舒尼替尼联合Th1细胞因子增强人乳腺癌细胞凋亡并抑制HER-2小鼠模型中的肿瘤生长^pos乳腺癌

摘要

尽管免疫疗法在癌症治疗中取得了显著进展，但它们通常必须与标准治疗方式结合，包括细胞毒性药物，以实现最大的临床效益。随着免疫疗法的进一步发展和完善，需要付出相当大的努力来确定联合疗法，以最大限度地提高临床反应，同时减少标准疗法令人不快的、有时危及生命的副作用。在过去的二十年中，有证据表明Th1细胞因子可以在保护性抗肿瘤免疫中发挥核心作用，并且Th1细胞因子的组合可以诱导癌细胞的衰老和凋亡。为了探索靶向药物与Th1极化疫苗联合使用的可能性，我们进行了一项研究，以检查Th1细胞因子与相对广谱受体酪氨酸激酶拮抗剂舒尼替尼联合使用的影响。我们发现，当五个表型不同的人类乳腺癌细胞系接受舒尼替尼+重组Th1细胞因子IFN-的治疗时γ和肿瘤坏死因子-α在许多参数中观察到协同效应，包括凋亡细胞死亡的不同方面。有趣的是，舒尼替尼被发现对T细胞分泌IFN-的能力有深刻的抑制作用γ这表明在体内使用这种药物可能会阻碍强大的Th1反应。然而，在HER-2小鼠模型中，这种抑制被规避了^pos通过提供重组干扰素- γ来实现比任何一种药物都更有效的联合治疗。

1.简介

对her - 2^pos乳腺癌，当CD4时观察到较好的临床结果^pos淋巴细胞浸润显示th1型细胞的特征[1］．有趣的是，基于dc的新佐剂疫苗可选择性地促进强抗her -2 Th1免疫的发展，由CD4 T细胞分泌的选择细胞因子如IFN-定义γ和肿瘤坏死因子-α，可诱导肿瘤周围CD4细胞聚集^pos(辅助T细胞)和CD20^pos(B细胞)HER-2部位的淋巴细胞^pos早期乳腺癌(导管原位癌，DCIS) [2，3.］．在这些研究中，大约30%的人接种了HER-2疫苗^pos呃^负的受试者在手术时具有完全的病理反应(定义为没有可检测到的剩余疾病)。对ER^pos只有5%的人显示出pCR。体外研究表明Th1细胞因子可诱导不同HER-2细胞的衰老和凋亡^pos和her - 2^负的乳癌线[4，5］．

有趣的是，一些急诊室^pos乳腺癌细胞系对Th1细胞因子诱导的细胞凋亡表现出耐药性，但当抗雌激素药物与细胞因子联合使用时，细胞凋亡水平与其ER水平一致^负的同行(6］．这些研究似乎表明，生长因子信号传导的药理学抑制(在这种情况下，通过ER受体)可以使先前抵抗细胞对细胞因子诱导的细胞死亡敏感。这一发现建议进行临床试验，在HER-2疫苗接种的同时提供抗雌激素药物^pos/嗯^pos科目。在这里，我们发现抗雌激素治疗加上疫苗接种可以使ER的pCR率相等^posER患者^负的约30%的疫苗接受者[6］．

这些研究表明，药物抑制生长因子信号转导与疫苗诱导的Th1免疫生成相结合可以提高疫苗应答率。他们还建议，Th1细胞因子可以作为Th1免疫的体外替代品，用于筛选联合抗肿瘤作用的候选药物，以选择有前景的药物用于临床试验。

与雌激素受体不同，大多数生长因子受体是酪氨酸激酶受体。为了验证抑制生长因子信号通路是改善Th1细胞因子介导的抗肿瘤免疫的良好整体策略这一假设，我们研究了广谱RTK拮抗剂舒尼替尼与Th1细胞因子联合使用，共同增强对乳腺癌细胞杀伤活性的能力。苹果酸Sunitinib是一种口服小分子抑制剂，可干扰多种rtk的活性，包括VEGFR, KIT, FLT3和PDGFR。在体外研究表明，舒尼替尼抑制依赖于VEGF、PDGF和干细胞因子(SCF)的人脐静脉内皮细胞的生长。舒尼替尼在人肿瘤异种移植模型中显示出时间和剂量依赖性的抗肿瘤活性[7]表示冒号[8]、神经胶质瘤、黑色素瘤及乳房[7癌细胞系。它也已在乳腺癌患者的临床试验中进行了测试，并已与曲妥珠单抗等其他药物联合使用[9]，多西他赛[10]和卡培他滨[11］．尽管该药对乳腺癌没有显示出足够的活性，不足以作为这种恶性肿瘤的标准治疗方案的一部分，但它目前的适应症确实包括胃肠间质瘤、晚期肾细胞癌和一些胰腺神经内分泌肿瘤。

在本研究中，我们发现，舒尼替尼和Th1细胞因子的组合可以大大增强对5种代表各种不同表型的人类乳腺癌细胞系的活性，这表明干扰受体酪氨酸激酶与Th1免疫效应因子的整体策略可能是开发改进免疫治疗的有用方法。一个潜在的警告是，舒尼替尼也有深度抑制IFN-的倾向γT淋巴细胞分泌。这种通用方法的成功开发可能涉及使用更选择性的RTK拮抗剂，这些拮抗剂不会强烈影响T细胞功能。或者，重组T细胞效应细胞因子与药物一起使用，这样即使T细胞在药物压力下无法生物合成这些分子，也可以达到治疗水平。

