一种新型生物工程创面产品api®的微环境影响:初步研究在体外炎症标志物和生长因子分泌的分析

摘要

客观的．一种新型生物工程创面制品的初步生物活性评价(api®，SweetBio, Inc, Memphis, TN, USA)，一种合成明胶，麦卢卡蜂蜜和羟基磷灰石，与在体外保护、平衡和改善伤口微环境的适应症。方法．生物工程创面产物(BWP)在人体细胞上的生物活性在体外通过评估巨噬细胞表达的基质金属蛋白酶- (MMP-)相关蛋白和成纤维细胞中生长因子的分泌进行评估。细胞未经处理培养，用脂多糖(LPS)刺激，或直接在BWP上接种24小时。对BWP额外的72小时时间点进行了评估，以确定BWP在24小时时是否保持其活性。测定细胞培养上清液以定量分泌蛋白水平。结果．BWP上的巨噬细胞分泌的MMP-9检测不到( )，同时检测到MMP的组织抑制剂(TIMP-1)。与对照组相比，这降低了BWP上的巨噬细胞分泌的MMP-9/TIMP-1的总体比例。此外，观察促愈合生长因子的分泌，如碱性成纤维细胞生长因子(FGFb)和血管内皮生长因子(VEGF)。结论．初步结果在体外评估结果表明，BWP有可能通过减少巨噬细胞分泌的MMP-9/TIMP-1比率来逐步平衡伤口微环境，并通过触发成纤维细胞释放生长因子来促进先前停滞的慢性伤口的愈合。

1.简介

糖尿病已成为全球流行病，全世界约有4.22亿人受其影响[1- - - - - -3.］．这些患者一生中患糖尿病足溃疡(DFU)的可能性高达25% [4］．DFUs是一种慢性伤口，由于正常伤口愈合级联的破坏，很难愈合[5］．与非愈合性DFUs相关的后果是严重的。据估计，在全球范围内，每30秒就有一条腿被截肢，而这些截肢中85%是由DFUs造成的[6］．此外，截肢并发症在截肢后1年、3年和5年分别导致13-40%、35-65%和39-80%的死亡率[4］．其他慢性和促炎症性伤口，如静脉性腿溃疡、坏疽性脓皮病和钙化症，也给患者和更广泛的医疗保健系统带来了重大的生物、心理和经济负担[7- - - - - -10］．因此，需要先进的治疗方法来恢复正常的伤口愈合级联，使慢性和促炎症性伤口朝着愈合的方向发展，这不仅对肢体保存至关重要，而且对挽救生命也至关重要。

要了解如何治愈慢性(和促炎)伤口，关键是要了解正常伤口愈合级联，它在哪里破裂，以及炎症细胞因子和生长因子的适当平衡的重要性。正常的伤口愈合级联可描述为止血、炎症、增殖和重建四个连续阶段[11］．这种级联的破坏与不可愈合的慢性伤口的发展有关[5］．基质金属蛋白酶(MMPs)和基质金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMPs)是正常伤口愈合的重要生物标志物，因为它们在细胞外基质降解中发挥重要作用[12- - - - - -14］．然而，MMPs水平升高和TIMPs水平降低与炎症停滞或延长有关，从而导致慢性伤口或伤口衰竭[12，14，15］．具体而言，多项临床研究分析了慢性和急性伤口的液体，并得出结论，MMP-9/TIMP-1比率增加与伤口愈合不良有关[13，16- - - - - -19］．这种蛋白水解失衡会导致基质成分、生长因子和其他成功完成愈合级联所必需的蛋白质的降解[12，19］．一旦创面微环境恢复平衡，愈合可能会从炎症期进展到增殖和重塑期，在此期间生长因子在信号细胞增殖、迁移和分化中发挥关键作用。这些生长因子，如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和表皮生长因子(EGF)，很容易出现在急性伤口环境中，但已被证明在慢性伤口微环境中不受调控[20.，21］．因此，治疗慢性创伤的新治疗策略，如DFUs，可以通过降低MMPs浓度、增加TIMPs水平和增加生长因子水平，来逐步平衡和改善微环境[12，20.］．

