细胞黑色素生成的影响，并将其与白癜风胶囊(BC，中国白癜风常用药物)进行了比较。

在评价药物的作用机制和安全性时，必须对细胞毒性进行评估，并对CWT在B16细胞中的作用进行了研究。浓度为1-50时无细胞毒性作用µg/ml, CWT对B16细胞增殖有促进作用。黑色素含量与酪氨酸酶活性及其蛋白水平相关[23]，因此进一步探讨CWT对酪氨酸酶活性和表达的影响。CWT以浓度依赖性的方式显著增强酪氨酸酶活性和黑色素合成(图2)3(一个)和3 (b))，这表明它上调了B16细胞的酪氨酸酶活性，并改善了细胞黑色素的产生。

我们进一步研究了CWT对B16细胞系黑色素形成的影响，以阐明其潜在的分子机制。在我们的研究中，CWT增加了MITF和TYR，并且随着剂量的增加，其程度逐渐升高。细胞内cAMP呈剂量依赖性增加，激活PKA信号通路，后者激活CREB [22]。MITF是TYR的主要转录调控因子，通过CREB激活而上调，在黑色素形成中起着关键作用[24- - - - - -26]。这些结果表明，CWT通过PKA信号通路调控黑素形成。

TRP-1和TRP-2是跨越黑素体膜的跨膜蛋白，有助于调节TYR活性[27]。CWT增加了B16细胞中TRP-1和TRP-2的表达。黑色素相关信号通路通过MITF参与黑色素形成[28]。ERK MAPK通路也参与黑色素生成[24]， cAMP上调激活B16细胞和正常人类黑色素细胞中的MAPK [25]。MAPK和PKA通路调节cAMP信号通路在黑色素合成中的作用[j]26]。当细胞内cAMP储存时，它激活PKA, PKA随后磷酸化CREB并激活MITF转录[27]。我们的研究结果表明，CWT通过cAMP含量的积累激活PKA信号通路，刺激CREB，从而触发MITF转录。MITF上调黑色素生成基因，包括TYR、trp1和trp2。

实验动物模型采用小鼠和豚鼠，是在先前方法验证的基础上选择的[29- - - - - -31]。采用对苯二酚诱导C57BL小鼠白癜风。对苯二酚的单苯醚在临床上用于白癜风患者完全脱色[32，33]。过氧化氢用于豚鼠模型。活性氧(ROS)在白癜风的发病机制中发挥作用，表皮黑色素细胞的损失可能是氧化应激的结果[34，35]。表皮过氧化氢(H₂O₂)见于白癜风的病变及非病变皮肤[36，37]。

白癜风胶囊(BC)或“白癜风胶囊”是一种非处方药，已列入《中国药典》(2020年版第1卷)，广泛用于治疗白癜风[38，39]。该公式作为CWT评价的阳性对照。BC中补骨脂素的总含量为~ 1.85 mg/g [40]，在CWT中为~ 3.75 mg/g;然而，使用的BC剂量，小鼠720 mg/kg和豚鼠270 mg/kg，比CWT含有更高浓度的补骨脂素。

补骨脂素和异补骨脂素通过刺激黑色素细胞中的黑色素含量和酪氨酸酶活性而起作用[41]和抗氧化活性[42]。白癜风中氧化应激的降低下调关键细胞因子，阻止黑素细胞死亡并保护病变周围角质细胞免受损伤[j]。43]。

CWT-H在小鼠模型中增加了血液和皮肤组织中TYR的含量，BC也增加了TYR的含量。免疫组织化学染色用于确定组织或器官中蛋白质的水平和位置[44，45]。BC组小鼠皮肤中TYR、TRP-1、TRP-2的表达较模型组显著上调，CWT组也呈剂量依赖性升高。

白细胞介素-6 (IL-6)是一种促炎细胞因子，也是自身免疫性疾病发病的关键因素，据报道白癜风病变中白细胞介素-6水平升高[46]。更高的干扰素-γ白癜风患者血液和皮肤中IL-6水平的变化[47- - - - - -50是诊断白癜风的指标。［46，51]。与小鼠模型不同，CWT在豚鼠模型中表现出比BC更强的作用。干扰素-γil - 6,β- ep和cAMP含量在CWT治疗后恢复到未治疗对照组水平，但IFN-无显著变化γ白细胞介素-6含量随BC升高。CWT组皮肤组织中TYR活性的升高和血液中MDA的降低也呈显著剂量依赖性;而BC组无明显变化。

总体而言，CWT比BC在将白癜风模型中不平衡的参数恢复到接近正常水平方面表现出更强的效果。

5.结论

CWT能够通过激活p38 MAPK和PKA信号通路促进B16细胞中酪氨酸酶活性和黑色素合成。在两种白癜风动物模型中，CWT可减轻对苯二酚或过氧化氢引起的有害变化。我们的研究结果表明，这至少部分是由于刺激色素沉着和重建氧化还原平衡，阻止黑素细胞因损伤而死亡。CWT在小鼠模型中表现出与BC相当的效果，在豚鼠模型中表现出更好的效果，尽管CWT给药剂量的补骨脂素浓度低于BC。因此，CWT可能是一种治疗白癜风的潜在药物，但需要进一步研究以确定其有效成分和临床应用。

数据可用性

本研究过程中产生或分析的数据包含在本文中。

伦理批准

所有动物处理程序均按照中国卫生部《动物管理条例》和新疆实验动物中心动物管理委员会批准的动物实验标准执行。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

h.a.a.和a.a.构思并设计了实验并撰写了文章;A. A.、L. X. Y.、Z. D.和W. T.进行了实验;A.分析数据;h。A。A修改了研究。

致谢

本研究由中国科学院药物发现与开发研究所(CASIMM0620183001)和新疆维吾尔自治区天山青年项目(2018Q007)资助。

补充材料

补充材料包括示意图，显示了本研究的设计和核心发现(图S1)，以及基于先前方法制备葛缕子片的方案(专利号:CN 107569532 A)，可以通过输入专利号在文本1或https://www.drugfuture.com/cnpat/cn-patent.asp中找到。（补充材料）

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