2.材料与方法

2.1.试剂和细胞培养

舒尼替尼(Selleckchem, Houston, TX)溶解于二甲基亚砜(DMSO;西格玛-奥尔德里奇，圣路易斯，密苏里州)和稀释在细胞培养基或PBS体外使用。人乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468、SKBR-3、MCF-7和HCC-1419来自美国类型培养收藏(ATCC, Manassas, VA)。MDA-MB-231、HCC-1419和MDA-MB-468细胞系在RPMI培养基(Sigma-Aldrich)中培养。MCF-7细胞系在EMEM培养基(ATCC)中培养。SKBR-3细胞在McCoy’s 5A培养基(Gibo;马里兰州洛克维尔)。在所有培养基中，添加10%胎牛血清(Atlantic Biologicals, Miami, FL)、1% Pen/strep (Gibco)、1%丙酮酸钠、1% NEAA和1%谷氨酰胺(Gibco)，并在37℃和5% CO条件下培养细胞₂湿润的气氛。

2.2.阿拉玛蓝测定法

乳腺癌细胞系被镀在96孔群集板中，密度从5到 每孔的细胞数取决于单个细胞系的生长特性。初始培养12小时后，用Th1细胞因子(TNF-)处理细胞α和干扰素-γ；PeproTech, Rocky Hill, NJ各5 ng/mL)和舒尼替尼(10μM)，然后再培养72小时，此时20μ每孔加入0.15 mg/mL的PBS (Sigma-Aldrich)中再青嘌呤盐。在额外培养6-7小时后，使用Bio-Tek(型号EL312E)微板阅读器使用Gen5分析软件在630 nm处测量培养上清液的光密度。

2.3.台盼蓝活力染色

乳腺癌细胞以 在12孔培养皿中孵育过夜。第二天，用细胞因子(每个TNF- 5 ng/mL)处理细胞α和干扰素-γ)，舒尼替尼(10μM)，两者兼而有之，或者放任不管。在进一步培养72小时后，刮取细胞，在30小时后加入0.002%台盆蓝染料(Lonza, Walkersville, MD)μL体积的细胞悬液。采用642 nm激光的FlowSight流式细胞仪(Amnis/Millipore)评估染料摄取，并使用IDEAS version 6.2软件进行分析，如前所述[12，13］．

2.4.膜联蛋白V/碘化丙啶染色

对乳腺癌细胞系进行处理和培养，如台盼蓝研究所述。在治疗后72小时，通过刮刀收集细胞，并用Annexin V染色缓冲液清洗细胞(BioLegend, San Diego, CA)。然后用荧光色素标记的膜联蛋白V (3μL添加到40μL总体积)(BioLegend)在4°C下放置15分钟，然后加入碘化丙啶(PI) (1μg/mL) (Sigma-Aldrich)，然后立即使用FlowSight成像流式细胞仪(使用642 nm和488 nm激光)进行分析，并运行IDEAS版本6.2软件，如前所述[12，13］．

2.5.线粒体细胞色素C相对水平的测定

对SKBR-3细胞系进行台盼蓝研究。治疗72小时后，在胰蛋白酶(Gibco)的帮助下收集细胞，并根据Christensen等人的方法对线粒体内细胞色素C进行染色。[14］．简单地说，细胞在100年重新悬浮μL冰冷渗透缓冲液(100mm KCL, 100μg/mL洋地黄苷(PBS)。孵育5分钟，100μ在渗透细胞中加入L多聚甲醛(PBS中4%)。样品在4°C下以500 RPM离心5分钟，然后去除上清液。然后将细胞与4%多聚甲醛在室温下孵育20分钟。然后每200个细胞清洗三次μL PBS (700 RPM, 4°C, 5分钟)，在200重新悬浮μL阻断缓冲液(PBS中0.05%皂素和3% BSA)，然后rt孵育1小时。加入apc偶联的抗细胞色素C (1:20 0) (BioLegend)， 4℃孵育过夜。第二天，每200间牢房要洗三次μL PBS (700 RPM, 4°C, 5分钟)。加入抗小鼠二抗(1:20 0)(BioLegend)，稀释于100μL阻断缓冲液，rt中孵育1小时。每200次清洗细胞3次μL PBS (700 RPM, 4°C, 5分钟)。细胞色素C的表达用642 nm的FlowSight成像细胞仪和IDEAS软件套件版本6.2进行分析。

2.6.HER-2表面表达的评估

对SKBR-3细胞进行台盼蓝研究。在治疗后72小时，通过刮刀收集细胞，在PBS中洗涤，并在1ml FACS缓冲液(PBS+1%FBS+0.01%叠氮化钠)中重新悬浮。然后在4°C下加入apc偶联抗HER-2抗体(BioLegend, San Diego, CA) 15分钟，在FlowSight成像细胞仪上运行IDEAS 6.2分析软件，使用642 nm激发激光流式细胞仪分析细胞HER-2表达。

2.7.Western Blot检测PARP状态

SKBR-3细胞在 细胞/mL在培养皿中10 mL的总体积。第二天，用5 ng/mL的Th1细胞因子处理细胞，10μ舒尼替尼，或者两者都有。孵育72小时后，收集样品。收集的细胞以800转/分离心5分钟，去除上清液并丢弃。用100溶解细胞颗粒μL的RIPA裂解缓冲液(50 mM Tris-base, 150 mM NaCl, 1% Triton-X 100, 0.5%脱氧胆酸钠，0.1%十二烷基硫酸钠)，添加Pierce蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Thermo Scientific, Rockford, IL)和PhosStop磷酸酶抑制剂鸡尾酒(Roche, Mannheim, Germany)。这些提取物在4°C下以20,000 RPM离心20分钟。收集上清液，在-80°C保存，然后进行分析。