初步研究在这篇稿件中提出了进行评估在体外一种新型生物工程创面产品的生物活性(api®，SweetBio, Inc.， Memphis, TN, USA)。具体来说，通过分析巨噬细胞的炎症细胞因子和成纤维细胞的生长因子的分泌，评估生物工程创面产品(BWP)在平衡和改善慢性创面微环境方面的贡献在体外细胞培养完成。BWP是一种固体生物可降解片材，通过明胶(一种高度纯化的胶原蛋白衍生物)、麦卢卡蜂蜜和羟基磷灰石(HAp)的高级合成制成(图)1)．每一种材料都有关于伤口愈合的良好生物相容性和生物活性记录。明胶是一种天然的蛋白质基质，有利于细胞粘附、迁移和增殖，也有利于伤口肉芽和上皮形成[22- - - - - -25］．众所周知，明胶还可以通过作为牺牲底物吸引和缓冲慢性伤口微环境中MMP-2和MMP-9水平的升高[26］．麦卢卡蜂蜜因其抗菌和抗炎的特性而广为人知，但它也被证明可以激活生长因子，增加成纤维细胞的活性，抑制MMP-2和MMP-9的表达[27，28］．HAp是一种无机矿物，可以结合周围环境中的蛋白质、离子和其他分子，从而引发细胞的粘附、增殖和分化[29，30.］．具体来说，羟基磷灰石已被证明可以通过重新上皮化、基质形成、血管生成以及巨噬细胞和成纤维细胞的招募促进伤口愈合[30.- - - - - -34］．考虑到这三种生物材料的生物活性的多样性，我们假设BWP会引起相似的结果在体外对人体细胞的影响与向停滞的伤口微环境灌输平衡并使伤口朝着愈合的方向发展一致。

2.材料和方法

2.1.巨噬细胞的培养和播种

人类单核细胞(THP-1, ATCC TIB-202, Manassas, VA, USA)基于文献中发现的程序，使用已建立的iFyber协议将其分化为巨噬细胞[35］．简单地说，单核细胞在含有25 nM phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA, Calbiochem, San Diego, CA, USA)的RPMI培养基中培养48小时，然后在不含PMA的培养基中休息24小时。休息期结束后，用无菌的1X磷酸缓冲盐水(PBS)清洗一次，然后用0.05%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸溶液(EDTA, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)将细胞从组织培养瓶中分离出来。PBS由96 mM NaCl (Avantor, Radnor, PA, USA)， 1.9 mM KCl (Merck KGaA, Darmstadt, Germany)， 7.1 mM Na组成₂HPO₄(Fisher Chemical, Fair Lawn, NJ, USA)和1.2 mM KH₂阿宝₄(MP Biomedicals, Solon, OH, USA)。

实验在12孔的组织培养板(分析板)中进行，对以下处理进行了三次评估(n= 3)在24小时时间点:用BWP孵育，用脂多糖(LPS, Sigma-Aldrich, THP-1细胞的标准阳性对照)刺激，不治疗(阴性对照)。对BWP额外的72小时时间点进行了评估，以确定BWP在24小时时是否保持其活性。为了制备检测板，用1ml抗粘附漂洗溶液(STEMCELL Technologies, Cambridge, MA, USA)冲洗将要获得BWP的孔，这样细胞就不会无意中附着到组织培养塑料上。然后取出漂洗液，用1ml无菌1X PBS冲洗一次孔。无菌切割BWP的圆形片，同时使用直径18毫米的无菌中空钢冲床干燥。样品被放置在先前制备的检测板孔中，用2ml无菌盐水(0.9% NaCl, Avantor)水化2分钟，在此期间，它们膨胀(如预期的)覆盖整个孔底。仔细抽吸水合液，孔内立即注入浓度为3.55 × 10的巨噬细胞⁵细胞/孔(每孔2毫升细胞悬浮液)。阳性对照孔接种相同数量的细胞，刺激1μg/mL LPS 24 h [36，37］．阴性对照(未处理)也接种相同数量的细胞，但只有RPMI培养基存在于这些孔中。将平板置于37°C, 5% CO的加湿培养箱中₂所需的时间点。在时间点得出结论时，从每个孔中回收细胞培养基(上清)，通过离心去除细胞碎片，将上清沥干并保存在−20℃。

2.2.成纤维细胞的培养和播种

原代人真皮成纤维细胞(成人(HDFa)， ATCC PCS-201-012, Manassas, VA, USA)在添加无血清成纤维细胞生长试剂盒(ATCC)的成纤维细胞基础培养基中培养。在实验中，将成纤维细胞在12孔组织培养板(实验板)中接种24小时，并进行以下处理，每3个重复(n= 3): BWP孵育，LPS刺激(阳性对照)，不治疗(阴性对照)。对BWP额外的72小时时间点进行了评估，以确定BWP在24小时时是否保持其活性。文献中有一些迹象表明LPS刺激可能对成纤维细胞分泌生长因子产生潜在影响，即肿瘤坏死因子α水平的潜在增加，尽管实验设置与这里描述的不同[38］．然而，这种对照治疗被用来保持与巨噬细胞阳性对照治疗的一致性。

