液相色谱-串联质谱法测定伐地那非及其生物等效性应用

摘要

建立了一种简便、快速、灵敏的液相色谱-串联质谱法(LC/MS/MS)测定兔血浆中伐地那非的方法。用冰冷乙腈沉淀蛋白的方法进行血浆提取。用质谱仪m/z 489⟶151和m/z 390⟶169分别测定伐地那非和他达拉非(内标)，总运行时间为6 min。检测限为0.2 ng/mL。该方法重复性好，法内和法间精密度分别为1.17% ~ 9.17%和1.31% ~ 5.86%。法内和法间精密度分别为89.3% ~ 105.3%和94% ~ 102%。兔血浆线性范围为0.5 ~ 60 ng/mL (≥0.99)。测量0 ~ 24 h的AUC试验配方和参考配方分别为174.38±95.91和176.45±76.88。的测试,而且分别为75.36±59.53 ng/mL和1.42±0.19 h，而作为参考，分别为58.22±36.11 ng/mL和2.04±0.33 h。试验配方达到略低值(> 0.05),高值(> 0.05),速度更快（< 0.05)，与参考配方相比，生物利用度几乎相等。

1.简介

伐地那非(2-[2-乙氧基-5-(4-乙基哌嗪-1-基)磺基苯基]-5-甲基-7-丙基- 3h -咪唑[5,1 -f][1,2,4]三嗪-4-酮;三水合;盐酸)是一种高效选择性磷酸二酯酶5 (PDE5)抑制剂[1］．在推荐剂量(5-20 mg)下，有勃起功能障碍(ED)且无色觉异常报告的男性通常能很好地耐受该药物[2］．与西地那非和他达拉非相比，伐地那非对PDE5的选择性为4- 25倍，而西地那非和他达拉非的选择性分别为10和5倍[1，2］．高脂肪食物被观察到减少吸收伐地那非口服18%-50%的最大浓度［3.］．伐地那非与血浆蛋白高度结合(95%)。平均半衰期伐地那非的剂量为3.94至4.79 h [2］．它在肝脏中广泛代谢，主要由细胞色素P450 (CYP) 3A4代谢，少部分由CYP3A5和CYP2C亚型代谢[3.］．伐地那非薄膜包衣片经过广泛的第一次代谢，其绝对生物利用度约为15% [4］．

以口服分散片剂形式配制伐地那非可绕过肝脏的第一次代谢，甚至可以在饭后服用，从而提高患者满意度[5- - - - - -7］．一项综合分析得出结论，无论ED基线严重程度、年龄或潜在状况如何，伐地那非或分散片可显著改善ED男性的勃起功能[8］．然而，目前上市的伐地那非或分散片需要较长时间才能达到最大浓度［5，9］．在口服分散制剂中不当使用辅料会导致药物主要通过胃肠道途径而非经黏膜口服途径被吸收[5］．因此，目前的或分散剂型应该有一个更快的作用开始减少 ．此外，新优化的口服分散剂配方还必须表现出与已上市口服分散剂片相似的药代动力学参数和生物等效性。

在本研究中，在兔血浆中定量伐地那非存在一些挑战。10 mg剂量的伐地那非ODT给兔低剂量;只有150µ每个采血时间点回收血浆样本L份。大多数以前的研究需要大量的样本量来达到非常低的定量限(LLOQ)。Carlucci等人(2009)开发了一种利用紫外检测的高效液相色谱法(HPLC)测定人血浆中伐地那非的方法[10］．但该方法繁琐，需要有机溶剂的双重提取步骤，也需要大量血浆(1ml)和高注射量(20µL)运行时间为15分钟[10］．采用高效液相色谱串联荧光检测器定量测定大鼠血浆中的伐地那非[11］．该方法运行时间较长，为18 min, LLOQ保持在较高水平(10 ng/mL) [11］．Abu El-Enin等人(2015)开发了一种荧光光谱法来定量人血浆和药品中的伐地那非[12］．尽管只用乙腈的简单蛋白质沉淀法，但该方法需要大量的人血浆(1ml)才能达到10 ng/mL的LLOQ [12］．