使用BCA蛋白测定法生成标准曲线，以估计每种提取物中的蛋白质含量。提取物稀释在5倍还原加载缓冲液，短暂涡旋，并煮沸5分钟。从每个样品中提取30微克总蛋白，装入4-15%的Mini Protean TGX凝胶(Bio-Rad, Hercules, CA)，并在160伏下分离40分钟。凝胶中的蛋白质在100伏特下电转移到PVDF膜(Bio-Rad)上1小时。膜用TBS-T (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1%Tween 20, pH为7.6)每隔5分钟清洗3次。用5%的牛奶堵塞膜30分钟，用一抗:1:10 00 PARP抗兔(Cell Signaling, Denver, MA)和1:10 00抗兔β-肌动蛋白抗小鼠(GenScript, Piscataway, NJ)。用TBS-T缓冲液清洗膜，加入适当的二次酶标抗体，室温孵育1小时。然后用TBS-T每隔5分钟清洗膜3次。该膜由SuperSignal West Pico化学发光衬底(Thermo Scientific)开发。化学发光检测使用富士LAS 3000检测系统(R&D Systems, Minneapolis, MN)进行。用ImageJ分析定量条带强度和折叠变化。

2.8.T细胞功能测定

对于异基因mlr，通过白细胞分离从健康志愿者身上获得人类外周血单个核细胞，并在提供知情书面同意后，根据《赫尔辛基宣言》的原则和NIH对人类受试者的指导方针，通过克利夫兰诊所机构审查委员会(08-957)和肯特州立大学(18-421)批准的方案用于实验。血液制品分离成CD14^pos外周血单核细胞和淋巴细胞富集部分经逆流离心洗脱如前所述[15并在液氮中低温保存直到使用。树突状细胞来源于单核细胞，这些单核细胞在巨噬细胞SFM培养基(Gibco)中解冻并孵育过夜，并补充GM-CSF (50 ng/mL) (PeproTech)和IL-4 (1000 U) (PeproTech)。第二天早上，1000u的IFN-γ(PeproTech)加入培养，2小时后LPS (50 ng/mL;添加了InvivoGen, San Diego, CA)。让细胞再孵育4小时，然后收集、清洗，并在添加5%人血清(龙沙)的RPMI中重悬。异基因淋巴细胞富集部分解冻，并在相同的培养基中培养。将细胞以20:1的比例(淋巴细胞:树突状细胞)结合，并以每孔1ml的总容积被装入48孔群集培养皿中。异基因共培养用舒尼替尼处理(10μM)或不加处理进行控制。72小时后，收集上清液并分析IFN-γ根据制造商的协议(BD生物科学，圣地亚哥，加州)，通过ELISA。

对于ELISPOT，从正常健康供者和IFN-获得的冷冻保存的未分离的总外周血单个核细胞(pmcs)γELISPOT试剂盒购自Cellular Technology Limited (C.T.L, Shaker Heights, OH)。根据制造商的建议，PBMC以每孔200000个细胞的密度(存在或不存在10个细胞)进行解冻和镀μM舒尼替尼)与cef - I类肽池“Plus”(常见病毒肽的混合物;10μL/well, C.T.L)或破伤风毒素(2μg/嗯，Sigma)作为召回抗原或单独在培养基中孵育(对照)。第二天，取出细胞并注射一些IFN-γ按试剂盒说明书评估斑点形成细胞。在免疫斑点分析仪(ct)上读取所有钢板。

2.9.治疗模式

雌性Balb/c小鼠，6-8周龄，购自查尔斯河实验室(Wilmington, MA)。它们是在肯特州立大学坎宁安大厅动物设施的特定无病原体环境中按照美国国立卫生研究院的指导方针饲养的。实验由肯特州立大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)根据协议481 GK-19-05批准。来自Balb-neuT大鼠HER-2 (neu)转基因小鼠的TUBO乳腺癌细胞(Rovero et al. 2000)在添加10%的RPMI中培养 胎牛血清;亚特兰大生物公司，花分支，佐治亚州)，100单位/毫升青霉素和100μg/mL硫酸链霉素(BioWhittaker, Walkersville, MD)， 2 mmol/L谷氨酰胺(BioWhittaker)， 1 mmol/L丙酮酸钠(BioWhittaker)， 1%非必需氨基酸(BioWhittaker)。用细胞分离缓冲液(Cell Dissociation Buffer, Gibco, Grand Island, NY)收集细胞，用PBS洗涤2次，然后在PBS中重悬接种。

小鼠分为4组，每组6只。第0天，所有小鼠均在乳房脂肪垫区皮下接种 TUBO细胞100μL的PBS。在第7天，当肿瘤可以触摸到时，小鼠要么不治疗(对照组)，要么通过i.p.注射舒尼替尼(1 mg/剂量)，IFN-γ(10μG)，或两种处理同时进行。个别实验的给药时间表已列明。每2-3天用卡尺测量肿瘤大小(沿最长轴的长度乘以垂直宽度)。

2.10.统计方法

统计学分析采用单因素方差分析(ANOVA);小于0.05被认为是显著的。采用Tukey 's honest显著性差异检验，分析两组间差异是否有统计学意义。采用SigmaPlot 12.5软件(Systat software Inc.， San Jose, CA)进行单因素方差分析。

3.结果

3.1.Th1细胞因子和舒尼替尼共同抑制乳腺癌细胞代谢

五种人乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7、SKBR-3和HCC-1419分别用Th1细胞因子(IFN-γ和肿瘤坏死因子-α)、舒尼替尼，或两者兼有。Alamar Blue染料的加入被代谢活性细胞减少(诱导颜色变化)，用于确定单独和联合处理对细胞的影响(较低的光密度对应较高的代谢活性)。Th1细胞因子和舒尼替尼联合治疗对所有5个被测细胞系的代谢抑制程度均大于单独治疗(图1； )．等酚分析(补充图1)显示药物和细胞因子之间的协同作用。

3.2.Th1细胞因子和舒尼替尼的结合使细胞死亡最大化

Alamar Blue检测细胞代谢活性的抑制。然而，这并不能证明任何观察到的代谢抑制是实际细胞死亡的结果。为确认细胞死亡，进行台盼蓝染色。乳腺癌细胞株暴露于Th1细胞因子、舒尼替尼或两者均暴露72小时，或不进行治疗(No Rx)。显微镜检查细胞显示大量细胞死亡;所有治疗组均显示较少的完整细胞，高水平的亚细胞碎片，剩余的存活细胞表现出改变的形态特征(未显示)。受到这两种治疗的细胞似乎受到的影响最大。

