基于UHPLC-MS/MS快速测定人乳腺癌细胞中培美曲塞浓度及分布

摘要

细胞是构成一切生物体结构和功能的基本单位。细胞内药物浓度分布的研究有助于了解靶部位的药物疗效。培美曲塞是以吡咯烷基为核心结构的新型多靶点叶酸拮抗剂。建立了超高效液相色谱串联质谱(UHPLC-MS/MS)快速测定人乳腺癌细胞(MCF-7)培美曲塞浓度的方法。样品前处理采用甲醇蛋白沉淀法完成。在ZORBAX SB-C上实现了优化的色谱分离_18.柱(2.1 × 150毫米，3.5μ以0.1%甲酸水(A相)和乙腈(B相)为梯度洗脱，梯度程序从5% B开始，在2 min内提高到95% B，然后在95% B下保持1.5 min。培美曲塞在细胞和细胞核中的线性范围为2.0 ~ 200.0 ng/mL，在培养基样品中线性范围为50.0 ~ 5000.0 ng/mL，相关系数均大于0.99。回收率分别为47.50 ~ 67.55% (2.0 ~ 200.0 ng/mL)和82.72 ~ 97.15% (50.0 ~ 5000.0 ng/mL)，基质效应分别为98.10 ~ 100.62% (2.0 ~ 200.0 ng/mL)和89.78 ~ 97.65% (50.0 ~ 5000.0 ng/mL)。日间精密度和日间精密度(RSD%) < 15.0% (LLOQ < 20%)，准确度(RE%) <±15%;稳定性偏差在±15%以内，均满足生物样品分析的要求。细胞内样品检测结果显示，培美曲塞在给药后3 h浓度达到峰值。培美曲塞在给药2 h后继续增加，在6 h时可能达到最大浓度。

1.介绍

乳腺癌已成为危害世界各国妇女健康的严重疾病。根据《2020年全球癌症报告》[12018年，女性乳腺癌发病率在恶性肿瘤中排名第一(11.6%)，死亡率在恶性肿瘤中排名第五(6.6%)。《全国癌症报告》[2[2019年，2015年，2015年，乳腺癌的发病率在中国的雌性恶性肿瘤中排名第一，患有约304,000个新病例，并且死亡率在雌性恶性肿瘤（8.16％）中排名第五，发病率和死亡率，必威2490近年来呈现出越来越大的趋势。

目前，乳腺癌的治疗仍然是通过手术和化疗的主要疗效[3.]．有效的化学治疗方案扫描可降低转移和复发，从而增加延长存活时间的可能性[4.]．目前，化疗药物主要有蒽环类、紫杉醇、铂类、抗代谢药物等[5.]．尽管蒽环类和紫杉类药物在乳腺癌的辅助治疗中取得了令人印象深刻的进展，但复发性肿瘤对这些药物产生耐药性的情况很常见[6.-8.]，仍有20％〜30％的临床实践中耐药患者。即使初始治疗有效，绝大多数患者仍有疾病进展，最终发育转移性疾病。作为第三线化疗剂，Pemetrexed是一种抑制叶酸代谢和DNA合成酶的多元抗体代谢物药物。作为单一试剂的抗磷酸盐率的反应率不同于8％至31％，并且在组合方案中报告了15.8％和55.7％[9.]．集体研究支持培美曲塞有效延长了一部分晚期乳腺癌患者的生存估计，这是一种更好的药物，特别是在含蒽环类和紫杉类的方案之后[10.-12.]．

培育率为乳腺癌患者具有良好的疗效和依从性。然而，在不同的病理类型的肿瘤中观察到聚戊酰基化疗的可变治疗响应[13.]．细胞中磷酸盐的浓度被认为是影响疗效的重要因素。迫切需要对转移乳腺癌的磷酸化合物进行剂量优化，延长存活并改善耐受性。研究细胞内药物浓度的分布是有助于了解靶位点中的药物功效，但仍然没有向现在报告的LC-MS / MS方法。因此，该研究将基于UHPLC-MS / MS技术进行准确稳定的方法，可以快速确定细胞中磷酸盐的浓度和分布，这有助于深入了解培养基的药物功效。

