国际分析化学杂志

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国际分析化学杂志/2021/文章

研究文章b|开放获取

体积 2021 |文章的ID 6620868 | https://doi.org/10.1155/2021/6620868

曹伟毅,姚和志,钱真真,吴毅,王树阁,李锐,高锐 UPLC-MS/MS同时定量人血浆中阿司匹林及其代谢物水杨酸和丹酚酸B",国际分析化学杂志 卷。2021 文章的ID6620868 9 页面 2021 https://doi.org/10.1155/2021/6620868

UPLC-MS/MS同时定量人血浆中阿司匹林及其代谢物水杨酸和丹酚酸B

学术编辑器:大卫Touboul
收到了 2020年11月24日
修改后的 2021年2月7日
接受 2021年3月15日
发表 2021年3月29日

摘要

丹酚酸B是丹酚酸酯注射液的主要活性成分,由丹参提取而成,丹参是治疗心血管疾病最常用的中草药。临床上常用丹参酚酸注射液与阿司匹林联合治疗冠心病稳定期心绞痛患者。为了支持临床研究丹参酚酸注射液与阿司匹林之间的药物相互作用,建立了一种快速、灵敏的UPLC-MS/MS同时测定人血浆中阿司匹林(乙酰水杨酸)及其代谢物水杨酸和丹参酚酸B的方法。用乙酸乙酯液-液萃取从酸化血浆中提取分析物和内标物,然后用乙腈/0.5%甲酸水溶液在C18柱上梯度洗脱分离。采用负离子电喷雾电离多反应监测模式定量测定丹酚酸B、乙酰水杨酸和水杨酸。该方法根据现行生物分析法规指南进行了充分验证。对丹酚酸B和乙酰水杨酸采用线性回归模型,对水杨酸采用二次模型,建立了5 ~ 6000 ng/mL范围内的校正曲线,相关系数均大于0.99。应用该方法成功测定了16例患者血浆样品中丹酚酸B、乙酰水杨酸和水杨酸的浓度,观察了ddi引起的药代动力学变化。

1.介绍

丹参注射液是由应用最广泛的中药丹参提取而成,临床用于治疗冠心病稳定型心绞痛患者[1]。一项系统综述和荟萃分析显示丹参酚酸注射液联合西药可提高总治愈率和心电图有效率[2]以及减少冠心病患者的住院时间[3.]。药理研究表明丹酚注射液可通过抑制TGF-来保护心肌细胞β1/Smad2/3和TXNIP/NLRP3炎症信号通路[4]。此外,丹参酚酸B (salvianolic acid B, Sal B)作为丹参酚酸注射液的主要成分,可通过PDE抑制和P2Y12拮抗作用抑制人血小板活化[j]。5]。此外,即使血小板已经被激活,Sal B也可以减少炎症反应[6]。

临床上,丹酚酸注射液常与阿司匹林(乙酰水杨酸;ASA)治疗心血管疾病。临床研究表明,丹参制剂联合ASA可显著缓解心绞痛症状[7降低ASA对胃黏膜的损伤和胃出血的风险[8]。此外,实验室研究显示丹参和ASA之间存在潜在的药代动力学相互作用[910]。特别是丹参酚酸注射液与ASA合用可以通过改变药代动力学行为来提高疗效,降低毒性。因此,有必要开展丹参酚酸注射液与ASA的药物相互作用(ddi)临床研究,指导临床合理用药。