当收集剩余的细胞并用台盼蓝染色时，这些视觉观察得到了证实，台盼蓝从活细胞中排除，但保留在死亡细胞中，传递出强烈的荧光信号，可以通过流式细胞仪进行评估。对于五种被测细胞系，每个治疗组的细胞荧光流式细胞术数据以直方图形式显示(图2(一个))．在分析过程中，建立一个区域来区分低染色(活的)和高染色(死的)细胞，允许所有治疗组的细胞死亡百分比分配。例如，在一项代表性实验MDA-MB-468中，联合治疗的细胞死亡率最高:未治疗(17.7%)，Th1细胞因子(37.4%)，舒尼替尼(52.3%)，两种治疗(91.1%)。MDA-MB-231显示了类似的结果:未治疗(11.9%)、Th1细胞因子(27%)、舒尼替尼(29.6%)和两者(95.1%)。对于SKBR-3细胞，未治疗组死亡8.4%，Th1细胞因子组死亡43.1%，舒尼替尼组死亡51.8%，两种治疗组死亡78.3%。HCC-1419细胞死亡率从未治疗的5%，Th1细胞因子20.8%，舒尼替尼56.8%，两种治疗组合87.9%。在雌激素受体阳性细胞系中也发现了类似的结果，未经治疗的MCF-7死亡31.2%，Th1细胞因子死亡56.7%，舒尼替尼死亡59.4%，两种治疗组合中死亡86.4%。

我们还通过整体荧光强度(平均通道荧光指数)的差异来分析流式细胞术数据。每个细胞系至少三个独立实验的合成数据如图所示2 (b)．对于所有测试的乳腺癌细胞系，Th1细胞因子和舒尼替尼的组合导致荧光染料的摄取显著增加( ）比单独的任何一种治疗都要好。综上所述，这些数据表明，与单独治疗相比，Th1细胞因子联合舒尼替尼显著增加细胞死亡。

3.3.Th1细胞因子联合舒尼替尼增强凋亡相关细胞标志物的表达

为了确定观察到的细胞死亡是否通过凋亡机制发生，研究了一些与凋亡相关的标记物。首先，用FITC-Annexin V/碘化丙啶(PI)染色处理后的乳腺癌细胞株，流式细胞术分析(图3.)．在细胞凋亡晚期，两种染色剂同时呈阳性。对于MDA-MB-468细胞系，膜联蛋白V和PI均染色明亮的细胞比例如下:未处理的12.6%，Th1细胞因子28%，舒尼替尼46.6%，两种治疗均81.3%。对于MDA-MB-231细胞系，这些值分别为未经处理的9.45%，Th1细胞因子25.4%，舒尼替尼36.4%，两种治疗组合均为51.4%。对于SKBR-3细胞系，这些值分别为17.8%(未处理)、34.7% (Th1细胞因子)、47.3%(舒尼替尼)和58.4%(两种处理)。对于HCC-1419细胞系，这些值分别为17%(未治疗)、22% (Th1细胞因子)、22.2%(舒尼替尼)和34.8%(两种治疗)。同样，雌激素阳性细胞系MCF-7占33%(未治疗)，51.4% (Th1细胞因子)，39.4%(舒尼替尼)，77.1%(两种治疗)。这些结果表明，与单独治疗相比，Th1细胞因子和舒尼替尼双重治疗乳腺癌细胞系可增强凋亡细胞死亡。

接下来，我们将注意力转向代表性细胞系SKBR-3的线粒体细胞色素C的损失。收集处理过的SKBR-3，在含有KCl和洋地黄苷的溶液中渗透，并用抗细胞色素C抗体染色。渗透性溶液破坏了质膜的完整性，使线粒体释放的细胞色素C从细胞中滤出。然而，缓冲液中的洋地黄苷不会损害线粒体膜，允许细胞色素C在这些细胞器中保留和染色。这种差异只允许测量与线粒体相关的细胞色素C [14］．对于SKBR-3细胞系，各处理组的细胞荧光流式细胞术数据以直方图形式显示(图4(一))．在本分析中，定义了一个区域来区分低染色(细胞色素C缺失)和高染色(细胞色素C保留在线粒体中)的细胞，从而确定保留线粒体相关细胞色素C的细胞百分比。例如，在SKBR-3的一个代表性实验中，两种处理的细胞色素C染色最低:无治疗(83.9%)、Th1细胞因子(83.8%)、舒尼替尼(23.8%)和两种治疗联合(4%)(图)4(一))．在其他试验中也观察到类似的结果。

最后，我们试图通过Western blot分析处理后的SKBR-3细胞中检测其下游靶点PARP的水平，间接评估刽子手caspase 3的活性。尽管单一药物似乎对PARP没有什么影响，但在实验试验中，舒尼替尼和Th1细胞因子联合使用似乎显示出PARP蛋白丢失的趋势(图4 (b))．

3.4.与单一治疗相比，Th1细胞因子联合舒尼替尼可降低表面HER-2表达

先前的研究表明，Th1细胞因子治疗可导致某些细胞系HER-2表达水平降低[4］．为了确定加入舒尼替尼是否会使HER-2损失最大化，我们检测了SKBR-3细胞系的表面HER-2水平。72小时后，收集治疗后的细胞，用HER-2抗体染色，流式细胞仪分析，单次代表性实验结果以直方图形式显示(图2)5(一个))，以及由相对荧光强度分析的3个独立实验的复合数据(图5 (b))．直方图数据显示HER-2表达被抑制，当SKBR-3细胞同时暴露于Th1细胞因子和舒尼替尼时，HER-2表达被最大限度地抑制。来自三个独立实验的平均通道荧光分析证实，双重处理所见的差异显著于单一处理(图5 (b)； )．