2.方法

2.1。化学品

从Meilun Biotech Co.，Ltd.（中国大连市）购买了Pemetrexed（批次：D1103AS）和Nileotinib（内标准）（批次：D1201A）的标准。HPLC级甲醇和乙腈从Merck（Merck公司，德国德国达马斯特达特）获得。HPLC级二甲基亚砜（DMSO）购自Tedia Company Inc（Tedia，Fairfield，Oh USA）。HPLC级异丙醇是由上海泰坦科技有限公司（中国上海，中国上海泰坦）购买。HPLC级甲酸来自麦克林生物化学技术有限公司（麦克林，中国上海）。高葡萄糖细胞培养基由Hyclone公司（Logan，Utah，USA）提供。蒸馏水购自Watsons Distilled Water Co. Ltd.（中国深圳沃顿）。人乳腺癌MCF-7细胞系由中国科学学院上海分公司（中国上海）提供。青霉素 - 链霉素溶液购自上海媛叶生物科技有限公司（中国上海愿景）。RIPA裂解缓冲液从上海媛媛生物技术有限公司（中国上海愿景）提供。 The cell nucleus extraction kit was got from Abbkine Scientific Co., Ltd. (Wuhan, China).

2.2。仪器

所有实验均在Agilent 1290系列UHPLC系统上进行，包括在线脱气器，Quatpump，自动进样器和柱式炉，并与Agilent 6460A TripluquadRupole质谱仪接合，用电喷雾电离源（ESI，Agilent Technologies，USA）。通过安捷伦Masshunter工作站收集并分析所有数据。生物安全柜来自德国Thermo Scientific;倒置显微镜来自日本东京奥林巴斯;温度控制的磁搅拌器来自雅培公司，郑州郑州。

2．3．色谱条件

选择ZORBAX SB-C18柱作为PEMORTEXED的分析塔（2.1×150mm，3.5 μm，安捷伦技术，美国)。流动相为乙腈和水(含0.1%甲酸)。以乙腈为有机相(A相)和水相(B相)为流动相，采用在线脱气系统自动脱气，流速为0.3 mL/min。梯度程序从5% A开始，在2分钟内增加到95% A，然后在95% A保持1.5分钟，消遣2分钟，总运行时间5.5分钟。柱温保持在35℃，进样量为5μl

2．4．质谱参数

在正离子模式下，选择ESI离子源进行质谱检测。数据扫描采用多反应监测(MRM)模式(图1）.干气、鞘气、雾化器气均为高纯氮。干燥温度为325℃，干燥气体流速为10 L/min。护套气体温度为350℃，流速为12 L/min。毛细管电压为4000 V，雾化器压力为50 psi。碰撞气体为高纯氮气，设定为0.2 mPa。培美曲塞和内标(IS、尼洛替尼)的主要质谱参数见表1．

2.5。标准溶液的制备

将加重2.00mg培磷离子置入2ml容量瓶中，加入适量的甲醇以溶解用几滴DMSO溶解。将储备溶液等分并储存在-80℃的冰箱中。将上述储备溶液用10％甲醇稀释，得到一系列的以下浓度的工作溶液：20.0,50.0,100.0,200.0,500.0,10000.0,20000.0,10000.0,20000.0，50000.0ng / ml用于培养基．制备两个校准曲线，用空白介质稀释工作溶液10次，得到校准样品;聚细胞内和细胞外样品的聚光磷酸浓度范围为2.0-200.0ng / ml和50.0-5000.0ng / ml。Pemetrexed的质量控制（QC）样品以相同的方式单独制备。最后，获得浓度为100.0,500.0,2000.0ng / ml和5.0,20.0,100.0ng / ml的QC样品。使用相同的方法制备是溶液，将2mg NiLotinib溶解在2ml甲醇中，然后用甲醇稀释，得到终浓度为2和20ng / ml的溶液，储存在-20℃下储存后来使用。