为了进行丹参酚酸注射液与ASA之间ddi的药动学研究,需要一种简便、灵敏的检测方法。在生物样品中,ASA及其代谢物水杨酸(salicylic acid, SA)常与其他心血管药物一起定量。已报道的阿司匹林和氯吡格雷联合检测方法采用蛋白质沉淀结合液-液萃取处理血浆样品;然而,这些操作的复杂性可能会增加实验误差[1011]。此外,液液萃取采用甲基-丁基醚已被用于阿司匹林和普伐他汀的联合检测方法[12]或阿托伐他汀[13]。对于液液萃取前的酸化,通常使用相对温和的有机酸,如1%甲酸(FA),以减少血浆中ASA和SA的电离[12]。然而,盐B通常需要一种强酸,如盐酸作为酸化剂[14]。另外,再溶萃取渣时,乙腈(ACN) [11]或含有高比例ACN的混合溶液,如ACN/H2O (80: 20, v/v,含0.5%醋酸)[10]或ACN/H2O (80:20, v/v,含5mm醋酸铵缓冲液)[12],通常用于ASA和SA。相反,含有甲醇(MeOH)的溶剂混合物,如MeOH/H2O (50:50, v/v)对Sal B是必需的[15]。因此,现有的生物样品分析方法都不适合同时检测ASA、SA和Sal b。在选择内标时还应考虑化学性质。氯霉素是一种酸性化合物,在血浆基质中具有较低的基线,已被报道作为体内分析salb的内标[1617]。此外,鉴于与Sal B、ASA和SA的生物分析相关的固有问题,包括缺乏稳定性和高极性[18],建立一个合适的生物分析方法是具有挑战性的。LC-MS/MS被认为是生物分析的金标准,具有高通量、灵敏度、特异性、小样本量要求和分析大量临床样品的适用性。然而,到目前为止,还没有报道过同时分析Sal B、ASA和SA的生物分析UPLC-MS/MS方法。

在这项工作中,我们建立了同时测定人血浆中Sal B、ASA和SA的UPLC-MS/MS方法。此外,验证方法是否适用于丹参酚酸注射液与ASA之间ddi变化的临床药代动力学研究。

2.材料与方法

2.1.化学品和材料

Sal B(批号P10J9F52565,纯度> 98%),ASA(批号SJ0714YA14,纯度> 98%),SA(批号J22S6J3607,纯度> 98%),氯霉素(IS;批号HM0328NA14,纯度> 97%)购自上海源业生物科技有限公司(中国上海)。Sal B、ASA、SA、IS的化学结构如图所示1

hplc级ACN、hplc级MeOH和Optima LC/ ms级FA购自Fisher Scientific, Inc (Fair Lawn, NJ, USA)。使用milliq超纯水净化系统(Millipore, Burlington, MA, USA)获得高纯水。从使用EDTA作为抗凝剂的健康志愿者中获得空白血浆样本。

丹酚酸酯注射液(批号17090623,200mg + 5%葡萄糖注射液,装在250ml, iv)购自上海绿谷药业有限公司(中国上海)。阿司匹林肠溶片(批号BJ38708, 100 mg)购自拜耳医疗保健有限公司(中国北京)。

2.2.UPLC-MS / MS条件

UPLC系统(由Acquity二元溶剂管理器和Acquity样品管理器组成,Waters, Milford, MA, USA)与MS/MS系统(Triple Quad™5500,AB Sciex, Framingham, MA, USA)结合用于测定生物样品中的ASA, SA和Sal B。使用Analyst软件(版本1.6.2,AB Sciex, Framingham, MA, USA)收集和处理数据。

色谱分离采用Acquity UPLC™BEH C18色谱柱(2.1 × 100 mm, 1.7μm, Waters, Wexford, Ireland),温度50°C。流动相为0.5% FA水溶液(溶剂A)和ACN溶液(溶剂B),梯度洗脱程序为:0-0.3 min, 95-75% A;0.3-1.3 min, 75-70% A;1.3-2.1 min, 70-30% A;2.1-2.5 min, 30% A;2.5-2.7 min, 30-95% A;2.7 ~ 4.0 min, 95% a,流速0.4 mL/min,注射量2μl

质谱仪在负离子电喷雾电离模式下工作。采用多反应监测(MRM)模式对分析物进行检测m / zSal B在717.2,519.1,ASA在179.1,137.0,SA在136.8,65.0,IS在321.0,152.0。优化的仪器条件为:气源温度400℃;离子喷雾电压,4000v;入口电位,10v;碰撞电池出口电位,17v;幕帘气,15psi;气体1.18 psi;气体是2 5 psi。分析物的碰撞能和聚类势列于表中1


组件 过渡(m / z) 碰撞能量(V) 聚类势(V)

萨尔B 717.2⟶519.1 −20.0 −50.0
亚撒 179.1⟶137.0 −10.0 −30.0
SA 136.8⟶65.0 −25.0 −50.0
321.0⟶152.0 −21.0 −100.0

2.3.标准溶液的制备

为制备原液(1 mg/mL),将ASA和SA准确称重并溶解在ACN中,而将Sal B溶解在MeOH中。将Sal B、ASA和SA原液按1:1:1,v/v/v混合,用MeOH/H连续稀释2O (80:20, v/v)获得标准工作溶液和质量控制(QC)溶液。在ACN中制备IS原液,用FA/H稀释2O (50:50, v/v)得到浓度为50ng /mL的工作溶液。所有溶液在4°C下保存。