如上一节所述，制备分析板和BWP;然而，在本试验中使用了BWP直径16 mm的圆形片，以减少孔内的材料膨胀。成纤维细胞的种子密度为2.5 × 10⁵细胞/孔(每孔2毫升细胞悬浮液)。培养皿在37°C, 5% CO下培养₂寻找合适的时间点。在指定的时间点，从每个孔中收集细胞培养基(上清)，通过离心去除细胞碎片，上清alias，保存在- 20°C。

2.3.细胞因子阵列筛选试验

巨噬细胞上清按照制造商的协议，通过细胞因子阵列试验(Human XL细胞因子阵列Kit ARY022B R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)分析。每个样品的一个膜在室温摇动平台上阻塞1小时。然后将膜与细胞培养上清液(0.5 mL)在4℃的摇杆上孵育过夜。用1x洗涤缓冲液(由制造商提供)洗涤三次，然后在摇动平台上室温下与检测抗体孵育1小时。用1倍缓冲液洗涤三次后，加入链霉亲和素- hrp，并在室温下摇膜30分钟。膜再次洗涤三次，然后用化学试剂混合物孵育一分钟。BioMax Light放射自显影膜(Carestream, 1788207)在以下时间点暴露于膜上:1、2、4、8和10分钟。通过多次曝光来获得最佳的信号强度。然后立即使用GBX显影剂和固定剂(Carestream, 5158613)冲洗胶片。使用试剂盒中提供的透明覆盖层识别阳性信号，然后使用透明扫描仪扫描薄膜，然后使用ImageJ(美国贝塞斯达MD国家卫生研究院)确定相对于检测对照(参考点)的像素强度，进行分析。 An initial run with 0.5 mL supernatant was performed to assess the level of biomarkers. If the signal intensities were low, a repeat run with increased supernatant was performed to obtain better resolution (increase the signal to background ratio) and determine if any additional biomarkers can be detected.

2.4.MMP和TIMP测定

巨噬细胞上清进一步通过Quantibody Human MMP Array 1 (RayBiotech QAH-MMP-1, Peachtree Corners, GA, USA)进行分析。该方法可定量测定10种人基质金属蛋白酶相关蛋白MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-10、MMP-13、TIMP-1、TIMP-2和TIMP-4，对分析物的最低检测水平在0.02至0.1 ng/mL之间。Quantibody阵列是在玻片上进行的多重三明治酶联免疫吸附试验(ELISA)。对于该试验，从细胞培养检测板的每个孔中提取的样本被评价为三份，因此每个处理类型使用9个单独的阵列。因为每个蛋白质都是四倍重复的，所以有一个整体n= 36本试验。

检测是根据制造商的协议进行的。简单地说，将玻片从包装中取出，在室温下晾干约3小时后再使用。必威2490然后用100封井μL的样品稀释液在室温下轻轻摇动30分钟。通过重组冻干蛋白混合物，然后进行一系列6次1:3稀释，制备测定蛋白标准。在阻塞期之后，缓冲区被删除μ将样品或标准蛋白的L添加到每个孔中。为了减少背景，细胞培养样品在加入载玻片之前用样品稀释剂1:2稀释。载玻片与样品和标准物在4℃摇动平台上孵育过夜。第二天早上，让玻片加热到室温1小时，然后进行下一步。样品被倒瓶，载玻片用150洗涤5次μL洗缓冲液1、2次用150μL洗缓冲液II。每次洗涤都在室温下在摇杆上孵育五分钟。洗涤后，将生物素化检测抗体以80的量添加到每孔中μL和载玻片在室温下摇晃2小时。然后像前面描述的那样清洗玻片。接下来,80年μ每孔加入L的Cy3当量染料共轭链霉亲和素，在室温下摇杆上孵育1小时，避光。然后用洗涤液I冲洗5次，如前所述。清洗后，从每张载片上取下垫片，将载片置于一个4载片支架/离心管中。在试管中加入30毫升的洗涤液I，在室温下摇动15分钟。然后倒入洗涤液I，加入30ml洗涤液II，在室温下摇管5分钟。将清洗缓冲液II倒出，取出载玻片，用去离子水轻轻冲洗以去除任何残留，并在压缩氮气流下完全干燥。然后将载玻片运送到检测方法的制造商进行扫描和数据提取。

蛋白质水平是通过首先将荧光信号归一化到阵列上的内部控制来确定的。对每个信号进行归一化处理，公式如下: 在哪里P1 =参考阵列上正控制点的平均信号密度，P (Y)=阵列上正控制点的平均信号密度Y被分析(数组),X (Y)=样本阵列上某一特定点的信号密度Y”,X(纽约)=该特定点的规范化值"X“on array for sample”Y”。