2.6。细胞培养

用含有10％胎牛血清和双抗生素的DMEM培养人乳腺癌细胞系MCF-7（100个 μg / ml青霉素和100 μ培养箱中的g / ml链霉素，完整培养基（37°C，5％CO₂）和每2或3天刷新培养基。当它们达到80-90％汇合时，将细胞传代或转移以制备储备溶液。

2.7。样品收集和预处理

2.7.1。实验执行和细胞样本集合

当细胞增长90％汇合时，丢弃培养基，用1×PBS洗涤细胞两次。在完整培养基中的培养基溶液，最终浓度为6 μg/mL分别孵育0、0.5、1、2、3、6 h。采集培养基作为培养基样本(参考)。PBS洗涤后，用含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化细胞，使细胞脱离生长表面。用完全培养基中和胰蛋白酶，将混合物转移到15ml离心管中离心(1000 ×g, 5 min, 4°C)。弃上清，100μ添加了RIPA裂解物以进行全裂解。将上清液作为细胞内样品收集，以13400×g以13400×g持续5分钟。实验用相同的方法逐一的三次进行三次。对于核样品，进行平行测定，并使用相同方式培养并用相同的方式进行培养并处理细胞，并使用萃取试剂盒进行渗透处理后收集核样品。

2.7.2。样本预处理

采用超滤-蛋白沉淀法对样品进行预处理。通过0.22过滤适量的培养基样品μM微孔过滤膜，60μ在加入340之前，将L滤液转入1.5 mL Eppendorf管中μL甲醇(含20ng /mL IS溶液)。细胞内和核样本，60μL滤液在加入180之前将滤液转移到1.5ml Eppendorf管中 μL甲醇(含2 ng/mL的IS溶液)。涡旋混合3 min后，在室温13000 ×g下离心10 min。然后,5μL上清直接进样分析。

2.8。方法论的研究

为保证测定结果的准确性、可靠性和稳定性，该方法的精密度和准确度、提取回收率、基质效应、稳定性和专属性应满足生物样品分析的要求。方剂验证按照中国药典(2015版)和FDA指南进行，实验按照我们之前报道的进行[14.那15.]．

3。结果与讨论

3.1。色谱条件优化

在方法开发期间，已经过了几个色谱柱，例如Zorbax SB-C._18., Eclipse XDB-C_18.，波罗壳120 SB-C_18., Eclipse + c_18.等通过比较它们的色谱特性（分辨率，峰值时间，响应，峰值形状等），结果表明，磷脂SB-C对磷脂具有更好的峰形状和反应_18.采用色谱柱，可在短时间内实现对内干扰物质的完全分离。因此,Zorbax SB-C_18.选择柱子用于开发方法。选择不同的流动相，乙腈和甲醇，以及含有甲酸和乙酸铵的添加剂以改善峰形，反应和保留时间，但是当乙酸铵加入到移动相时，甲醇带来更长的保留时间和尾峰并且分析物的响应低，峰形是不对称的。发现水相中的0.1％甲酸（V：v）可以显着增加分析物的响应，有机相中的0.1％甲酸（V：v）对分析物的响应具有类似的效果[16.]，因此我们在水相和有机相同时加入0.1%的甲酸，使培美曲塞在方法开发中的反应更好。为了缩短分析时间，优化流动相梯度，我们略微加快了有机相的增加，这可以缩短分析物的保留时间，因为有机相的快速增加会导致分析物的峰形变差。一般来说,提高有机相的比例在初始流动相可以降低大多数分析物的保留时间,但在我们的实验中,一个更高比例的乙腈受损峰的对称性,所以分析的总时间是5分钟,有机相的比例是在初始流动相设置为5%。