2.4.校准标准品和质量控制样品的制备

标配标准品和QC样品用spiking 40制备μL的空白人血浆中含有10μ功解的L。在浓度为5、10、50、300、800、2000、5000和6000 ng/mL的血浆中制备Sal B、ASA和SA校准标准品。在血浆中以4种浓度制备Sal B、ASA和SA的QC样品:定量下限(LLOQ)为5 ng/mL,低QC (LQC)为15 ng/mL,中QC (MQC)为3000 ng/mL,高QC (HQC)为4500 ng/mL。校准标准品和QC样品每天新鲜制备,保存在冰水混合物中。

2.5.样品制备

血浆样本(50μL)飙升至20μIS的L为涡旋混合30 s。然后,300年μ血浆样品中加入L乙酸乙酯。液液萃取,将混合物涡旋2min,然后在4℃下12000 rpm离心10min。分离后,有机层在室温下在温和的氮气流下蒸发。在50℃下将残留物重新溶解μMeOH/ACN/H的L2O混合气(40:40:20,v/v/v)与涡流混合2分钟。在4°C下,12000 rpm离心10分钟后μ上清液L采用UPLC-MS/MS分析。

2.6.方法验证
2.6.1.特异性

使用来自不同志愿者的6个给药前血浆样本对该方法的特异性进行了研究。将6种来源的空白血浆的色谱图与添加相应分析物的空白血浆的色谱图进行比较,证实在分析物的保留时间内没有内源性化合物的干扰。如果与分析物共溶的内源化合物的峰面积小于定量定量限标准峰面积的20%,空白中的IS响应不超过校准标准和qc中平均响应的5%,则仍然可以满足定量标准[17]。

2.6.2.校准曲线线性及方法定量限

将相应分析物的工作溶液加入8种不同浓度的空白人血浆中,连续3天进行测量,建立Sal B、ASA和SA的校准曲线。采用加权最小二乘回归模型,利用分析物与IS的峰面积比与分析物的血浆浓度构建曲线。相关系数(r)要求为0.99或更高。下限定义为校准曲线上能以可接受的准确度(±20%以内)和精密度(相对标准偏差(RSD)≤20%)测量的最小浓度。

2.6.3.基质效应与萃取回收率

通过比较6种来源预处理后的空白血浆中Sal B、ASA、SA和IS的峰面积与相同浓度的纯标准溶液的峰面积来测量基质效应(ME)。被分析物的代谢能与IS的相应代谢能之比定义为RSD≤15%的IS归一化代谢能。利用QC样品中分析物的峰面积与预处理空白血浆中分析物的峰面积之比计算萃取回收率。回收率和代谢能在三种QC浓度(LQC, MQC和HQC)下通过六次重复测量获得。

2.6.4.精度和准确度

通过测定LLOQ、LQC、MQC和HQC样品,在每个浓度水平上进行6个重复,评估日内和日间的准确性。精密度定义为重复测量之间的RSD。准确度计算为观测浓度与标称浓度之比。QC浓度的准确度应在±15%以内,RSD小于15%,但LLOQ要求准确度在±20%以内,RSD小于20% [19]。

2.6.5.稳定

采用自进样器稳定性24 h、短期稳定性4 h、- 80℃长期稳定性60 d三种方法评价Sal B、ASA和SA的稳定性。为了确定自进样器的稳定性,将加入QC工作溶液的空白血浆样品在4°C的自进样器中保存24 h,然后引入UPLC-MS/MS仪器进行分析。通过在室温(~ 25°C)下保存4小时来评估短期稳定性。通过在- 80°C下保存60天来确定加标血浆样品的长期稳定性。每种稳定性测量采用三种QC浓度(LQC、MQC和HQC),每种浓度平行重复6次。