根据制造商的说明，参考阵列由研究人员定义，并决定使用阳性控制点平均信号最高的每个样品的参考阵列。归一化后，减去空白中的值，使用为每个单独的蛋白质生成的标准曲线来确定蛋白质的数量。

使用JMP，第14版统计软件(SAS Institute Inc.)进行统计分析，以确定在先验水平上的显著差异 ．数据分析基于Kruskal-Wallis单因素秩方差分析和Tukey-Kramer两两多重比较程序。结果以均数±标准差(SD)表示。样本至少有三倍重复(n= 3)。

2.5.生长因子ELISA测定

人生长因子ELISA条带II试剂盒(Signosis, Santa Clara, CA, USA)用于检测成纤维细胞分泌的生长因子。该平板由12条条带组成，每条条带包含8个孔，每个孔有一个单独的捕获抗体。该方法可检测以下生长因子:基本成纤维细胞生长因子(FGFb)、血管内皮生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子BB (PDGF-BB)、β -神经生长因子(b-NGF)、干细胞因子(SCF)、肿瘤坏死因子α (TNF)α)、转化生长因子β (TGFβ)．

按照以下制造商的说明进行检测。标准品在测定板中制备，首先在第一条带的稀释缓冲液中稀释一定量的原液。然后进行四次两倍连续稀释。标准品的最终浓度为:4、2、1和0.5 ng/mL。检测范围为0.125 ~ 4 ng/mL。样品的添加量为100μL /。每条用一个细胞培养上清样本。两个对照条也包括在内，一条是空白条，100μL稀释缓冲液每孔，另一个为成纤维细胞基础培养基对照，100μ每孔1毫升未用于细胞培养的培养基。加入标准品和样品后，在室温下轻轻摇动(40转)孵育2小时。然后用200洗了三次井μ每孔L含量的洗涤液。在洗涤之后，100μ每孔加入L的生物素标记抗体混合物，在室温下轻轻摇晃培养1小时。如前所述，盘子被洗了三次，然后，100次μ每孔加入L链霉亲和素- hrp。将平板与hrp -链霉亲和素一起在室温下孵育45分钟，轻轻地摇晃。然后盘子被洗了三次。接下来,100年μ将底物的L添加到每个孔中。底物在室温下孵育20分钟，然后，50μ每口井加入L的停止溶液。按顺序添加停止溶液，使每种分析物的反应同时停止。然后在450nm处立即读出吸光度。对数据进行空白校正，然后利用各生长因子生成的标准曲线确定各生长因子的总量。

3.结果

3.1.细胞因子阵列筛选试验

细胞因子阵列筛选试验的初始运行结果证实，当检测到LPS刺激对照的生物标志物时，细胞是有响应的。总的来说，信号强度低于预期。因此，重复试验的重点是阴性对照和24小时BWP暴露，以获得对初始细胞反应更好的筛选评估。这里，细胞培养上清的量翻倍(使用1ml)。初始运行和重复运行的结果如图所示2而且3.,分别。对于非常微弱的信号，阈值为参考信号的5%。

3.2.MMP和TIMP测定

对照组蛋白质分泌量最高的是TIMP-1和MMP-9(实际值和MMP-9/TIMP-1比值见表1)．TIMP-1在阴性对照中分泌量较高，在LPS和BWP条件下分泌量较低。TIMP-2也有类似的结果，但程度较轻。尤其值得注意的是MMP-9，因为这种蛋白质也在细胞因子阵列筛选试验中被检测到4)．MMP-9的分泌显著高于( ）与阴性对照和BWP样品相比。在阴性对照条件下，产生的结果少了大约三分之一(仍然明显较低，必威2490 ）MMP-9比lps刺激的细胞多。BWP样本的诱导量明显较低(可以忽略不计)， ）与lps刺激和阴性对照样品相比MMP-9的分泌。BWP 24小时和72小时无统计学差异( ）从对方。所有检测到的水平都超过了检测限。

3.3.生长因子ELISA测定

计算出的生长因子水平如图所示5．所有检测到的水平都超过了检测限。阴性对照和LPS刺激的样品对任何分析物都没有产生信号，除了PDGF-BB，对LPS样品有非常微弱的信号。然而，这并不影响研究的整体有效性，因为样本被纠正为空白，细胞培养基和信号被观察到的BWP样本。分泌最多的生长因子是FGFb。第二丰富的因子是VEGF。PDGF-BB，尽管在LPS样品中显示出轻微的信号，但在使用标准曲线可量化的量上并不存在。检测EGF吸光度;然而，该生长因子的标准曲线是无效的，浓度没有确定。