除了高效液相色谱-紫外检测外，液相色谱-串联质谱(LC/MS/MS)还可以用于生物样品中药物和代谢物的定量，因为其灵敏度和选择性高。这只需要小的样品体积和有一个短的分析时间。

一些有效的LC/MS/MS方法定量血浆中的伐地那非已经发表[4，13］．Ku等人(2009)开发的测定人血浆中伐地那非的方法需要0.25 mL血浆才能达到0.5 ng/mL的LLOQ [4］．Lake等人(2010)的另一种方法需要0.2 mL血浆才能达到0.2 ng/mL的LLOQ [13］．这两种方法在制备样品时需要液-液萃取和溶剂蒸发[4，13］．相比之下，Bhadoriya等人(2018)开发了一种通过固相萃取从0.2 mL人体血浆中提取他达拉菲的方法[14］．在0.5 ~ 500 ng/mL浓度范围内，校正曲线呈线性关系[14］．相反，Kim等人(2017)开发了一种使用乙腈从0.02 mL人类血浆中沉淀他达拉菲的方法[15］．该方法的LLOQ为5 ng/mL，总运行时间为1分钟[15］．上述方法至少需要200个µL的血浆与繁琐的提取方法相关联，以达到0.5 ng/mL的LLOQ。因此，需要一种新的方法来解决样本有限的问题，并获得非常低的LLOQ。

2.材料和方法

2.1.材料和试剂

盐酸伐地那非三水(USP)购自马来西亚Medigene (M) Sdn Bhd。盐酸伐地那非三水和他达拉非标准品的纯度均为>99%。lcms级乙腈和甲酸也从Sigma-Aldrich (M) Sdn Bhd购买。标准他达拉非来自马来亚大学药理学学院。混合空白血浆来自马来亚大学动物实验单位(AEU)。

2.2.制定标准和质量控制(QC)

在乙腈中制备了伐地那非(1mg /mL)和他达拉非(IS)的原液。用兔血浆进一步稀释原液，制成浓度为0.5、1、5、10、20、30、50、60 ng/mL的工作标准溶液。制备最终浓度为40 ng/mL的内标。用同样的方法制备了低(1.5 ng/mL)、中(25 ng/mL)和高(45 ng/mL)的三种QC样品。

2.3.样品制备

用一种简单的蛋白沉淀法从血浆样品中提取伐地那非和IS。首先,100µL兔血浆与25µ他达拉非(IS)和漩涡混合30秒。然后,200年µ在混合物中加入L冰冻的乙腈，再次涡旋混合30 s，使蛋白质沉淀。随后，混合物在5°C下以14000 rpm离心10分钟。收集上清µL of ali' s直接注入LC/MS/MS。

2.4.色谱条件

色谱分离使用安捷伦的Zorbax Eclipse Plus (2.1 × 50 mm id;1.8µM)加上一个保护柱。梯度洗脱使用流动相组成的0.1% (v/v)甲酸在水(溶剂A)和乙腈(100%，溶剂B)1描述方法中使用的梯度条件。液相色谱(LC)的流速保持在0.4 mL/min，总运行时间为6 min。伐地那非和他达拉非的保留时间分别为1.56和1.84 min。

2.5.质谱条件

采用正模式电喷雾电离质谱法。碰撞能量设置为45 eV，电池加速器电压设置为4 V，碎片器电压设置为135 V。气体温度设置为280°C，雾化器为50 psi，流速为12 L/min。上述设置是在显示最高信号时确定的。用m/z 489⟶151作为量词，m/z 489⟶312作为限定词。反过来，他达拉非的质量跃迁被鉴定为m/z 390⟶169为量词，m/z 390⟶135为限定词。数字1显示了伐地那非和他达拉非的质谱。

2.6.方法验证

该方法的准确性、精密度、特异性、线性、稳定性和回收率均得到了验证。根据美国食品及药物管理局(USFDA)公布的《生物分析方法验证:工业指南》进行验证[16］．该方法在0.5-60 ng/mL的浓度范围内通过三个级别的质量控制(QC)样品进行验证:低质量控制(1.5 ng/mL)，中质量控制(25 ng/mL)和高质量控制(45 ng/mL)。