3.5.舒尼替尼显著抑制IFN-γT淋巴细胞分泌

由于舒尼替尼是一种相对广谱的受体酪氨酸激酶抑制剂，我们担心该药可能会干扰T细胞功能。因此，我们进行了IFN-γELISPOT检测对常见病毒肽抗原池的回忆反应(图6(一)而且6 (b)(左图)以及破伤风类毒素(图6(一)而且6 (b)，右面板)。我们还进行了异基因MLRs，使用激活的人DCs作为刺激剂，来自mhc不匹配个体的淋巴细胞富集的白细胞馏分作为响应细胞(图6 (c))．这些共培养是在存在或不存在相同浓度的舒尼替尼的情况下进行的，这些浓度用于先前对癌细胞系的研究。从两个样本ELISPOT孔中可以看出(图6(一))，并对每个抗原集的3个不同供体进行复合分析(图6 (b))，舒尼替尼的存在严重抑制IFN-γ生产。同样地，在刺激细胞dc和反应细胞T细胞的8种独特的异体配对中，IFN-几乎完全被抑制γ观察到舒尼替尼的产生(图6 (c))．

3.6.舒尼替尼联合重组干扰素γ抑制HER-2原位小鼠模型肿瘤生长^pos乳腺癌

因为我们证明了舒尼替尼抑制IFN-的能力γ结论是，将该药与积极的免疫治疗方案(如接种疫苗)联合使用可能具有挑战性，因为它可能会干扰关键的T细胞功能。因此，我们试图设计一种潜在的可翻译疗法，通过提供重组IFN-来绕过对抗原特异性T细胞的需要γ还有毒品。由于本研究之前的实验使用了两种Th1细胞因子(TNF-α加干扰素-γ)联合舒尼替尼，我们想首先测试IFN-γ仅能显著增强舒尼替尼的疗效。因此，在小鼠重组IFN-存在或不存在的情况下，用增加浓度的舒尼替尼培养小鼠TUBO乳腺癌细胞γ(图7(一)，左面板)。对Alamar Blue在最佳浓度为20时的测定结果进行统计分析μg/mL舒尼替尼在双重治疗组与单一治疗组相比，显著增强了代谢活性的抑制(图7(一)(右图)，表明TNF-α对增强舒尼替尼的活性不是绝对必要的。

因此，将TUBO乳腺癌细胞植入小鼠右乳脂肪垫，分为4个治疗组(每组6只)。当肿瘤可触及时(第7天)，开始使用IFN-治疗γ(10μG /剂量)，舒尼替尼(1 mg/剂量)，同时或交替使用这两种药物作为对照组。使用卡尺定期测量肿瘤，第32天处死小鼠，仔细切除肿瘤，切除多余组织，并称重。生长动力学显示IFN-有一定的抑制作用γ单用舒尼替尼可中度抑制生长，双治疗组几乎完全抑制进行性生长(图7 (b)，左面板)。每组的平均肿瘤体积显示相同的模式，统计分析显示，唯一与未治疗对照组显著不同的治疗是双重治疗组(IFN-γ加上舒尼替, ）;单次处理与对照组无显著差异(图7 (b)，右侧面板)。

4.讨论

Th1细胞因子IFN-γ和肿瘤坏死因子-α已在各种癌细胞系中诱导凋亡和衰老[4，5，16]同时抑制HER-2和HER-3等多种生长因子受体的表达[4］．类似地，舒尼替尼抑制多种rtk的活性[17］．因此，我们预计Th1细胞因子与舒尼替尼联合使用可以协同作用，抢夺癌细胞多种重要的生长和生存信号，同时提供促凋亡信号，从而增强乳腺癌细胞的死亡。在这些研究中，我们检查了HER-2^pos/嗯^pos(MCF-7)、her - 2^pos/嗯^负的(SKBR-3和HCC-1419)和三阴性(MDA-MB-468和MDA-MB-231)细胞株。在所有细胞系中，舒尼替尼和Th1细胞因子的组合有效地抑制了代谢活性(图1)和诱导细胞死亡(图2)，通过明显的凋亡机制(图3.而且4)．我们进一步检测了SKBR-3细胞系中生长因子受体HER-2的表达水平，发现舒尼替尼和Th1细胞因子联合使用可显著抑制表面表达( )．

在这些研究中，我们还遇到了一个最初意想不到的困难，因为药物舒尼tinib似乎具有足够持久的荧光特性，即使在清洗处理后，收获的细胞，干扰了我们常用的许多荧光分析，这些荧光分析依赖于488 nm激光激发和一些通道的检测，如荧光色素FITC和TMRE染料。后者是我们常规用于测量线粒体膜极化(在凋亡细胞死亡过程中通常会丢失的特性)。然而，在回顾最近的文献时，我们发现这种舒尼替尼荧光现象实际上在以前就被观察到过[18］．在某些情况下，我们可以通过替代荧光染料来解决这一限制。例如，我们将fitc标记的Annexin V与APC共轭物交换，APC共轭物被642 nm激光激发，并在远离舒尼tinib发射光谱的通道中检测到。然而，对于TMRE，没有替代品，因此当使用舒尼替尼时，我们不能进行线粒体膜极化检测。

然而，我们确实检查了与细胞凋亡相关的线粒体功能的另一个方面。凋亡细胞死亡的标志之一是线粒体中细胞色素C的丢失[14］．为了避免药物干扰的问题，我们使用合适的荧光标记抗体，用流式细胞仪检测SKBR-3细胞系的细胞色素C水平。正如预期的那样，在Th1细胞因子和舒尼替尼处理的细胞中，细胞色素C最低(图4)．然而，我们有些惊讶地观察到，单独的Th1细胞因子治疗并没有导致细胞色素C水平的可观察到的下降，因为根据这些研究中检查的所有其他标准，这种治疗显示了中度细胞死亡的证据。最重要的是TNF-α， Th1细胞因子之一，已知可直接与参与启动外部凋亡通路的受体结合[19］．肿瘤坏死因子-α与TNF超家族受体结合，与受体相关的适配器蛋白，如TRADD(肿瘤坏死因子受体1型相关死亡结构域蛋白)和FADD (fas相关死亡结构域蛋白)[20.］．这种相互作用导致死亡诱导信号复合物的形成，该信号复合物切割procaspase 8，导致Bid(促凋亡信号)的激活，已知这会导致线粒体释放细胞色素C。然而，尽管单独使用Th1细胞因子在诱导细胞色素C损失方面存在意想不到的弱点，但当与舒尼替尼联合使用时，细胞色素C损失比单独使用药物显著增加。