4.讨论

4.1.细胞因子阵列筛选试验

对观察到的蛋白质的简要描述见表2．lps处理的巨噬细胞分泌了几种蛋白质，这可能是促炎反应的一部分。白细胞介素-8 (IL-8)、巨噬细胞炎症蛋白(MIP-1)水平升高α/ MIP-1β和MIP-3β)和MMP-9。BWP还显示IL-8升高，这是一种重要的趋化因子，参与中性粒细胞和其他免疫细胞的激活，并与急性炎症有关[54，55］．然而，BWP上的细胞未检测到巨噬细胞炎症蛋白或MMP-9的分泌。

比较两幅图中看到的信号2而且3.，可以观察到，总体上，BWP轮廓与阴性对照非常相似。最显著的结果可以在图中看到3.在该研究中，阴性对照和24小时BWP样品之间唯一的主要区别是BWP样品中缺乏补体因子D、MMP-9和血小板衍生生长因子- aa (PDGF-AA)，生长/分化因子15 (GDF-15)、巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)水平下降，最显著的是尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)水平下降。

这里显示的数据表明，BWP有可能通过不引发促炎反应而对宿主炎症(巨噬细胞)细胞产生预期的生物学效应。这项研究提供了有价值的在体外但不能像临床研究那样对分泌组的时间表达提供洞察。然而，它确实指出了哪些分子靶点需要进一步探索。因此，通过定量测定10种人基质金属蛋白酶相关蛋白，进一步分析巨噬细胞上清。

4.2.MMP和TIMP测定

在慢性伤口中，蛋白酶水平的高度升高破坏了组织破坏和修复之间的平衡，这可能导致炎症期停滞和愈合延迟。伤口的一个相关生物标志物是MMP-9，这是慢性伤口中最丰富的蛋白酶之一。多项临床研究分析了慢性和急性伤口的液体，得出的结论是MMP-9/TIMP-1比率增加与伤口愈合不良有关[13，16- - - - - -19］．因此，通过降低MMP-9/TIMP-1比率来减少生长因子和细胞外基质的降解是一种可行的伤口管理策略，可将未愈合的伤口转化为愈合状态。

这项初步研究的结果表明，当巨噬细胞与BWP相互作用时，MMP-9的分泌显著减少( ）与阴性对照和LPS刺激对照相比，MMP-9/TIMP-1比值分别降低了5倍和16倍1)．合成多种生物材料来制造BWP可能在这些结果中起着关键作用。MMP-9活性的显著降低可以归因于BWP中的麦卢卡蜂蜜，因为麦卢卡蜂蜜已被证明可以抑制MMP-9的表达[28］．除了减少MMP-9的分泌和MMP-9/TIMP-1的比例外，BWP中的明胶可以作为牺牲底物，缓冲/减少伤口微环境中MMP-9(包括MMP-9)升高的水平[26］．与作为牺牲底物的胶原基支架不同，这种控制MMP-9的多模态活性是伤口护理的一种新方法，独特地区分了BWP。

最近的一项临床研究表明，MMP/TIMP比值评分系统可作为糖尿病足溃疡愈合的潜在预测标志，从而可制定适当的治疗方案[56］．的记录在体外BWP降低MMP-9/TIMP-1比值的生物活性表明，它可能能够在伤口微环境中注入平衡，从而阻碍或破坏伤口中的慢性炎症，以推进愈合过程。

4.3.生长因子ELISA测定

一旦创面微环境恢复平衡，愈合可能会从炎症期进入增殖和重塑期，在此期间生长因子发挥关键作用。生长因子如FGF、VEGF、EGF、TGF、PDGF等可通过其生理作用加速伤口愈合[57］．在慢性糖尿病创面中，VEGF、TGF-等生长因子的缺乏β都与延迟愈合率有关[58］．因此，刺激机体分泌生长因子的先天反应是促进伤口愈合的一种伤口管理策略。本研究中检测到的每个生长因子的功能的简要描述包括在表中3.．

这项初步研究的结果表明，当成纤维细胞与BWP相互作用时，会分泌FGFb、VEGF、TNF-水平α, TGFβ与阴性对照和lps刺激对照相比，SCF增加。每个表3.众所周知，这些因素可以促进细胞分化、增殖、迁移、血管生成等。观察到的fgf含量最高，这对伤口愈合特别有意义，因为fgf已被证明是比VEGF和PDGF更强大的血管生成因子[67］．这种生长因子分泌的刺激可以归因于合成构建BWP的每种生物材料。明胶和麦卢卡蜂蜜被认为具有促进伤口愈合的生物活性。具体来说，麦卢卡蜂蜜已被证明可以提高成纤维细胞的活性，激活生长因子[27］．另一方面，羟基磷灰石在伤口护理中是一种相对未知的生物材料。这种无机矿物质可以结合来自周围环境的多种蛋白质、离子和其他分子，从而触发细胞的粘附、增殖和分化[29，30.］．根据本研究的结果，HAp可能在增加生长因子的分泌中发挥作用，因为它已被证明可以通过重新上皮化、基质形成、血管生成和成纤维细胞的招募促进伤口愈合[30.- - - - - -34］．

