多形性侵袭性小叶癌的临床病理和分子特征

摘要

多形性侵袭性小叶癌(PILC)是侵袭性小叶癌(ILC)的一种独特的形态学和生物学侵袭性变体。我们推测这是由于PILC中PI3K/Akt/mTOR通路的重新激活导致了更高的增殖率和细胞周期激活标志物。我们鉴定了PILC和ILC肿瘤，并通过免疫组织化学(PTEN和pS6K1)和基因表达分析(Nanostring nCounter系统)检测了PI3K/Akt/mTOR通路的激活。与20%的ILCs相比，85%的pilc的增殖指数(Ki67)升高( )．PTEN在所有的pilc中表达都很高，而pS6K1在8/9的pilc中表达高于3/9的ilc ( )．基因表达分析显示，PILCs中细胞周期增殖、细胞增殖、DNA损伤、修复相关基因均有过表达，而PI3K/Akt/mTOR通路基因无差异。pilc是ILC中生物学上独特的一组，临床病理特征表明它们具有更强的临床侵袭性行为。此外，我们的研究结果表明，PI3k/Akt/mTOR通路和细胞周期增殖在大多数肿瘤中被激活。需要进一步的研究来研究这些机制，因为有批准的疗法可能有益于pilc。

1.简介

经典浸润性小叶癌(ILC)是一种公认的浸润性乳腺癌亚型，据报道发病率为10-15% [1］．ILC的主要区别特征之一是免疫组化(IHC)上缺乏E-cadherin表达。一些报道的ILC组织学亚型有实性、肺泡型、混合型、顶分泌型、印戒型、组织细胞型和小管型。多形性侵袭性小叶癌(PILC)是ILC的一种，约占ILC的15% [2，3.］．1982年Dixon等人首次报道了这一现象，他们报道了103个ilc，其中一些ilc在肿瘤细胞簇中具有核多形性[4］．尽管自2003年以来，PILC已被世界卫生组织确认为ILC的一个独特亚型，但PILC的临床病理特征和预后仍不清楚。从组织学上看，pilc具有更多的核轮廓不规则，增加的深红和更频繁的有丝分裂(图1)．PILC的分子分析与ILC相似，因为E-cadherin的表达由于基因的改变而减少/缺失背景16号染色体上的基因[5］．与ILCs相似，它们表达雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR);然而，据报道，pilc获得了进一步的分子改变，如HER2/neu的增加，c-myc的扩增和p53的丢失[3.，6，7］．染色体和基于阵列的比较基因组杂交(aCGH)分析显示PILC的基因组复杂性增加[8］．临床上，他们往往有较高的分级和分期的表现[9］．关于PILC的预后数据是相互矛盾的，一些报告说与ILC相比，PILC的侵袭性更强，预后更差，但另一些报告没有这种差异[9- - - - - -12］．pilc倾向于在组织学上具有更强的侵袭性形态，这表明它们在生物学上也可能与ilc不同。基于组织病理学和临床特征，我们推测PILCs可能具有更高的磷酸肌醇3激酶/Akt/雷帕霉素的哺乳动物(或机械)靶点(PI3K/Akt/mTOR)通路的重新激活发生率，从而导致更高的增殖率和细胞周期标志物。为了验证这一假设，我们在本院进行了一项回顾性肿瘤组织转化研究，比较了PILC和ILC的临床病理和分子特征。为了验证我们的假设，我们提取了临床病理数据，通过免疫组化评估ilc和pilc上抗原Ki67(细胞增殖标志物)的表达。通过量化磷酸酶、紧张素同源物(PTEN)和磷酸化s6激酶1 (p-S6K1)的蛋白表达来评估PI3k/Akt/mTOR通路的激活。PTEN是PI3K通路的负调控因子，其表达的缺失/降低(通过突变或等位基因失衡)激活下游信号。据报道，在超过50%的雌激素受体阳性(ER+)乳腺肿瘤中，PTEN表达的缺失(或减少)与PI3K通路激活有关[13］．由于PI3K通路除了PTEN缺失外，还可以通过其他机制激活，因此我们假设，与PTEN蛋白单独表达相比，pS6K1的评估可能是该通路激活的更好预测因素。S6K1是PI3K/Akt/mTOR通路最具特征的下游靶点之一，其激活受多种mTORC1-和PI3K介导的磷酸化事件调控[14］．