2.7.应用于药代动力学试验

在这项随机、开放标记、平行分组、单中心的临床试验中,16名冠心病患者被随机分为三组。阿司匹林组给予阿司匹林(100 mg QD),丹参酚酸酯注射液组给予丹参酚酸酯注射液(200 mg + 5%葡萄糖注射液,250 mL, iv),联合组给予阿司匹林(100 mg QD)和丹参酚酸酯注射液(200 mg + 5%葡萄糖注射液,250 mL, iv),每组连续用药10天。在第8、9、10天给药前和第10天给药后5分钟(仅阿司匹林组)、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时和24小时采集血样。在4°C下4500 rpm离心10 min分离血浆,然后在- 80°C保存以待分析。经验证的UPLC-MS/MS方法成功应用于测定血浆样品中Sal B、ASA和SA的浓度,从而观察丹参酚酸注射液与ASA之间ddi引起的药代动力学变化[20.]。该试验于2017年10月9日注册(ClinicalTrials.gov;NCT03306550)。使用Phoenix WinNonlin 7.0软件(Pharsight, a Certara Company, Mountain View, CA, USA)进行药代动力学分析。

3.结果与讨论

3.1.UPLC-MS/MS条件的优化

据报道,Sal B、ASA和SA在负离子模式下均表现出比正离子模式更高的信号强度[10- - - - - -15]。通过Q1筛选,发现去质子化分子离子的高强度稳定峰[Sal B-H]。-, (ASA-H)-, (SA-H)-,和[IS-H]-。将前体离子以中等强度碰撞能量进一步破碎后,为每个分析物选择离子信号最强的两个产物,并分别优化每个离子对的聚类势和碰撞能量。最后,识别出具有强信号的质量跃迁(m / z717.2为B区519.1m / z179.1 ASA为137.0m / z136.8 SA为65.0m / z321.0 (IS为152.0)。

ASA生成[SA-H]-在源内碰撞诱导解离过程中产生碎片离子,从而在ASA保留时间检测到SA的色谱峰。为避免影响SA的准确定量,采用优化的梯度洗脱方法分离ASA和SA色谱峰,如章节所述2.2。结果表明,两个色谱峰之间的分辨系数大于1.5。此外,降低流动相pH显著改善了尾矿中Sal B和SA色谱峰的分布。其中,0.1% FA水溶液和0.5% FA水溶液作为溶剂A,前者的峰形优于后者。

因为空白血浆中含有一定量的SA(来自食物)[21],降低气源温度、离子喷射电压和SA碰撞能量,提高了基线。如图所示2, Sal B、ASA、SA、IS的信噪比满足特异性要求,可用于样品分析。

3.2.样品制备

液-液萃取和蛋白质沉淀是最常用的等离子体处理方法。由于首过效应,口服给药后ASA血药浓度较低[22]。因此,使用有机溶剂蛋白沉淀法会使样品被稀释,使定量限的信号强度不足以满足定量要求。因此,我们选择液-液萃取法提取分析物。一般来说,液-液萃取优于蛋白质沉淀,因为产生的样品更清洁,这可以最大限度地减少ME并提高仪器性能。

当重新溶解氮干残留物时,我们发现使用不适当的溶剂组合导致不合格的标准曲线r< 0.99,这可能与分析物的溶解度有关。首先,ACN / H2从80:20 (v/v)到20:80 (v/v)的O比进行了研究。随着ACN含量的增加,ASA和SA曲线逐渐改善,但Sal B曲线上的大部分集中点仍然是分散的。当溶剂混合物中加入MeOH而不是ACN时,Sal B的标准曲线变为线性。然后是MeOH/H的组合2考虑了0 (80:20,v/v),但ASA曲线变成了非线性。最后,甲醇/ ACN / H2选择O (40:40:20, v/v/v)作为再溶氮干渣的溶剂混合物。

3.3.方法验证
3.3.1.选择性

空白血浆、LLOQ样品和实际血浆样品的典型色谱图如图所示2。保留时间Sal B为1.92 min, ASA为2.07 min, SA为2.39 min, IS为2.31 min。结果表明,在优化的实验条件下,各分析物在保留时间内均未出现内源化合物的干扰峰,各分析物的信噪比均大于10,符合定量生物学分析的可接受标准。

3.3.2.校准曲线的线性和灵敏度

在5 - 6000ng /mL范围内建立了8种浓度的Sal B、ASA和SA的校准标准曲线。每种分析物的三条标准曲线见表2随附的标准曲线为三批样品的精密度和准确度验证。使用权值为1/的最小二乘线性模型拟合Sal B和ASA数据x2Sal B的回归相关系数为0.9986 ~ 0.9991,ASA的回归相关系数为0.9959 ~ 0.9972。相比之下,SA数据拟合为1/y加权最小二乘二次模型,回归相关系数在0.9988 ~ 0.9999范围内。salb、ASA、SA的loqs准确度在±20%以内,其他各浓度点的准确度在±15%以内。