3.2。样本预处理

样品预处理是分析物提取过程中的一个重要步骤。样品处理的过程对实验结果产生了重大影响，例如，降低了基质效应，这是提高精度和精度的必不可少的。因此，进一步改善色谱系统的分辨率和敏感性需要更合适的样品预处理方法。当样品具有相对高的纯度和分析物的浓度时，更简单的预处理可以满足分析物提取;否则，需要复杂的提取过程，例如吸附和富集等[17.]．样品预处理的主要目的是去除蛋白质，一些脂质和可溶性盐。目前，蛋白质沉淀，固相萃取和液 - 液萃取通常用于样品预处理，每种方法都有自己的优点和缺点。蛋白质沉淀方法简单，快速，经济，但治疗后的基质中仍然存在许多杂质，这通常会带来强烈的基质效果。使用液液萃取处理的样品是清洁的，但提取恢复主要取决于分析物的物理化学性质，并且成本高于蛋白质沉淀。固相提取方法通常呈现稳定的提取率和清洁基质，但在三种方法中成本最高，并且需要复杂的技能以获得稳定的回收。通过比较甲醇和乙腈以不同比例的提取回收和基质作用，当甲醇被施用为沉淀剂时，结果表明较高的提取恢复，甲醇与样品的比例为3：1。为了进一步纯化样品并减少样品并减少在样品中污染细胞碎片，首先用0.22过滤样品 μM微孔膜，然后用甲醇沉淀滤液中的蛋白质。超滤联合蛋白质沉淀方法更适合于该实验。

3．3.方法验证

3.3.1。特异性

通过比较空白样本的色谱图，是LLOQ和测量的样本（图2)，在培美曲塞相同保留时间内无干扰物质，表明该方法特异性好，满足相关要求。

3.3.2。校准曲线的线性和LLOQ

胞内样品线性范围为2 ~ 200 ng/mL，胞外样品线性范围为50 ~ 5000 ng/mL。细胞内样品校正曲线结果见表2．结果表明，回归曲线的校正曲线是线性的，重量因子是1 /χ²，线性相关系数R.²大于0.99，表示校正曲线具有良好的线性关系，并满足相关性分析的要求。细胞内样品的LLOQ为2ng / ml。开发后需要研究的培养物的携带。检测到具有最高浓度培养物的校准样品后，然后测试坯料样品，重复3个循环以观察Pemetrexed的响应并在空白样品中。与LLOQ样品相比，在LLOQ样品中，空白样品中的Pemetrexed的响应小于LLOQ样品中的20％，并且在LLOQ样品中的空白样品中的响应小于5％（图3.）（其他校准曲线为50-5000ng / ml的方法）数据如辅助所示1）.

3.3.3。诠释和互动和准确性

选取低、中、高三个浓度的质控样品和低定量限(LLOQ)，考察方法的精密度和准确度。培美曲塞当日和日间精密度和准确度结果见表3.．结果表明:培美曲塞的日内精密度和日间精密度(RSD%)均小于14.67%;培美曲塞在低、中、高质量质控样品中的准确度(RE%)在±15%以内，在LLOQ样品中的准确度(RE%)在±20%以内，表明该方法具有良好的精密度和准确度。

3.3.4。萃取回收率和基质效应

该方法中培美曲塞的提取回收率和基质效应结果见表4.．结果表明，磷酸盐的提取回收率在47.50％和67.55％之间，基质效应为98.10％和100.62％。此外，培养基提取恢复和基质效应的RSD小于15％，表明培养基的提取恢复和基质效应是稳定的。

3.3.5。稳定

稳定性调查包括长期稳定性，短期稳定性和冻融稳定性。长期稳定性是指在-80°C的冰箱中3个月后QC样品的稳定性;短期稳定性是QC样品在4℃下置于4℃的自动取样器中的稳定性;在三个冻融循环后使用QC样品评估冻融稳定性。在低浓度和高浓度下研究了不同条件下磷酸盐的稳定性，结果显示在表格中5.．结果表明，培养基的准确度（RE％）范围为87.35％至96.80％，表明在上述条件下培养基稳定性稳定。