2.材料与方法

亚利桑那大学人体实验机构审查委员会批准了这项回顾性转化研究。从2012年到2014年，我们对我们的病理数据库进行了搜索，以确定pilc和ilc。从手术病理报告和病历中提取临床病理特征。两名研究人员独立审阅病理报告，并提取临床病理资料。从2012年到2014年，我们从我们学术机构的病理档案中确定了19例PILC和126例ILC。最初选择了20例1级经典ilc;然而，免疫组化染色存在技术问题，肿瘤切片没有附着在载玻片上进行进一步分析(可能是由于脂肪含量较高)。此外，大多数切片肿瘤很小，脂肪含量很高，使得免疫组化解释困难。我们重新查看了我们的数据库，并选择了20个具有更高肿瘤大小、分级和细胞数的ilc与pilc进行比较。这样做是为了更好地匹配ILC和PILC样品。 Our intent for this study was to identify and match approximately 20 PILCs and 20 ILCs. Our end result is data from 20 ILCs and 19 PILCs, which is presented here. Upon further attempts to obtain samples for the project (and to stain for PTEN and S6K1), we encountered the technical issues described above regarding tumor fat content. Thus, we utilized 9 PILC and 9 ILC tissue samples to analyze the PTEN and p-S6K1 expression.

2.1.免疫组织化学分析

在9个pilc和14个ilc中发现了福尔马林固定、石蜡包埋的档案肿瘤组织。切片由病理学家复查，以确保足够的样本和质量。常规的苏木精和伊红(H&E)染色对3微米的FFPE块组织切片进行。

对Ki67进行免疫组化(IHC)，使用Ventana Antibody #790-4286(兔一抗)，对PTEN进行免疫组化(IHC)，使用Cell Signaling Technologies #9188(克隆D4.3，兔单克隆抗体)，对p-S6K1进行免疫组化(IHC)，使用Cell Signaling Technologies，丝氨酸235/236 #2211。免疫组化使用Discovery XT自动免疫染色仪(VMSI (Ventana医疗系统)，罗氏集团成员，亚利桑那州图森)。在我们机构，所有新诊断的浸润性乳腺癌都常规检测Ki67表达。分为低水平(≤15%的细胞表达抗体阳性)和高水平(>15%的细胞表达Ki67)。PTEN蛋白低表达定义为肿瘤细胞质中1+染色强度≤10%或2+染色强度<5%(即 )．中度PTEN蛋白表达定义为1+染色强度≥11-50%的细胞或细胞质2+染色强度≥5-25%的细胞(即细胞质长评分为11-50)。PTEN高表达定义为1+细胞中>的50%，2+细胞中>的25%。类似的定量也应用于p-S6K1蛋白表达。对9例PILC和9例ILC肿瘤进行PTEN和p-S6K1免疫组化。

2.2.RNA提取

三个十μ连续未染色的FFPE肿瘤切片被放置在带正电的载玻片上进行RNA分离。然后将这些未染色的组织切片在连续三次浴中孵育2分钟，前15秒温和搅拌:d-柠檬烯(组织学级)，d-柠檬烯和100%乙醇。让载玻片完全干燥，然后在3%甘油(MBG)溶液中再水化。使用无菌刀片刮取载玻片上的组织，收集到1.7 mL微量离心管中。

2.2.1.RNA隔离

RNA分离使用Roche HighPure FFPET RNA分离自旋柱试剂盒(目录#06650775001)，根据制造商的规格从切片上确定的肿瘤中进行。使用NanoDrop 1000 (Thermo Scientific)和任何浓度低于20 ng/的RNA进行定量μ根据制造商的规格，使用RNA清洁和浓缩柱(zyymo Research, Cat #11-325)进行浓缩。

2.2.2.纳米串计数器系统处理

将100 ng纯化的RNA与PanCancer Code Set (Nanostring Technologies)在65°C下杂交过夜。在nCounter Prep Station上进一步纯化杂交探针并将其绑定到光学盒上，最后在nCounter数字分析仪上扫描光学盒。将每个基因的原始计数导入nSolver分析软件，并根据背景基因和管家基因进行归一化，通过评估内置阳性对照来评估总体检测性能。

2.3.基因表达分析

从Nanostring nCounter分析中获得的Log2归一化数据用于分析PILC ( ）及ILC ( )．生物信息学分析采用R统计工具进行。来自Bioconductor的Limma模块 -用统计学进行方差分析，以估计转录本的差异水平。显著的基因改变两组间的变化以≤0.05为值。这提供了一个28个基因的列表。对基因进行聚类，并使用gplots包生成热图(图1-热图显示与PILC亚型相关的基因簇，与ILC亚型表达差异)。进一步对PILC中表达量较大的基因进行相关性分析，寻找更多PILC与ILC之间表达趋势相似的基因。