组件 方程 相关系数(r

萨尔B y= 0.0499x+ 0.0457 0.9991
y= 0.482x+ 0.0697 0.9988
y= 0.0436x+ 0.0595 0.9986

亚撒 y= 0.0211x+ 0.00794 0.9959
y= 0.0213x−0.00818 0.9972
y= 0.0187x+ 0.00661 0.9966

SA y=−5.98e−007x^2 + 0.012x+ 0.236 0.9999
y=−6.67e−007x^2 + 0.013x+ 0.277 0.9999
y=−4.99e−007x^2 + 0.0124x+ 0.259 0.9988

SA具有很高的蛋白质结合率[23]。因此,当SA被添加到空白血浆中时,部分SA与血浆蛋白结合,导致游离SA浓度低。由于空白血浆中白蛋白的含量有限,这一现象对低浓度SA的检测效果远大于对高浓度SA的检测效果,推测这是导致SA校准曲线非线性的原因。另一方面,当目标化合物产生的浓度或离子强度超过一定水平时,由于电离饱和、检测器饱和或两者兼而有之,质谱仪将表现出非线性响应[24]。我们发现SA校准曲线在接近定量上限的两点处明显弯曲,即使使用标准工作溶液而不是等离子体样品的整齐溶液构建。ASA曲线也有类似但不太明显的现象,而Sal B曲线则没有。此外,在相同浓度下,SA的信号强度低于ASA或Sal B,这表明SA的非线性曲线不是由检测器饱和引起的,而更可能是电离饱和引起的。因此,在高浓度下,SA在电离过程中没有完全电离,这可能与调整质谱参数以减少血浆样品中非药物来源的SA信号有关。然而,如表所示23个批次的SA标准曲线的回归相关系数均大于0.99;因此,这些影响和校准曲线的非线性不影响所建立的分析方法的有效性。

3.3.3.萃取回收率及基质效应

提取回收率数据表明,在三个QC水平上,提取方法对Sal B、ASA和SA都是有效的。在浓度为15、3000和4500 ng/mL时,Sal B的平均提取回收率分别为83.3±4.3%、85.3±4.3%和87.2±4.9%;97.9±5.2%,96.3±2.6%,亚撒和93.2±1.8%;和93.1±4.3%,94.6±1.3%,对SA 95.2±2.1%。如表所示3.其中,Sal B、ASA和SA的MEs分别为99.7 ~ 103%、97.3 ~ 102%和96.7 ~ 106%,说明没有显著的MEs。用IS对ME数据进行归一化处理后,每个分析物的ME值都降低了,这与矩阵对IS信号的增强有关。is归一化MEs的rsd范围为3.75% ~ 4.55%,表明三种浓度下分析物的MEs都是稳定的。


复合 名义浓缩的。(ng / mL) 萃取回收率(平均值±SD%) ME(平均值±SD%) is标准化ME (mean±SD%) RSD% (is标准化ME)

萨尔B 15 83.3±4.3 101±4 92.1±4.3 3.95
3000 85.3±4.3 103±4 94.0±2.8
4500 87.2±4.9 99.7±4.0 91.3±3.9

亚撒 15 97.9±5.2 102±3 93.4±3.0 3.75
3000 96.3±2.6 97.3±3.2 93.3±3.1
4500 93.2±1.8 101±2 92.3±1.7

SA 15 93.1±4.3 106±8 97.1±7.0 4.55
3000 94.6±1.3 96.7±2.6 95.0±2.5
4500 95.2±2.1 96.7±2.1 95.0±2.6

20. 107±6 109±3 - - - - - -

萃取回收率=(分析物在血浆基质中的平均峰面积)/(被萃取物在血浆基质中的平均峰面积)。ME =(萃取血浆基质中分析物的平均峰面积)/(稀释溶液中分析物的平均峰面积)。IS归一化后的ME =((提取血浆基质中分析物的平均峰面积)/(稀释溶液中分析物的平均峰面积))/(提取血浆基质中IS的平均峰面积)/(稀释溶液中IS的平均峰面积))。RSD% =(标准差/平均值)× 100%。
3.3.4.精度和准确度