BWP在诱导宿主细胞分泌与伤口愈合相关的关键生长因子方面的生物活性在体外表明BWP可能能够刺激身体的先天反应，包括释放必要的生长因子，使伤口朝着愈合的最后阶段前进。

4.4.未来的研究

在体外BWP的表现可能不能代表人类慢性伤口的临床表现。早期临床评估正在进行中，需要进一步的临床试验来支持这些发现。本稿件的后续研究将比较BWP与其他创面产品，并挑战LPS启动或LPS + BWP条件下的系统。额外的未来在体外研究包括检查BWP可能在伤口愈合级联的早期和最后阶段通过止血特性和胶原蛋白的产生所发挥的作用。这些未来的研究可以为BWP在伤口管理中的另一种基本策略提供见解:它在急性伤口中的积极应用，如愈合过程早期的糖尿病和静脉伤口、压疮、擦伤和表面伤口、创伤性损伤、供体部位伤口和手术切口部位。

数据可用性

如欲索取资料，请到isaac@sweetbio.com．

的利益冲突

i.r.是SweetBio, Inc.的高管，也是BWP技术的共同发明人。t.c.和n.b.没有利益冲突需要声明。

致谢

本研究由SweetBio, Inc. (Memphis, TN, USA)资助。iFyber有限责任公司(伊萨卡，NY, USA)签约设计和开展研究。

参考文献

1. N. R. F.合作，“自1980年以来糖尿病的全球趋势:对751个基于人口的440万参与者的研究的汇总分析，”日报》/《柳叶刀》， vol. 387, pp. 1513-1530, 2016。视图:谷歌学者
2. 计算流体动力学。Ca预防、国家糖尿病统计报告:美国糖尿病及其负担的估计美国卫生与公众服务部，亚特兰大，佐治亚州，2014年。
3. a . Raghav, Z. a . Khan, R. K. Labala, J. Ahmad, S. Noor和B. K. Mishra，“糖尿病足溃疡的经济负担对世界:一个不断讨论的进步话题”，内分泌与代谢的治疗进展第9卷第1期。1, 2018年第29-31页。视图:出版商的网站|谷歌学者
4. N. Singh, D. G. Armstrong和B. A. Lipsky，“预防糖尿病患者的足溃疡”，美国医学协会杂志，第293卷，no。2，页217-228,2005。视图:出版商的网站|谷歌学者
5. L. E. Dickinson和S. Gerecht，“用于慢性伤口愈合的工程生物聚合物支架”，前沿生理学2016年，第7卷，第341页。视图:出版商的网站|谷歌学者
6. F. A. Fakorede，“提高对这个全国糖尿病月的认识可以拯救四肢和生命，”美国管理医疗杂志， vol. 24, p. SP609, 2018。视图:谷歌学者
7. 赵r .，梁H.， E. Clarke, C. Jackson和M. Xue，“慢性伤口炎症”，国际分子科学杂志， 2016年第17卷。视图:出版商的网站|谷歌学者
8. K. Järbrink, G. Ni, H. Sönnergren等，“慢性创伤的人文和经济负担:系统审查的方案”，/ Systamic评论》杂志上2017年，第6卷，第15页。视图:出版商的网站|谷歌学者
9. A. Gameiro, N. Pereira, J. C. Cardoso，和M. Gonçalo，“坏疽性脓皮病:挑战和解决方案，”临床，美容和调查皮肤病学， vol. 8, pp. 285-293, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
10. s.u . Nigwekar, D. Kroshinsky, R. M. Nazarian等人，“钙过敏反应:危险因素，诊断和治疗，”美国肾脏疾病杂志，第66卷，no。1, pp. 133-146, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
11. 李俊杰、陈俊杰、R. Kirsner，“急性伤口愈合的病理生理学”，在皮肤科诊所，第25卷，no。1，第9-18页，2007。视图:出版商的网站|谷歌学者
12. R. Lobmann, A. Ambrosch, G. Schultz, K. Waldmann, S. Schiweck，和H. Lehnert，“基质金属蛋白酶及其抑制剂在糖尿病和非糖尿病患者伤口中的表达，”Diabetologia，第45卷，no。7，第1011-1016页，2002年。视图:出版商的网站|谷歌学者
13. 英国Saarialho-Kere，“基质金属蛋白酶和TIMP在慢性溃疡中的表达模式”，皮肤病学研究档案，第290卷，no。增补，S47-S54页，1998。视图:出版商的网站|谷歌学者
14. M. Muller, C. Trocme, B. Lardy, F. Morel, S. Halimi，和P. Y. Benhamou，“基质金属蛋白酶与糖尿病足溃疡:MMP-1与TIMP-1的比值是伤口愈合的预测因子，”糖尿病药物，第25卷，no。4，第419-426页，2008。视图:出版商的网站|谷歌学者