3.结果

3.1.临床病理特征

数据提取自19例pilc和20例ilc的医疗记录和病理报告。表格1总结组织学资料。所有肿瘤(pilc和ilc) HER2表达均为阴性。在PILC组中，37%的淋巴结转移癌(47%为阴性，16%为未知)，而在ILC组中，70%的淋巴结转移瘤(30%为阴性)。对10个pilc和6个ilc进行21基因复发评分试验(Oncotype Dx)。21基因复发评分法已被临床验证，用于将肿瘤分为低(<18)、中(18-30)和高(≥31)风险组[15］．结果显示，pilc得分较高(中位数23分，范围6-36分)，大多数处于中等或较高范围(8/10)。相比之下，4/6的ilc属于低风险类别(2例处于中等范围，得分为20和22)。

3.2.包含IHC结果

对19个pilc和20个ilc进行了Ki67检测。PILC组Ki67≥15%的肿瘤比例明显增高( ）与ILC组相比1)．9例PILC和9例ILC肿瘤染色检测PTEN和pS6K-1表达。结果显示PTEN在所有PILC和ILC肿瘤中均有高表达(图2）;然而，与3/9 ILC肿瘤相比，8/9 PILC肿瘤中pS6K1较高( ）(图3.)．我们的结果表明，与ilc相比，PI3k/Akt/mTOR通路在大多数pilc中是重新激活的。此外，他们还表明PTEN并不是PI3k/Akt/mTOR通路的关键调节因子，因为它在所有肿瘤中都有高表达。

3.3.基因表达结果

热图(图4)表示基因和样本的聚类。PILC亚型确实表现出参与细胞周期增殖(CDC25C,CDK2)，细胞增殖(HELLS)的基因过表达[15]， DNA损伤与修复(XRCC4, FANCA, FANCB, BRCA2) [16]基因。这些过表达基因与其他基因的相关性分析发现，更多的DNA修复和细胞周期基因在PILC中表达更高(数据未显示)。我们未发现两组PI3K/Akt/mTOR通路相关基因的表达有明显差异(检测该通路201个基因，包括但不限于PTEN、PIK3、mTOR、Akt等;然而，S6K1不在这些基因中)。这些过表达基因与其他基因的相关性分析发现，更多的DNA修复和细胞周期基因在PILC中表达更高(数据未显示)，但与ILC相比无统计学差异。

4.讨论

PILCs是ILCs的一个独特的组织学亚型。与经典的ILCs相比，它们往往具有更高的级别，更多的核多形性，单核和增加的增殖。随着HER2/neu和c-myc过表达以及p53缺失的肿瘤比例的增加，它们似乎也具有分子分化，而这在ilc中并不常见。基于IHC评估，大多数经典ILCs倾向于腔内A亚型(I级，ER+/PR+/ HER2-ve, Ki67低)。然而，pilc往往有更多的腔内B级IHC图像(I-III级，ER+/PR+/-/HER2-/+， Ki67-high)。临床病理特征表明，他们会有更多的临床攻击行为，但文献中的研究结果与预后相矛盾。鉴于其独特的组织学，我们试图进一步评估和描述两组之间可能不同的一些分子特征。我们评估了肿瘤细胞增殖、细胞周期和PI3K/Akt/mTOR通路激活标志物的表达。