2.7.动物伦理

动物伦理学由马来亚大学机构动物护理和使用委员会(UM IACUC)批准，伦理参考编号:2018-190403/PHARM/PS/GKZ。兔子由马来亚大学医学院AEU提供。

2.8.临床应用

该研究为随机、单剂量、平衡两期交叉设计，洗脱期为7天。实验前禁食12 h。兔子只被允许自由取水。在第一阶段，6只兔子按照随机化计划服用试验配方(新优化的伐地那非ODT)，另外6只兔子服用参考配方(Staxyn®ODT 10 mg)。在1周的洗脱期后，兔子换用另一种配方。给药前肌注低剂量氯胺酮(10 mg/kg)和羟嗪(1 mg/kg)以促进给药。然后将试验配方或对照配方置于兔舌下，如图所示2．然后用毛巾包裹兔子以抑制其运动，然后抽取0.5 mL血样;用直接穿刺技术在每个时间点用27g × 在给药后0、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h时，从兔耳缘静脉抽出“针”。血液样本立即在5°C下14000 rpm离心10分钟，血浆样本保存在−20°C下，待LC/MS/MS进一步分析。在研究结束时，兔子被安乐死并按照实验室规程处理。

2.9.生物等效性评价

进行方差分析 ，AUC0 -t, ，有或没有log变换。使用phoenix WinNolin®8.1软件计算生物等效性统计值，确定90%置信区间范围。采用IBM SPSS Statistics 25软件确定显著性值而且 ．

3.结果

3.1.特异性和选择性

六种不同的来源(n= 6)的空白兔血浆，考察特异性和选择性。在分析物的保留时间内未观察到干扰峰。数字3(一个)显示空白等离子体的色谱图。相反，空白血浆中添加伐地那非和IS的LLOQ和定量上限(ULOQ)浓度如图所示3 (b)而且3 (c),分别。在伐地那非滞留时，血浆中未观察到干扰峰。数字3 (d)显示给药1.5 h后的血浆样品。实验证明，该方法具有较高的选择性和特异性。

3.2.线性

采用8种不同浓度(0.5 ~ 60 ng/mL)通过最小二乘线性回归(加权1/×)建立线性关系。决定系数8个校准器的校准值为0.99，且校准曲线呈线性关系。通过失拟试验验证了该方法的线性性。方差分析(ANOVA)检验表明，在95%置信水平下，F值小于表中F值;因此，线性回归并不缺乏拟合。

方法的检出限为0.2 ng/mL，信噪比为3。确定校准曲线上的最低浓度为LLOQ，精度和精密度在±20%以内。在连续3天内以校准曲线最低浓度重复3次，以建立最低定量限。伐地那非的定量限为0.5 ng/mL，信噪比大于10。

3.3.不精确和准确性

使用6个重复的LLOQ、ULOQ和3个水平的QC样品来确定方法的准确性和精密度。最初，LLOQ, ULOQ和三个QC样品在一个批次中提取了6次。之后，他们又分两批进行了六次提取。表格2显示不精度和准确度的日间和日间测试结果。最高相对标准偏差(RSD)为8.89%。该方法具有重复性，检测内不精密度范围为1.17% ~ 9.17%，检测间不精密度范围为1.31% ~ 5.86%。该方法在89.3% ~ 105.3%的预测值范围内具有良好的检测内准确度，而在94% ~ 102%的预测值范围内具有良好的检测间准确度。结果如表所示2符合验收标准;因此，该方法的不精密度和精度是足够的。

3.4.稳定

在不同的贮藏条件下，采用低质量控制(LQC)和高质量控制(HQC) 3个重复进行稳定性评估。伐地那非的稳定性见表3.在室温等离子中测试8 h，在10℃的自动采样器中测试24 h，在20℃的冻融循环中测试3个，在−20℃的条件下测试2个月。为满足验收标准，RSD必须≤15%。本研究的RSD最高为12.72%，平均准确度在88.7% ~ 108.4%之间，且伐地那非无明显降解，见表3.．