3.4。MCF-7细胞和培养基中磷酸盐的浓度

培养基样品、细胞内样品、核样品的测量结果见表6.．细胞样品的结果表明，在给药后3小时，细胞中磷酸盐浓度达到其峰。在施用后，核中的磷离的浓度继续增加2小时，并在6小时达到最大浓度。培养基通常施用500 mg / m²作为乳腺癌治疗的三线化疗药物，第1天为3周疗程。肿瘤细胞摄取和清除过程对细胞内浓度均有一定影响。有研究报道，tp结合盒(ABC)超家族，包括p -糖蛋白(P-gp/ABCB1)、乳腺癌耐药蛋白(BCRP，也称ABCG2)和ABCC亚家族(如ABCC1-12)的过表达，基于加速药物外排，显著降低了培美曲塞的细胞内浓度[18.-20.]，这是乳腺癌抗药性抗药性的重要因素[21.]．我们的结果显示了培美曲塞在McF-7细胞中的浓度变化，这可能为联合用药和优化剂量以达到协同作用，最终获得更好的疗效提供了线索。

4.结论

本研究建立了一种灵敏可靠的UHPLC-MS/MS快速测定细胞中培美曲塞含量的方法。超滤-蛋白沉淀法是一种简便、快速、经济的细胞中培美曲塞提取方法，其结果具有良好的特异性。该方法的线性范围、LLOQ、提取回收率、基质效应、日间精密度和准确度、稳定性等均满足生物样品分析的要求。细胞检测结果显示，培美曲塞在给药3 h后浓度达到峰值。培美曲塞在细胞核内的浓度从2 h增加到6 h，并可能继续在细胞核内积聚。进一步研究培美曲塞在细胞内的必威2490浓度和分布将有助于了解培美曲塞的治疗效果。

数据可用性

所有数据均包含在文章和补充中材料．

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

张梦伟和王志鹏对这项工作做出了同样的贡献。

致谢

基金资助:国家自然科学基金资助项目(no.);上海市卫生局(批准字:81202598)和上海市卫生局(批准字:81202598)。20ZR1435400)到y。

补充材料

其他校准曲线为50-5000ng / ml的方法数据如辅助材料所示。图1：Pemetrexed的代表MRM色谱图。（a）空白样本;（b）尖刺的空白样本;（c）用LLOQ浓度的Pemetrexed掺入空白样本;（d）真实的样本。表1：Pemetrexed的线性回归参数。图2：培养基的携带比较色谱图。（a）最高校准标准样品和（b）空白样品。表2：Pemetrexed的折衷和互动和准确性（N= 5)。表3：Pemetrexed（％）的恢复和矩阵效应。表4：培养基稳定性调查结果。（补充材料）