通过分析3个批次的4个QC浓度,每个浓度6个重复,确定Sal B、ASA和SA的日内和日间精密度和准确度。如表所示4Sal B的日内、日间准确度分别为±8.7%、±8.5%,ASA的日内、日间准确度分别为±4%、±5.2%,SA的日内、日间准确度分别为±11%、±8.9%。Sal B、ASA和SA日内精密度分别小于5.31%、6.19%和8.52%,日内精密度分别小于7.56%、8.54%和9.59%。结果表明,精密度和准确度均满足生物样品分析的可接受标准。


名义浓缩的。(ng / mL) 盘中(n= 6) Interday (n= 18)
观察浓缩的。(ng / mL) 精密度RSD (%) 准确性(RE %) 观察浓缩的。(ng / mL) 精密度RSD (%) 准确性(RE %)

萨尔B
5 4.89±0.26 5.31 −2.2 4.94±0.37 7.56 −1.2
15 14.5±0.5 3.44 −3.3 15.1±0.8 5.01 0.6
3000 2802±106 3.77 −6.6 2746±108 3.92 −8.5
4500 4108±99 2.42 −8.7 4333±237 5.46 −3.7

亚撒
5 4.80±0.28 5.85 −4 4.96±0.42 8.54 −0.8
15 14.8±0.9 6.19 −1.3 14.4±0.8 5.48 −4
3000 3037±111 3.67 1.2 3157±147 4.55 5.2
4500 4332±140 3.22 −3.7 4184±196 4.70 −7

SA
5 5.38±0.46 8.52 7.6 5.14±0.49 9.59 2.8
15 15.8±0.8 5.26 5.3 15.7±1.0 6.29 4.6
3000 2663±82 3.09 −11 2734±134 4.90 −8.9
4500 4257±98 2.30 −5.4 4291±199 4.64 −4.6

RSD% =(标准差/平均值)× 100%。RE% =(观察到的平均值)。−名义频率。)/名义频率× 100%。
3.3.5.稳定

稳定性结果总结在表中5。三种浓度的Sal B、ASA和SA QC样品在室温(~ 25°C)下与酸化剂(20μFA/H的L2O (50:50, v/v)含IS)保存4小时或在- 80°C的冰箱中保存60天。QC样品的准确度在±15%以内,表明在这些储存条件下,分析物在血浆中是稳定的。考虑到ASA和SA可能被血浆中的生物酶降解,我们还研究了QC样品在室温(~ 25°C)下不加酸化剂4小时的稳定性。结果表明,大约40%的ASA被血浆酯酶代谢产生SA,表明酸化血浆抑制了分析物的降解。因此,在临床操作中,全血采集后应立即处理,- 80℃保存,解冻后的血浆应尽快加入酸化剂,防止分析物降解。此外,QC样品在分析前在4°C的自动进样器中保存24小时。所获得的准确度也符合可接受标准,表明分析物在进行分析前在自动进样器中是稳定的。


名义浓缩的。(ng / mL) 在4°C自动进样器中保存24小时(n= 3) - 80°C冷冻60天(n= 6) 酸化后在25℃下保存4小时(n= 6) 在25°C下无酸化保存4小时(n= 6)
观察浓缩的。(ng / mL) 准确性(RE %) 观察浓缩的。(ng / mL) 准确性(RE %) 观察浓缩的。(ng / mL) 准确性(RE %) 观察浓缩的。(ng / mL) 准确性(RE %)

萨尔B
15 16.7±0.6 11 15.9±0.8 6 15.2±1.0 1.3 10.1±1.1 −33
3000 3047±85 1.6 2920±63 −2.7 2767±85 −7.8 2580±61 −14
4500 4490±358 −0.2 4438±179 −1.4 4370±290 −2.9 3988±164 −11

亚撒
15 17.0±0.3 13 14.1±0.5 −6 15.9±0.7 6 8.47±0.6 −44
3000 3357±90 12 3117±27 3.9 3260±96 8.7 1762±87 −41
4500 4747±274 5.5 4242±110 −5.7 4470±206 −0.7 2767±179 −39

SA
15 15.9±1.3 6 14.8±1.2 −1.3 16.1±0.9 7.3 18.3±0.5 22
3000 2797±59 −6.8 3138±86 4.6 2892±37 −3.6 3767±78 26
4500 4233±188 −5.9 4635±156 3. 4293±91 −4.6 5738±216 28