3.5.复苏

血浆中伐地那非和IS的平均回收率分别为101.4%和70.0%4)．为了研究基质效应，在LQC、MQC和HQC水平上比较了萃取后加标样品与流动相溶液萃取样品的对应峰面积。矩阵效应的验收标准包括RSD≤15%。在本研究中，最高RSD记录在表中5是4.38%。因此，未观察到显著的基质效应。

3.6.稀释的完整性

以1:10稀释倍数从含有350 ng/mL伐地那非的血浆中稀释6个重复的血浆样品进行稀释完整性试验。用兔血浆进行稀释。本研究使用350 ng/mL的浓度进行稀释，因为它覆盖了所有检测到的浓度范围，并且稀释浓度(35 ng/mL)不与任何质量标准或校准点重叠。RSD≤15%才能满足验收标准。平均准确率和RSD分别为94.85%和8.35%6)．这说明分析物在验证范围以上的样品可以稀释到可测范围内，如图所示4．

3.7.药代动力学参数

所有药代动力学参数采用Phoenix Win Nolin ver.8.0非室室分析计算;这些总结在表中7．从0到24小时曲线下的测量面积值以及从0到无穷曲线下的面积试验配方和参考配方相同，分别为174.3±95.91和176.45±76.88。相反，最大浓度还有时间达到最大的专注度试验配方为75.36±59.53 ng/mL, 1.42±0.19 h，参考配方为58.22±36.11 ng/mL, 2.04±0.33 h。的意思是试验配方和参考配方的值分别为4.83和4.75 h。的意思是而且试验配方与参考配方非常接近。的平均值与先前的报告一致[9］．的试验配方值高于参考配方值。的试验配方的数值低于参考配方，说明试验配方在较短的时间内达到了最大的治疗效果。

4.讨论

4.1.该方法的优点

液-液萃取需要干燥过程来提高峰的分辨率，耗时长，需要大量有机溶剂，且回收率不一致[17］．固相萃取比液-液萃取更清洁，是更好的选择[14，17］．然而，这种方法需要调节柱和昂贵。相比之下，本研究采用冰冷乙腈简单蛋白沉淀法提取伐地那非。与以前发表的方法相比，这种提取方法简单、成本低、省时。

这种新开发的LC/MS/MS方法也具有很高的灵敏度，因为它只需要少量(100µL)和小的注射体积(2µL)与之前的方法比较。该方法虽然样品量小，进样量小，但仍能达到较低的药物浓度定量水平(LLOQ = 0.5 ng/mL)。样品分析速度快，总运行时间6 min。发现梯度洗脱色谱分离效果优于等差洗脱。给药1 min后，伐地那非和IS分离，保留时间分别为1.56和1.84 min。

本研究中，LQC的法内和法间不精密度RSD≤20%，MQC和HQC的RSD≤15%。该方法在89.3% ~ 105.3%的法内精密度和94% ~ 102%的法间精密度范围内具有较好的准确性。因此，该方法表现出可接受的精度和准确性。伐地那非的稳定性研究表明，伐地那非在室温下稳定8 h，在10℃自动进样器中稳定24 h，在20℃冻融循环3次，在−20℃下稳定2个月。

4.2.兔模型

以兔为模型进行舌下分娩的研究已在文献中广泛建立和报道。与兔子相似，其他动物如狗、猪和猴子是可接受的模型，其口腔黏膜无角化，通透性值与人类相似[18］．兔子和狗被普遍认为是最适合人类的动物模型，因为它们的口腔组织相似[19]，然而，操作方便和动物成本使兔子比狗更受欢迎[20.］．兔和人舌下黏膜均无角化;因此，兔舌下给药可能与人口腔内药物吸收有关[20.］．

4.3.方法的应用

该新开发并验证的LC/MS/MS方法成功应用于12只健康家兔体内对新优化的伐地那非口服分散片(试验剂型)与市售口服分散片(对照剂型)的药代动力学研究。数字5绘制12只兔伐地那非的平均血药浓度随时间变化曲线。试验配方能够比参考配方更快地在体内达到最大浓度，并具有更快的起效时间。外推的百分比如图所示5试验配方和参考配方分别为3.14%和2.58%。低的外推百分比表明一个好的采样点。此外，这种方法获得的极低LLOQ使图能够正确绘制。

