细胞外基质染色组织清除技术在肺泡尺度肺纤维化病灶的三维成像

摘要

特发性肺纤维化是一种以细胞外基质蛋白(包括胶原蛋白和弹性蛋白)积累为特征的进行性慢性肺病。纤维化肺细胞外基质的成像对于评估其病理状况以及肺病灶药物分布及其治疗效果具有重要意义。在本研究中，我们比较了细胞外基质染色技术和光学组织清除技术，以建立肺纤维化病灶的三维成像方法。采用肺内注射博莱霉素制备小鼠肺纤维化模型。用荧光标记的番茄凝集素、I型胶原抗体和Col-F(胶原蛋白和弹性蛋白的荧光探针)来比较完整的纤维化肺中纤维化病灶的成像。这些肺样本是用清肺器清除的^T2tissue-clearing技术。用激光共聚焦显微镜对清理后的肺进行二维观察，并与肺组织切片图像进行比较。同时，将连续的二维图像重建为三维图像。荧光标记的番茄凝集素不能显示纤维化病灶在清除的纤维化肺。虽然通过免疫荧光染色可以看到纤维化肺中的I型胶原，但I型胶原直到40岁才清晰可见μM来自肺表面。colf染色使胶原蛋白和弹性蛋白可见深度达120μM在清除的肺组织中。此外，我们使用colf对清除的纤维化肺的三维细胞外基质进行了可视化，图像提供了比免疫荧光染色更好的可视化。这些结果表明，Clear^T2组织清除治疗结合colf染色是一种简单、快速的完整纤维化肺纤维化病灶成像技术。本研究为各种器官细胞外基质相关疾病的影像学研究提供了重要信息。

1.简介

特发性肺纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)是一种进行性的慢性肺部疾病，其特征是肺成纤维细胞和肌成纤维细胞过度合成，导致包括胶原蛋白和弹性蛋白在内的细胞外基质蛋白积累[1，2］．这种组织学特征阻碍肺泡在吸气时打开，呼气时收缩，导致与健康相关的生活质量差，伴有呼吸困难和低生存率[3.，4］．抗纤维化药物如尼达尼和吡非尼酮用于治疗IPF;然而，这些药物是低效的，并有各种不利影响。为了开发一种新的IPF治疗方法，必须准确评估人类患者和啮齿动物实验模型的肺纤维化程度。实验动物离体肺组织细胞外基质(包括胶原)的三维成像将为评估病理状况、肺病灶药物分布及其治疗效果提供有价值的工具。

全身三维成像技术，包括磁共振成像(MRI)， x射线计算机断层扫描，和正电子发射断层扫描，已在几个临床前动物研究中用于分析纤维化肺[5- - - - - -7］．尽管这些成像技术能够鉴别肺纤维化，但它们的分辨率较低(毫米级)，而且不可能直接对肺纤维化灶中的胶原蛋白等元素进行成像。相比之下，使用染色的纤维化病灶组织薄片进行显微评估仅限于几微米的厚度和二维成像。由于切片制备过程中损伤了牙槽结构，组织切片成像在技术上既不完整也不准确。因此，发展高分辨率显示完整肺纤维化灶细胞外基质的直接成像技术是必要的。

我们之前曾报道过Clear的用处^T2荧光标记组织清除处理Lycopersicon esculentum凝集素(番茄凝集素)用于肺泡尺度完整健康肺的3D成像[8］．因为荧光标记的番茄凝集素可以染色许多肺细胞，包括I型肺泡上皮细胞[9]时，可以看到健康肺被肺泡上皮覆盖的一般肺泡结构。然而，在IPF发展的第一阶段，肺泡上皮是不可逆的瘢痕[10］．因此，需要在清除的肺组织中直接靶向纤维化病灶的染色技术。在这项研究中，我们描述了二维和三维成像技术在完整的纤维化肺纤维化病灶使用Clear^T2组织清除技术和胶原染色方法，包括免疫染色和作为胶原蛋白和弹性蛋白低分子荧光探针的Col-F(植酸斯的明和荧光素的结合物)[11］．

2.材料和方法

2.1.材料和动物

氯酸博莱霉素购自日本东京佳乐公司。甲酰胺购自日本大阪富士和子纯化学品有限公司。聚乙二醇(8 kDa)购自Sigma Aldrich公司(St. Louis, MO, USA)。DyLight 488共轭番茄凝集素购自Vector Laboratories公司(Burlingame, CA, USA)。Col-F购自ImmunoChemistry Technologies LLC (Bloomington, MN, USA)。5周龄雄性ICR小鼠，体重26-28 g，购自日本SLC(日本静冈县)。实验动物中心批准的动物实验规程(编号;H29-001)，符合北海道药科大学《实验动物护理和使用指导原则》。

2.2.博莱霉素致肺纤维化模型小鼠

使用液体微喷雾器®(模型IA-1C;宾夕法尼亚世纪公司，费城，宾夕法尼亚州，美国)在戊巴比妥麻醉下的小鼠。给药14 d后，取小鼠作肺纤维化模型进行后续实验。通过肺组织切片Masson三色染色和肺组织羟脯氨酸定量证实肺纤维化，如既往报道[12，13］．