因为每个恶性肿瘤都是独特的，有自己的一组突变和失调的基因，大多数已建立的癌细胞系可以预期在不同的治疗方法下表现有所不同;尽管如此，我们发现舒尼替尼在一系列表型不同的细胞系(包括激素受体阳性、her -2阳性和三阴性细胞)中与Th1细胞因子联合使用时效果非常好。这可能部分是由于舒尼替尼对抗多种酪氨酸激酶活性的能力普遍缺乏选择性。尽管舒尼替尼的大部分活性被归因于恶性细胞本身以外的靶标(例如，肿瘤血管系统[21]和骨髓源性抑制细胞[22])，亦观察到直接影响。例如，在肾细胞癌中，舒尼替尼已被证明可以抑制STAT3的激活[23]，一种被认为对促进增殖、抗凋亡和肿瘤发生至关重要的核转录因子[24］．有趣的是,干扰素,γ已知能促进STAT1的激活，而STAT1通过抑制细胞增殖和促进细胞凋亡来对抗STAT3 [25］．似乎Th1细胞因子和舒尼替尼的协同作用涉及同时激活STAT1和抑制STAT3。

尽管这些体外研究非常鼓舞人心，但将此类药物与th1极化疫苗联合使用存在必须考虑的潜在局限性，因为受体酪氨酸激酶抑制剂可能抑制的癌细胞中的许多信号通路在免疫系统细胞中也至关重要。因此，免疫系统功能可能会以意想不到的方式发生改变。例如，其他人的研究表明，舒尼替尼治疗肾细胞癌患者与T细胞产生IFN-的频率增加有关γ(即Th1细胞)和产生IL-4的T细胞(即Th2细胞)的减少，这扭转了这种疾病状态下不利的Th1/Th2比率特征。这种转变对于产生有效的抗肿瘤免疫反应至关重要[26］．在这些肾癌细胞中，T调节细胞(有利于肿瘤生长)升高，而舒尼替尼治疗可以降低。此外，接受舒尼替尼治疗的肾细胞癌患者骨髓源性抑制细胞减少[22]，也被认为能促进肿瘤存活和生长。另一方面，接受舒尼替尼治疗的转移性透明细胞肾癌患者CD3水平整体下降^pos和CD4^posT细胞[27］．尽管这些先前的研究提出了混合的改变，在某些情况下可能会促进抗肿瘤免疫，而在其他情况下可能会削弱抗肿瘤免疫，但应该注意的是，所有这些都是在体内提供一个疗程的药物后在免疫系统细胞中观察到的变化。他们实际上并没有测量在药物直接影响下的细胞活性。相比之下，相对较少的研究观察到存在酪氨酸激酶抑制剂药物时T细胞的功能。最近的一项研究[28比较了几种酪氨酸激酶抑制剂药物对T细胞的抑制活性，发现阿西替尼相对于舒尼替尼没有抑制作用。我们自己的体外研究似乎表明，舒尼替尼在与重组细胞因子联合促进肿瘤细胞凋亡的浓度相同的情况下，也显示出几乎可以消融抗原特异性IFN-的强大能力γ在同种异体MLR和特定的蛋白质回忆抗原(图6)．这一观察结果提出了一些有趣的问题，不仅是关于舒尼替尼的局限性，而且关于其他已开发的抗癌药物的局限性。当它们存在于被治疗对象体内时，它们可能会严重抑制特定的免疫功能，并且实际上可能会破坏依赖完整免疫功能的大部分潜在有效性。

关于舒尼替尼抗癌和免疫调节特性之间复杂关系的最后一个例子是由Jaini和同事在小鼠模型中证明的[29］．在这里，携带4T1乳腺癌细胞的小鼠被接种重组肿瘤抗原，乳清蛋白，在CFA佐剂中。实验治疗还包括给药舒尼替尼。有趣的是，当舒尼替尼与靶向免疫治疗疫苗联合使用时，它影响了抗原提呈细胞的启动(CD11b减少)^pos和CD11c^pos)，导致疫苗接种失败[29］．另一方面，当在疫苗接种的启动阶段后给予舒尼替尼时，疫苗介导的免疫反应增加[29］．这些研究表明，药物和免疫治疗的相对时机也可能是一个重要问题。然而，在该系统中，Th1细胞因子作为抗肿瘤免疫的主要效应因子的作用尚不清楚。如果是这样的话，很难想象在肿瘤床上，通过浸润淋巴细胞分泌Th1细胞因子和药物治疗浓度同时实现，疫苗和药物的管理是多么惊人。

在我们目前的研究中，我们没有试图错开主动免疫治疗和舒尼替尼的给药，而是试图通过直接提供重组IFN-来规避潜在的药物对免疫反应的干扰γ与舒尼替尼同时使用。我们省略了TNF-α完全正确，因为尽管这种细胞因子已经在孤立肢体灌注的免疫治疗中取得了一些成功[30.]，已知的毒性限制了它的系统使用[31，32]，因此，我们不考虑全身给药TNF-α实际上是可翻译的。干扰素-γ，具有更好的全身安全性，目前已获批准并用于临床治疗慢性肉芽肿性疾病[33］．我们发现，与未处理的对照组相比，只有联合而不是单一药物治疗才能在统计学上显著地抑制肿瘤生长，这表明这种方法是增强舒尼替尼活性的临床可转化策略，也许还有其他小分子靶向药物。由于舒尼替尼目前已被fda批准用于治疗肾细胞癌，我们相信重组IFN-γ与这种药物联合使用是值得的，其目标是提高反应率，同时降低额外毒性的风险。