RE% =(观察到的平均值)。−名义频率。)/名义频率× 100%。
3.4.临床样本分析

应用该方法测定了16例患者血浆样品中Sal B、ASA和SA的浓度。表格6显示在每个采血时间点计算的平均值。salb和SA的浓度大部分在定量范围内,而ASA的浓度低于LLOQ,这与采血时间点的间隔有关。药代动力学参数见表7。的C马克斯, AUC0-t、AUC0 -∞阿司匹林与丹参酚酸酯联合注射组(A + S组)的测定值均低于阿司匹林组(AP组)或丹参酚酸酯注射组(SV组),说明A + S组的药物暴露程度较低。此外,SA血浆浓度达到所需的时间C马克斯在A + S组和SV组之间存在差异,提示ddi改变了SA的吸收或消除速率。这些观察结果证实阿司匹林和丹酚酸酯注射液之间的ddi影响药代动力学行为。


收集时间 B:好的。(ng / mL) ASA浓缩的。(ng / mL) SA浓缩的。(ng / mL)
SV集团 A + S组 AP组 A + S组 AP组 A + S组

8天 之前 < LLOQ 8.27 < LLOQ < LLOQ 99.8 22.8
9日一天 之前 < LLOQ 7.73 < LLOQ < LLOQ 76.6 24.9
第十天 之前 < LLOQ 12.3 < LLOQ < LLOQ 69.7 18.5
5分钟 NA NA < LLOQ NA 63.1 NA
15分钟 2078 1059 < LLOQ < LLOQ 50.3 18.0
30分钟 1274 653 < LLOQ < LLOQ 51.8 17.3
45分钟 720 436 < LLOQ < LLOQ 48.6 15.5
1 h 471 246 < LLOQ < LLOQ 46.2 18.5
2 h 211 128 < LLOQ 12.4 27.2 375
4 h 64.5 43.3 270 239 1725 2157
8 h 34.0 24.9 22.9 79.2 2229 1740
12小时 15.9 16.3 104 6.05 1191 640
24小时 14.9 9.96 < LLOQ < LLOQ 84.7 57.2

NA表示给药组在给药后5min未采集样本。

参数 萨尔B SA
SV集团(n= 5) A + S组(n= 5) AP组(n= 6) A + S组(n= 5)

T马克斯(h) 1.6±0.1 1.6±0.1 7.3±3.0 5.6±2.2
C马克斯μg / mL) 2.3±1.8 1.1±0.5 3.3±1.1 2.8±1.0
T1/2(h) 4.4±1.5 7.3±5.3 2.6±0.8 2.8±0.8
AUC0-th×μg / mL) 3.5±1.9 1.9±0.8 24±7.5 19±8.9
AUC0 -∞h×μg / mL) 3.6±2.0 2.1±0.9 24±7.3 20±9.0

T 马克斯:最大血药浓度时间点;C 马克斯:最大血药浓度;T 1/2:终末期药物消除半衰期;AUC0-t:零时至最后时间点血浆浓度-时间曲线下面积;和AUC0 -∞:从零时到无限时等离子体浓度-时间曲线下的面积。

4.结论

建立了一种快速、简便、稳定的UPLC-MS-/MS同时定量人血浆中Sal B、ASA和SA的方法并进行了验证。分析物采用液-液萃取法从酸化血浆中提取,C18柱梯度洗脱分离,负离子电喷雾MRM定量。该方法成功应用于16例患者人血浆样品中Sal B、ASA和SA浓度的测定,观察ddi对丹参酚酸注射液与ASA药代动力学的影响。该方法有望应用于本领域的后续研究,以及阿司匹林与含Sal B成分的中药制剂联用的其他临床研究。同时,为同类化合物体内定量分析方法的建立提供参考,进一步辅助中西医结合应用的药代动力学研究。

数据可用性

用于支持本研究结果的研究数据包含在补充资料文件中。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在任何利益冲突。

致谢

作者感谢Editage (http://www.editage.cn)进行英文编辑。国家自然科学基金项目(81603505);中国中医科学院资助项目;zz0908022);国家重点研发项目(2018YFC1706006);国家科技重大专项(2017ZX09304003)。

补充材料

与该报告相关的补充材料包含方法验证的数据,可以在网上找到。补充材料

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