2.3.冷冻肺组织切片

冷冻活检在麻醉下通过腹腔注射酒石酸布托法诺(5 mg/kg)和戊巴比妥钠(50 mg/kg)进行，如前所述[14］．系列8μm厚的冷冻切片是用低温恒温器制备的，并直接安装在玻璃载玻片上(松南贸易公司，大阪，日本)。

2.4.肺组织切片染色

采用马松三色染色技术对肺组织切片进行染色，评价肺纤维化的组织学特征。

I型胶原免疫组化染色，PBS冲洗2次，5min。用BLOXALL内源性过氧化物酶、碱性磷酸酶封闭溶液®(Vector Laboratories)和山羊血清(Vector Laboratories)阻断后，肺组织切片用兔抗I型胶原多克隆抗体(Abcam plc, Cambridge, UK;目录编号:ab34710;1:20 0稀释)室温30分钟。用生物素化抗兔IgG二抗(Vector Laboratories;目录编号:ba - 1000;无稀释)室温下30分钟。切片在室温下用亲和素-生物素过氧化物酶复合物(Vector Laboratories)处理30分钟。染色用3,3进行 -二氨基联苯胺四盐酸盐(Vector Laboratories)，切片用梅尔氏苏木精(Mayer’s hematoxylin)复染。在每个染色步骤之间，所有切片在室温下用PBS彻底冲洗5分钟。

用荧光标记的番茄凝集素染色，肺切片在PBS中冲洗三次，5min，然后用DyLight 488偶联番茄凝集素处理(5μg/mL)室温保存1小时。为了用colf染色，切片在PBS中冲洗三次，5min，然后用colf (15μg/mL)室温保存1小时。

2.5.小鼠肺标本的制备及组织清除处理

肺标本用荧光标记的番茄凝集素、免疫荧光染色和Col-F染色，并用Clear清除^T2组织清除技术规程[15- - - - - -17)(图1)．对于肺纤维化病灶的三维成像，采用激光共聚焦显微镜(LSM 700;Zeiss, Oberkochen，德国)配备了一个Plan-Apochromat 10×/0.45M27 (Zeiss)物镜(激发:488 nm激光;发射滤波器:550 nm短通滤波器;二色分束器:493 nm)。

2.6.图像分析

利用ImageJ软件1.53c (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)对肺组织切片的Masson’s三色染色图像和清除肺组织的Col-F染色图像进行定量分析[18］．在Masson三色染色图像中，蓝色表示细胞外基质定位，并被分离和量化为每个观察区域的蓝色强度。在colf染色图像中，荧光信号被量化为每个观察区域的强度。

2.7.统计分析

使用Student’s进行统计分析 -测试和SPSS软件版本27 (IBM公司，阿蒙克，纽约，美国)。差异被认为具有统计学意义 ．

3.结果

3.1.纤维化肺中的胶原蛋白堆积

博莱霉素致肺纤维化小鼠冰冻肺组织切片的Masson三色染色和I型胶原免疫染色如图2．用博莱霉素治疗14天后，观察到肺泡纤维化灶内I型胶原聚集。

3.2.纤维化肺的组织清除能力

清除后纤维化肺的透射图像^T2组织清除处理如图所示3.．清除后的对照组和博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠肺下均可见网格线^T2治疗。如前所述[15),明确^T2组织清除治疗增加了肺样本的大小。

3.3.荧光标记番茄凝集素染色

冰冻的肺组织切片和完整的肺组织清除后的番茄凝集素染色图像如图4．在肺切片中，对照肺的肺泡壁周围可见到番茄凝集素的荧光，而纤维化肺的纤维化灶上未见番茄凝集素的荧光4(一))．在完整的清肺组织中，二维观察到对照肺的一般肺泡结构，与肺组织切片中观察到的结构相似(图4 (d))， 3D可视化是可能的(图4 (b))．相比之下，在纤维化肺中，完整的清除肺组织的2D和3D图像不同4 (b)而且4 (d))，取自肺组织切片(图4(一))．

3.4.清肺I型胶原蛋白免疫染色

I型胶原蛋白免疫荧光染色的肺图像^T2处理方式如图所示5．尽管在对照组和纤维化清除肺中都能看到I型胶原蛋白的2D和3D图像，但这些肺中的I型胶原蛋白只有在深度仅为40时才能清楚地看到μm。

3.5.肺清除后细胞外基质colf染色

图中为肺组织切片及完整清肺组织的colf染色图像6．在肺切片中，纤维化肺的纤维化灶可见colf荧光(图6(一))．在完整的清肺组织中，纤维肺中colf的荧光呈2D形式，与肺切片中观察到的荧光相似(图6 (b))．colf染色的胶原蛋白和弹性蛋白可见深度为120μm在清除的肺组织中(图6 (c))，表示比免疫荧光染色获得的深度大3倍(图6 (b))．在对照组和纤维化清除肺中都可以看到I型胶原的3D可视化(图1)6 (d))，可见性比免疫荧光染色更清晰(图5 (c))．清除的纤维化肺组织中各深度的Col-F荧光强度明显高于对照肺(约2倍)7)．这种关系与作为肺纤维化指标的肺内羟脯氨酸浓度和Masson三色染色图像定量分析的结果相似。