有趣的是，通过将靶向药物方案与IFN-结合来利用其效果的想法γ是一种我们已经在临床试验中测试的方法(NCT03112590)在局部高级HER-2的设置下^pos乳腺癌。对于这些受试者，护理标准通常包括两种抗her -2抗体(曲妥珠单抗和帕妥珠单抗)加上紫杉醇(如紫杉醇)以及细胞毒性药物(如卡铂)的组合。本试验替代IFN-γ卡铂。虽然尚未完成，但中期试验结果似乎很有希望，与接受标准治疗的历史对照组相比，受试者的病理完全缓解率几乎是其两倍，即使在消除其最难耐受的成分(即卡铂)的情况下。

本文中提出的研究证明了一种多受体蛋白酪氨酸激酶的靶向小分子抑制剂可以在体外和体内与Th1细胞因子联合作用，在HER-2小鼠模型中强烈增强不同表型乳腺癌细胞系的凋亡并抑制肿瘤生长^pos乳腺癌。这表明，某些靶向药物在理论上可以与有前景的抗癌疫苗结合，这些疫苗主要通过诱导强th1主导的免疫机制起作用，并有望实现加性或协同效应。然而，他们也暴露了一个警告，即这些药物可能对免疫系统细胞有强烈的抑制作用，这可能会使药物和细胞因子之间的协同作用变得没有意义，至少在某些情况下，可以通过使用重组细胞因子来代替疫苗或其他细胞疗法来避免这种协同作用。这一总体策略的进一步发展，理想情况下将包括识别更多的选择性药物，这些药物将与Th1细胞因子类似地合作，以增强肿瘤细胞的杀伤，同时避免强烈抑制T细胞活性。