15. M. P. Caley, V. L. C. Martins和E. A. O 'Toole，《金属蛋白酶与伤口愈合》伤口护理的进展，第4卷，no。4, pp. 225-234, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
16. H. Trøstrup, P. Holstein, T. Karlsmark, C. Moser，和M. S. Ågren，“无法愈合的慢性伤口中不受控的明胶降解”，伤口护理杂志第27卷第4期。11, pp. 724-734, 2018。视图:出版商的网站|谷歌学者
17. 李泽中，郭舒，姚峰，张颖，李涛，“血清基质金属蛋白酶-9与TIMP-1比值增加与糖尿病足溃疡创面愈合不良的关系，”糖尿病及其并发症杂志第27卷第4期。4, pp. 380-382, 2013。视图:出版商的网站|谷歌学者
18. 刘勇，D. Min, T. Bolton等，“基质金属蛋白酶-9增加与糖尿病足溃疡创面愈合不良有关，”糖尿病护理，第32卷，no。1, pp. 117-119, 2009。视图:出版商的网站|谷歌学者
19. E. C. Bullen, M. T. Longaker, D. L. Updike等人，“在慢性伤口中，金属蛋白酶-1的组织抑制剂减少，激活的明胶酶增加。”皮肤病学调查杂志第104卷，no。2，页236-240,1995。视图:出版商的网站|谷歌学者
20. S. Barrientos, H. Brem, O. Stojadinovic和M. Tomic-Canic，“生长因子和细胞因子在伤口愈合中的临床应用”，伤口修复与再生，第22卷，no。5, pp. 569-578, 2014。视图:出版商的网站|谷歌学者
21. S. Yamakawa和K. Hayashida，“生长因子在伤口愈合中的外科应用进展”，烧伤创伤， 2019年第7卷第10页。视图:出版商的网站|谷歌学者
22. M. D. M. Dantas, D. R. R. Cavalcante, F. E. N. Araújo等，“结合海藻酸钠/壳聚糖基薄膜和低水平激光治疗改善皮肤烧伤愈合，”光化学与光生物学杂志B:生物学第105卷第1期。1, 2011年第51-59页。视图:出版商的网站|谷歌学者
23. 李东，孙鸿辉，蒋磊等，“明胶/纳米羟基磷灰石骨仿生材料对PLGA纳米纤维生物相容性的增强，”ACS应用材料与接口第6卷第1期。12, pp. 9402-9410, 2014。视图:出版商的网站|谷歌学者
24. M. Pezeshki-Modaress, M. Zandi和H. Mirzadeh，“明胶/壳聚糖纳米纤维支架的制备:工艺优化和经验建模，”聚合物国际，第64卷，no。4, pp. 571-580, 2014。视图:出版商的网站|谷歌学者
25. M. Pezeshki-Modaress, H. Mirzadeh和M. Zandi，“用于皮肤组织工程的明胶- gag静电纺丝纳米纤维支架:工艺参数的制备和建模，”材料科学与工程:C， vol. 48, pp. 704-712, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
26. d·a·布雷特，《胶原蛋白和基于胶原蛋白的伤口敷料综述》伤口，第20卷，第347-356页，2008。视图:谷歌学者
27. S. A. Sell, P. S. Wolfe, A. J. Spence等人，“麦卢卡蜂蜜和富含血小板的血浆在伤口愈合潜力的初步研究，”国际生物材料杂志， vol 2012, Article ID 313781, 14页，2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
28. S. Afrin, F. Giampieri, T. Y. Forbes-Hernández等，“麦卢卡蜂蜜通过诱导氧化应激和凋亡、改变代谢表型和抑制转移能力，协同增强5-氟尿嘧啶对人结肠癌细胞的化学预防作用。”自由基生物学与医学2018年，中国科学院学报，vol. 126, pp. 41-54。视图:出版商的网站|谷歌学者
29. A. M. Vilardell, N. Cinca, A. Jokinen等人，“羟基磷灰石涂层上的实时蛋白质和细胞结合测量”，功能生物材料杂志2016年第7卷。视图:出版商的网站|谷歌学者
30. K. Kawai, B. J. Larson, H. Ishise等人，“钙基纳米颗粒加速皮肤伤口愈合，”《公共科学图书馆•综合》， vol. 6, p. e27106, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
31. R. Okabayashi, M. Nakamura, T. Okabayashi, Y. Tanaka, A. Nagai和K. Yamashita，“极化羟基磷灰石和丝素复合敷料凝胶对全层皮肤创面表皮恢复的影响，”生物医学材料研究杂志B辑:应用生物材料第90B卷，no。2, pp. 641-646, 2009。视图:出版商的网站|谷歌学者