4.讨论

在这项研究中，我们开发了二维和三维成像技术，利用组织清除治疗来显示肺纤维化病灶内沉积的细胞外基质。在其他肺部疾病，包括肺癌和慢性阻塞性肺疾病，也观察到肺泡内的细胞外基质积聚[19，20.］．因此,明确^T2这项技术可能有助于清除这些疾病患者的肺组织。几种组织清除技术，如CUBIC, CLARITY和BABB，已经被开发用于肺组织[21- - - - - -23］．明确的^T2该技术具有中等的组织清除能力，操作时间短(7小时)。此外，由于该技术不需要有机溶剂和表面活性剂，因此可以保持肺泡结构而不引起脱落[24］．这些组织清除剂的优点被认为有助于观察药物在肺中的分布[8］．

尽管我们之前开发了利用Clear观察健康小鼠肺泡结构的成像技术^T2方法及静脉注射荧光标记番茄凝集素[15]，使用这些技术无法观察到肺纤维化小鼠的纤维化灶。由于番茄凝集素与许多上皮细胞和内皮细胞类型结合，静脉注射番茄凝集素可用于血管成像[25］．然而，番茄凝集素也可以通过检测番茄凝集素从容器渗漏到间隙来评估血管通透性[26］．IPF患者和博莱霉素诱导肺纤维化动物的肺血管通透性变化[27，28］．因此，我们认为静脉注射番茄凝集素可使博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠的肺间质浸润并染色。因此，我们认为番茄凝集素染色后的肺切片图像与清肺图像存在差异。番茄凝集素不结合纤维化病灶的成分，包括肺成纤维细胞和胶原蛋白。可以预见，番茄凝集素不适合用于肺纤维化组织中纤维化病灶的成像。

与我们的研究结果相反，Decroix等人使用Clear成功地对肌肉组织进行了深度3D成像^T2免疫染色技术[16］．然而，作为免疫染色方法的Clear^T2治疗需要Triton X-100，一种表面活性剂，它的作用可能会诱导肺泡表面活性剂元素在肺中的释放。此外，使用表面活性剂进行组织清除处理不适合几种用于血管染色和药物载体标记的亲脂性荧光探针，如DiI [8］．

以前曾报道过几种用于胶原染色的荧光探针，如单链胶原模拟肽[29]， CNA35用荧光染料Oregon Green 488标记[30.和胶原杂交肽[31］．然而，这些探针具有中到高分子量。因此，它可能需要更长的处理时间和添加表面活性剂，这对观察清除的肺组织造成了重大问题，这可能是肺内胶原蛋白荧光染色所必需的。colf是一种低分子量的荧光探针，以非共价的方式与胶原蛋白和弹性蛋白结合[11］．因此，我们认为colf很容易渗透到纤维化肺组织和特异染色的胶原。由于该技术需要较短的处理时间(<1 h)，且不需要表面活性剂，因此不认为肺组织会释放肺泡表面活性剂元素。因此，该技术不仅可以通过colf染色显示纤维化病灶，还可以通过其他荧光标记技术和给药后肺内分布药物显示肺泡表面活性元素。此外，由于Col-F用于其他组织切片染色[11),明确^T2colf染色可促进完整肝、肾纤维化组织的2D和3D显示。细胞外基质的产生也发生在肿瘤细胞内及其周围[20.]及阻断抗肿瘤药物的输送[32］．因此，该技术将有助于观察肿瘤细胞周围由细胞外基质构成的屏障。

colo - f最初被报导[11用荧光标记的胶原蛋白和弹性蛋白在新鲜切除的组织中作为探针。只有当该组织中的细胞是活的时，Col-F才能标记这些细胞外基质蛋白，因为活细胞不包括Col-F。在本研究中，即使在固定后的肺组织中，colf的荧光图像也显示了与Masson三色染色图像上观察到的纤维化灶相似的部分。这一结果表明，colf与Clear的结合^T2组织清除治疗对纤维组织染色有一定的帮助。然而，colf同时标记纤维化肺中的胶原蛋白和弹性蛋白。清除后的肺组织可见特异性染色点。虽然不能确定这些点的身份，但这些染色剂可能是用colf染色的活组织，用于固定肺组织的原始方案。

5.结论

我们开发了一个简单和快速的技术成像的纤维化病灶在完整的纤维化肺使用Clear^T2colf染色组织清除处理。这项技术是有用的成像胶原相关疾病在许多器官。

数据可用性

支持这项研究结果的数据包括在文章中。

的利益冲突

作者声明，本文的发表不存在利益冲突。

致谢

本研究由日本北海道科学大学、日本科学促进会JSPS KAKENHI(资助编号JP17H02178、JP18K06603和JP18K12066)和日本北方科学技术发展中心(札幌，日本)资助的资助编号H29ST-ST-36。

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