数据可用性

用于支持这项研究结果的数据包含在文章中。

利益冲突

作者宣称他们没有利益冲突。

补充材料

补充图1:用于等油分分析。（补充材料）

参考文献

1. M. L. Disis和S. E. Stanton，“乳腺癌的免疫治疗:简介”乳房《中国科学院学报》，2018年第37卷，页196-199。视图:出版商的网站|谷歌学者
2. B. Czerniecki, G. Koski, U. Koldovsky等人，“利用阶段性白细胞介素-12爆发分泌的树突状细胞靶向HER-2/neu在早期乳腺癌发展中的作用。”癌症研究，第67卷，no。4, pp. 1842-1852, 2007。视图:出版商的网站|谷歌学者
3. A. Sharma, U. Koldovsky, S. Xu等，“HER-2脉冲树突状细胞疫苗可消除HER-2表达并影响导管原位癌。”癌症，第118卷，no。17, pp. 4354-4362, 2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
4. P. Namjoshi, L. Showalter, B. Czerniecki和G. Koski，“t辅助性1型细胞因子诱导小鼠和人乳腺癌细胞中her家族肿瘤驱动因子表达的凋亡和丢失”Oncotarget，第10卷，no。第57条，第6006条，2016。视图:谷歌学者
5. C. Rosemblit, J. Datta, L. Lowenfeld等人，“在HER2+和三阴性乳腺癌中，抑癌因子和CD4(+) Th1细胞因子通过Stat1激活共同诱导肿瘤衰老和凋亡:联合免疫和靶向治疗的意义。”Oncotarget，第9卷，no。33, pp. 23058-23077, 2018。视图:出版商的网站|谷歌学者
6. L. Lowenfeld, S. Zaheer, C. Oechsle等人，“在抗HER2树突状细胞疫苗接种中加入抗雌激素治疗可改善ER(pos)/HER2(pos)早期乳腺癌患者的区域淋巴结免疫应答和病理完全缓解率。”Oncoimmunology，第6卷，no。9、文章e1207032, 2017。视图:出版商的网站|谷歌学者
7. D. B. Mendel, a . D. Laird, X. Xin等人，“一种针对血管内皮生长因子和血小板衍生生长因子受体的新型酪氨酸激酶抑制剂SU11248的体内抗肿瘤活性:药代动力学/药效学关系的确定，”临床癌症研究，第9卷，no。1, pp. 327-337, 2003。视图:谷歌学者
8. a . M. Morimoto, N. Tan, K. West等人，“多靶向酪氨酸激酶抑制剂SU11248治疗后人类结肠异种移植瘤的基因表达谱，”致癌基因，第23卷，no。8, pp. 1618-1626, 2004。视图:出版商的网站|谷歌学者
9. T. Bachelot, J. a . Garcia-Saenz, S. Verma等人，“苏尼替尼联合曲妥珠单抗治疗晚期乳腺癌:来自II期研究的活性和安全性结果，”BMC癌症，第14卷，no。1，页166,2014。视图:出版商的网站|谷歌学者
10. J. Bergh, G. Mariani, F. Cardoso等人，“舒尼替尼和多西他赛在晚期乳腺癌妇女中的临床和药代动力学研究”乳房，第21卷，no。4, pp. 507-513, 2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
11. J. P. Crown, V. Dieras, E. Staroslawska等人，“舒尼替尼联合卡培他滨与卡培他滨单药治疗前转移性乳腺癌患者的III期试验”临床肿瘤学杂志，第31卷，no。23, pp. 2870-2878, 2013。视图:谷歌学者
12. L. E. Showalter, C. Oechsle, N. Ghimirey, C. Steele, B. J. Czerniecki和G. K. Koski，“Th1细胞因子使表达her的乳腺癌细胞对拉帕替尼敏感”《公共科学图书馆•综合》，第14卷，no。1、第e0210209条，2019。视图:出版商的网站|谷歌学者
13. L. Showalter, B. J. Czerniecki和G. K. Koski，“Th1细胞因子与药理学Akt抑制联合在体外增强乳腺癌细胞凋亡并抑制体内肿瘤生长。”Oncotarget，第11卷，no。30, pp. 2873-2888, 2020。视图:出版商的网站|谷歌学者
14. M. E. Christensen, E. S. Jansen, W. Sanchez，和N. J. Waterhouse，“基于流式细胞术的测量凋亡相关线粒体膜去极化和细胞色素c释放的实验”，方法第61卷，no。2, pp. 138 - 145,2013。视图:出版商的网站|谷歌学者
15. B. J. Czerniecki, C. Carter, L. Rivoltini等人，“钙离子载体处理的外周血单核细胞和树突状细胞迅速显示激活树突状细胞的特征。”免疫学杂志，第159卷，no。8，页3823-3837,1997。视图:谷歌学者
16. H. H. Braumüller，“t -辅助1细胞细胞因子导致癌症衰老，”自然，第494卷，no。74，页361-365,2013。视图:出版商的网站|谷歌学者
17. G. S. Papaetis和K. N. Syrigos，“Sunitinib:分子癌症治疗时代的多靶向受体酪氨酸激酶抑制剂”BioDrugs，第23卷，no。6, pp. 377-389, 2009。视图:出版商的网站|谷歌学者
18. P. Nowak-Sliwinska, A. Weiss, J. R. van Beijnum等人，“血管静压治疗后溶酶体隔离舒尼替尼的光激活导致血管阻塞并增强肿瘤生长抑制。”细胞死亡与疾病，第6卷，no。2，第e1641条，2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
19. S. Balachandran, C. N. Kim, W. C. Yeh, T. W. Mak, K. Bhalla，和G. N. Barber，“dsrna依赖蛋白激酶PKR的激活，通过fadd介导的死亡信号诱导细胞凋亡。”EMBO期刊，第17卷，no。23, pp. 6888-6902, 1998。视图:出版商的网站|谷歌学者
20. C. H. Yuan, M. Filippova, P. Duerksen-Hughes，“人类乳头瘤病毒(HPV)对凋亡通路的调节:机制和治疗的意义，”病毒，第4卷，no。12, pp. 3831-3850, 2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
21. A. J. Schueneman, E. Himmelfarb, L. Geng等人，“SU11248维持治疗可防止小鼠肿瘤模型分次照射后肿瘤再生，”癌症研究，第63卷，no。14, pp. 4009-4016, 2003。视图:谷歌学者
22. J. S. Ko, A. H. Zea, B. I. Rini等人，“舒尼替尼介导肾细胞癌患者骨髓来源抑制细胞积聚的逆转，”临床癌症研究，第15卷，no。6, pp. 2148-2157, 2009。视图:出版商的网站|谷歌学者
23. H. Xin, C. Zhang, A. Herrmann, Y. Du, R. Figlin和H. Yu，“舒尼替尼抑制Stat3诱导肾细胞癌肿瘤细胞凋亡并减少免疫抑制细胞，”癌症研究，第69卷，no。6, pp. 2506-2513, 2009。视图:出版商的网站|谷歌学者
24. S. Grivennikov, E. Karin, J. Terzic等人，“IL-6和Stat3是肠上皮细胞存活和结肠炎相关癌症发展所必需的。”癌症细胞，第15卷，no。2, pp. 103-113, 2009。视图:出版商的网站|谷歌学者
25. L. Avalle, S. Pensa, G. Regis, F. Novelli和V. Poli，“肿瘤发生中的STAT1和STAT3:平衡问题”Jakstat，第1卷，no。2, pp. 65-72, 2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
26. J. H. Finke, B. Rini, J. Ireland等，“舒尼替尼逆转1型免疫抑制，减少肾细胞癌患者的t调节细胞，”临床癌症研究，第14卷，no。20, pp. 6674-6682, 2008。视图:出版商的网站|谷歌学者
27. T. Powles, S. Chowdhury, M. Bower等人，“舒尼替尼对转移性透明细胞肾癌免疫亚群的影响”，Urologia国际明爱会，第86卷，no。1, pp. 53-59, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
28. F. Stehle, K. Schulz, C. Fahldieck等人，“与其他酪氨酸激酶抑制剂相比，阿西替尼的免疫抑制特性降低，”生物化学杂志，第288卷，没有。23, pp. 16334-16347, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学者
29. R. Jaini, P. Rayman, P. A. Cohen, J. H. Finke和V. K. Tuohy，“舒尼替尼与抗肿瘤疫苗联合使用抑制T细胞启动，需要仔细安排以实现有效的免疫治疗。”国际癌症杂志，第134卷，no。7, pp. 1695-1705, 2014。视图:出版商的网站|谷歌学者
30. J. O. Kahn, L. D. Kaplan, P. a . Volberding等人，“艾滋病相关卡波西肉瘤的病灶内重组肿瘤坏死因子- α:一项随机双盲试验，”获得性免疫缺陷综合征杂志，第2卷，no。3，第217-223页，1989。视图:谷歌学者
31. K. Kimura, T. Taguchi, I. Urushizaki等，“重组人肿瘤坏死因子的一期研究”，癌症化疗和药理学，第20卷，no。3, pp. 223-229, 1987。视图:出版商的网站|谷歌学者
32. F. M. Muggia, T. D. Brown, P. J. Goodman等，“重组肿瘤坏死因子在晚期胰腺癌和胃癌II期研究中凝血病变发生率高，”抗癌药物，第3卷，no。3，第211-218页，1992年。视图:出版商的网站|谷歌学者
33. A. Ahlin, G. Larfars, G. Elinder, J. Palmblad和H. Gyllenhammar，“γ干扰素治疗慢性肉芽肿病患者与多形核中性粒细胞增加一氧化氮的产生有关。”临床和诊断实验室免疫学“，，第6卷，no。3，页420-424,1999。视图:谷歌学者

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