4.4.方差分析与生物等效性统计

4.4.1.曲线下面积，

试验/参考比的90%置信区间(CI)为78.11 ~ 114.46。然而，就AUC而言，测试配方与参考配方并不具有生物等效性，因为结果不在Log 10 AUC的80%-125%的90% CI的可接受范围内。可接受范围是根据欧洲共同体的欧洲药品评估机构(EC-EMEA)，美国fda和马来西亚国家药品监管机构(NPRA)。结果落在80%-125%之外的Anderson Hauck概率，即值落在80%-125%之外的概率为0.059(5.9 / 100)。该值大于0.05(5 / 100)显著性水平，因此不能拒绝上述假设。虽然试验配方与参考配方不具有生物等效性，但它们的平均AUC_0-24t值非常接近(分别为174.38和176.45 ng·h/mL)。

4.4.2.最大浓度,

试验/参考比的90% CI为89.56-165.35。试验配方与参考配方在生物等效性方面并不相同因为结果没有在Log 10 AUC的80%-125%的90% CI的可接受范围内。可接受范围根据EC-EMEA, USFDA和NPRA。结果落在80%-125%之外的Anderson Hauck概率(表示值在80%-125%之外的概率)为0.42(42 / 100)。该值大于0.05(5 / 100)显著性水平，因此不能拒绝上述假设。虽然试验配方与参考配方的生物等效性不高，但平均含量分别为75.36和58.22 ng/mL，高于参比配方。

4.4.3.是时候达到最大专注力了，

的意思是试验剂型和参考剂型伐地那非的值分别为1.42和2.04 h。Wilcoxon符号秩检验显示在值(两者之间< 0.05)。这意味着测试配方比参考配方更快地达到其最大浓度。因此，试验配方优于参考配方。

4.4.4.半衰期,

的意思是试验配方和参考配方的伐地那非的值分别为4.83和4.75 h。配对t-test在两者之间的值(> 0.05)。

以上结果证明，我们新优化的配方与试验配方的生物利用度几乎相等，甚至以更快的速度达到更高的最大浓度。两组无显著差异对于试验配方和参考配方。

5.结论

我们报道了一种简单、快速、灵敏、特异的测定兔血浆中伐地那非的LC/MS/MS方法的开发和验证。使用MS/MS系统的主要优点是它在靶向感兴趣的离子方面的特异性。该方法成功应用于健康家兔单次给药10 mg伐地那非口服分散片后伐地那非的药代动力学研究。新优化的伐地那非口服分散片剂配方在药代动力学方面具有相似的数据而且 ．与参考配方相比，其生物利用度几乎相同，最大浓度更高，达到最大浓度的时间更短。开发一种新的量化方法来解决本研究中的挑战的目标已经实现。

数据可用性

用于支持本研究发现的数据包含在文章中。

的利益冲突

作者声明本文的发表不存在任何利益冲突。

作者的贡献

作者声明，该工作是由本文中提到的作者完成的，作者将承担与本文内容有关的任何索赔责任。概念化是由Riyanto Teguh Widodo, Zamri Chik和Teh Lay Kek完成的。方法论由Gan Kok Zheng、Zamri Chik和Teh Lay Kek执行。软件由Mohd Salleh Rofiee和Mohd Izwan Mohamad Yusof提供。验证和分析由Gan Kok Zheng和Mohd Izwan Mohamad Yusof进行。调查由Gan Kok Zheng、Mohd Salleh Rofiee和Mohd Izwan Mohamad Yusof完成。数据由Gan Kok Zheng收集。手稿是甘角正写的。手稿由Riyanto Teguh Widodo, Zamri Chik和Teh Lay Kek审阅。该研究由Riyanto Teguh Widodo、Zamri Chik和Teh Lay Kek监督。

致谢

作者感谢iPROMISE、UiTM的帮助，并为完成分析提供了设施和设备。

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