PI3K/Akt/mTOR通路的激活与乳腺癌的内分泌和细胞毒性治疗耐药有关，其中大多数发生在激素受体(HR)阳性肿瘤中[16］．有临床前和临床证据支持该途径的激活与hr阳性乳腺肿瘤的内分泌治疗耐药有关[17］．该通路激活的内分泌抵抗可能通过多种机制介导，包括增殖或生存通路的刺激或HRs的下调和丢失。目前已知，PIK3CA在高达40%的ER α阳性肿瘤中被突变激活;PTEN水平以类似比例下降，AKT2(高达5%)和p70S6K(10-20%)在一些乳腺肿瘤中也可能通过扩增过表达[13］．er阳性肿瘤的PI3K催化亚基(P13KCA)突变频率最高;然而，er阳性肿瘤中PIK3CA突变的存在与Akt、pS6K和4EBP1磷酸化的增加无关，这些磷酸化是PI3K通路激活的标记物[13］．此外，这些突变与内分泌治疗的乳腺癌预后较差无关[13，18］．另一方面，PTEN作为PI3K通路的负调控因子，激活下游Akt/mTOR信号通路，可能有助于内分泌抵抗[19］．考登氏综合征是PTEN基因种系突变的结果，易患乳腺癌和其他癌症[20.］．零星的PTEN突变很罕见，但在乳腺癌中有报道[21，22］．更常见的是，PTEN的等位基因不平衡，PTEN蛋白在较高数量的乳腺癌中缺失或减少。PTEN蛋白通常在ER阴性乳腺癌中丢失，在超过50%的ER+乳腺癌中PTEN蛋白减少[19］．在小鼠模型中，PTEN仅轻微下调20%已被证明会增加肿瘤侵袭潜力[23］．除了PTEN缺失外，该途径还可以被其他机制激活(如生长因子信号、突变和肿瘤微环境)。目前，还没有建立标准的生物标志物来检测该途径的激活。据报道，PI3K/Akt激活通路基因标记可用于预测反应，但尚无临床验证用于治疗决策[18］．在我们的研究中，我们评估了PTEN和pS6K的表达作为该途径激活的标记，试图研究蛋白质表达作为该途径的生物标志物。

我们的结果表明，pilc在临床病理上比表型相似的ilc更具侵袭性。他们往往有较高的Ki67和较高的21基因检测复发评分。除预后外，21基因复发评分法也用于临床预测辅助化疗的获益。我们的结果表明化疗可能对pilc有益。这与通常认为ilc不具有化学敏感性的观点相反。尽管该试验检测的pilc数量较少(10)，但只有2个肿瘤处于低范围(<18)。此外，对6个级别较高的ILCs(类似于PILCs)进行了21基因复发评分试验;但大部分(4/6)均处于低位。这些结果表明，在生物学上，pilc可能比ilc更具侵略性。

已知在生物侵袭性肿瘤中被激活的信号通路机制之一是细胞增殖、细胞周期和PI3K/Akt/mTOR通路。我们试图通过免疫组化和RNA表达分析来检测这些通路。

IHC染色和Ki67的比较证实了我们的假设，即与ILCs相比，pilc中有更多的增殖途径被激活。我们还注意到，与ILCs相比，PI3K/Akt/mTOR通路在PILC亚组中被重新激活，这可以通过PILC肿瘤中pS6K1表达的增加来证明。此外，我们发现PTEN不是我们样本集中通路的主要调节因子。其他激活机制似乎在这些肿瘤中发挥作用，需要进一步研究。我们试图通过观察PI3K/Akt/mTOR通路激活因子的基因表达分析来分析激活的其他原因，但无法确定两组之间的显著差异。其中一个主要原因是样本量，与已发表的基因表达分析相比，分析的基因数量(Nanostring nCounter分析中有770个基因)相对较少。此外，重要的是要记住，PILC是ILC的一个亚群，某些基因/途径的重叠是预期的。此外，试图通过分析一个小样本集来找到区别是困难的，并且所有的结果(积极或消极)都必须谨慎地解释。

5.结论

PILCs是ILCs的一种临床和分子特异性亚型。重要的是，临床医生认识到这种亚型，并考虑额外的检测(如21基因复发评分或其他预后/预测分析)，以帮助治疗决策(包括辅助化疗)。鉴于我们和其他研究结果表明，pilc在分子上是不同的，进一步研究这些机制似乎是有必要的。目前，已批准的药物靶向其中一些激活通路(CDK4/6抑制剂和mTOR抑制剂)，鉴于分子机制不同，了解哪些肿瘤可能对此类治疗反应更好，以及这些治疗是否可能在早期(新辅助或辅助治疗的I-III期)对该亚组有益将是有益的。

数据可用性

数据可根据要求提供(用于免疫组化分析的纳米串数据和计分表)。请联系通讯作者(Pavani Chalasani, MD)。

信息披露

资助者在研究的设计中没有任何作用;分析:在数据的收集、分析或解释中;写作:在手稿的写作中;或者决定是否公布结果。

利益冲突

詹妮弗·西格和里图·潘迪声明没有利益冲突。Pavani Chalasani报告了来自辉瑞的研究资金，诺华、Heron Therapeutics、Nanostring Technologies、Amgen、拜耳、阿斯利康、Daiichi Sanko、Asthenex和Zentalis的顾问委员会参与。

致谢

我们要感谢罗伯特·利文斯顿医学博士(已故)对Pavani Chalasani医学博士的构想和指导做出的贡献。这项研究由“比以往更好”基金和国家癌症研究所奖(资助号P30 CA023074)资助。

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