参考

1. C. P. Wild，E. WeiderPass和B. W. Stewart，癌症预防癌症研究，癌症研究机构，Lyon，法国，2020年，http:////publications.iarc.fr/586.．
2. R. S. Zheng，K。X. Sun，S. W.张等人，“2015年中国恶性肿瘤患病率分析”中国肿瘤学杂志，卷。43，不。1，pp。19-28,2019。查看在：谷歌学术搜索
3. Bai f, Yin y, T. Chen等，“脂质体培美曲塞增强治疗ABCC5介导的乳腺癌多药耐药的研究进展”，国际纳米医生杂志，卷。13，pp。1327-1339,2018。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
4. S.H.A.Ne.Fei，L. I. U. Yu-Lin，Q. I. A. N.G.Wang等，“胸苷酸合酶，”胸苷酸盐合成酶预测对晚期乳腺癌患者的植物化疗不良反应“肿瘤的信件，第16卷，第3274-3280页，2018。查看在：谷歌学术搜索
5. Q.-Q.邓，X.-e.黄，L。 -叶，y.-y。Lu，Y. Liang和J. Xiang，“Louba（Lobaplatin）的”二期试验“和转移性乳腺癌未响应蒽环或紫杉烷的患者，”亚太癌症预防杂志，卷。14，不。1，pp。413-417，2013。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
6. A. Sheri和S. Johnston，“系统治疗的新发展和未来方向，”临床肿瘤学第25卷，没有。2, 117-126页，2013。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
7. V. Kataja和M. Castiglione，“局部复发或转移性乳腺癌：ESMO临床建议，用于诊断，治疗和随访，”肿瘤学史，卷。19，没有。4，PP。II11-II13,2008。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
8. D. M. Parkin, F. Bray, J. Ferlay，和P. Pisani，“全球癌症统计，2002，”CA:临床医生的癌症杂志，卷。55，不。2，pp。74-108,2005。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
9. L.Y.周，Y。 -Shi，Y.S.贾等人，“培育乳腺癌患者在蒽环类或紫杉烷的转移乳腺癌患者中的潜在作用”慢性病和翻译医学(第23卷)1，页27-35,2015。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
10. A. Garin，A. Manikhas，M.Biakhov等，“局部晚期或转移性乳腺癌患者的Pemetrexed和Carboplatin的II期研究”乳腺癌研究与治疗，卷。110，没有。2，pp。309-315,2008。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
11. A. Llombart-Cussac，M. Theodoulou，K.罗兰等人，“患有局部晚期或转移性乳腺癌患者的患者，患有以前的蒽环类和紫杉烷治疗：II期研究，”临床乳腺癌，卷。7，不。5，pp。380-385,2006。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
12. C. Dittrich, E. Solska, A. Manikhas等人，“一项II期多中心研究，两种不同剂量的培美曲塞联合环磷酰胺作为局部晚期或转移性乳腺癌患者的一线治疗，”癌症调查，第30卷，不。4, pp. 309 - 316,2012。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
13. N. J. Robert, P. R. Conkling, M. a . O 'Rourke等人，“培美曲塞作为晚期或转移性乳腺癌患者一线化疗的II期研究结果，”乳腺癌研究与治疗，卷。126，没有。1，pp。101-108，2011。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
14. 张峰等，“一种直接、灵敏、高效的测定尿中α -氟-丙氨酸的方法:评价异甘草酸镁对大鼠模型排泄的影响”，色谱法杂志B，卷。1102-1103，pp。17-22,2018。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
15. S. Gao，Z. Tao，J. Zhou等，“同时测定十一种常用的抗癌药物的一步固体提取，HPLC-MS / MS，人血浆中的一种活性代谢物”，“化学分析方法杂志，卷。2018年，2018年12页第21页，2018年。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
16. 周杰，高胜，张峰等，“液相色谱-串联质谱法同时测定人血浆中7种常用抗癌药物，”中国色谱B：生物医学与生命科学的分析技术，第1卷，第1 - 8页，2012。查看在：谷歌学术搜索
17. Y. Liu，Z. Rong，X. Dong等，“胆汁酸的检测技术和代谢分析：综合评论”脂质在健康和疾病中，卷。17，p。121,2018。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
18. M. M. Gottesman，T.Fojo和S. E. Bates，“癌症中的多药抗性：ATP依赖转运蛋白的作用”自然评论癌症，卷。2，不。1，pp.48-58,2002。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
19. A. W.Ravna，I. Sylte和G. Sager，“调用衬底的分子模型释放多药抗性蛋白5（MRP5）”，“欧洲医药化学杂志，卷。43，不。11，pp。2557-2567，2008。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
20. M. Dean，T.Fojo和S. Bates，“肿瘤干细胞和耐药性”自然评论癌症，卷。5，不。4，pp。275-284,2005。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索
21. J. Liang，T. Lu，Z. Chen，C. Zhan和Q.. Wang，“抗非小细胞肺癌患者的抗性机制”肺癌转化研究第8卷第2期。6, pp. 1107-1118, 2019。查看在：出版商网站|谷歌学术搜索

betway赞助

betway赞助版权所有:张梦伟等这是一篇开放获取的文章创意公共归因许可证，允许在任何媒介上不受限制地使用、分发和复制，只要原稿被适当引用。