32. A. A. Majeed和R. A. Al Naimi，“羟基磷灰石在兔实验性皮肤伤口愈合中的作用”，兽医科学杂志， vol. 5, pp. 74-81, 2012。视图:谷歌学者
33. 杨伟林，蒋玉英，孙铁伟等，“一种由藻酸盐水凝胶和辛伐他汀结合的介孔羟基磷灰石微球组成的新型伤口敷料的设计，用于皮肤伤口愈合，”RSC的进步， vol. 6, pp. 1043375 - 104387, 2016。视图:谷歌学者
34. M. Tommila, J. Jokinen, T. Wilson等，“生物活性玻璃衍生的羟基磷灰石涂层促进大鼠皮下纤维素植入物中的肉芽组织生长，”Acta Biomaterialia，第4卷，no。2, pp. 354-361, 2008。视图:出版商的网站|谷歌学者
35. M. E. Lund, J. To, B. a . O 'Brien和S. Donnelly，“phorbol 12-肉豆酸13-乙酸分化方案的选择影响THP-1巨噬细胞对促炎刺激的反应，”免疫学方法杂志， vol. 430, pp. 64-70, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学者
36. P. Kollar, V. Závalová， J. hoek等，“修饰型纤维素在巨噬样THP-1细胞中的细胞毒性及其对炎症反应的影响，”国际免疫药理学，第11卷，no。第8页，997-1001页，2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
37. K. Saleh, A. C. Strömdahl, K. Riesbeck和A. Schmidtchen，“炎症生物标志物与全层皮肤移植后伤口状态的相关性”，医学前沿(洛桑)，第6卷，第159页，2019。视图:出版商的网站|谷歌学者
38. J. Choi, S. Moon, H. Bae等，“桤木提取物抑制脂多糖、肿瘤坏死因子-诱导的炎症细胞因子的表达α和干扰素-γ在人类皮肤成纤维细胞中，”分子， 2019年第24卷。视图:出版商的网站|谷歌学者
39. 基因(互联网)。贝塞斯达(MD):美国国家医学图书馆，国家生物技术信息中心;2004:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1116．
40. 基因(互联网)。贝塞斯达(MD):美国国家医学图书馆，国家生物技术信息中心;2004:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1675．
41. Emmprin (CD147)，一种基质金属蛋白酶产生和功能的细胞表面调节剂，发展生物学的当前话题， vol. 54, pp. 371-389, 2003。视图:出版商的网站|谷歌学者
42. M. aristrena, F. J. Blanco, M. de Las Casas-Engel等人，“髓系内endoglin亚型的表达及其在衰老和巨噬细胞极化过程中的作用，”细胞科学杂志第127卷，no。12, pp. 2723-2735, 2014。视图:出版商的网站|谷歌学者
43. 基因(互联网)。贝塞斯达(MD):美国国家医学图书馆，国家生物技术信息中心;2004:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/9518．
44. 基因(互联网)。贝塞斯达(MD):美国国家医学图书馆，国家生物技术信息中心;2004:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/2919．
45. 基因(互联网)。贝塞斯达(MD):美国国家医学图书馆，国家生物技术信息中心;2004:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/3576．
46. 基因(互联网)。贝塞斯达(MD):美国国家医学图书馆，国家生物技术信息中心;2004:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4282．
47. B. Sherry, M. Espinoza, K. R. Manogue和A. Cerami，《趋化因子的诱导》β肽,MIP-1α和MIP-1β，由脂多糖被免疫调节细胞因子差异调节γ- ifn, IL-10, IL-4和TGF-β”,分子医学，第4卷，no。10，第648-657页，1998。视图:出版商的网站|谷歌学者
48. 基因(互联网)。贝塞斯达(MD):美国国家医学图书馆，国家生物技术信息中心;2004:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6363．
49. 基因(互联网)。贝塞斯达(MD):美国国家医学图书馆，国家生物技术信息中心;2004:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4318．
50. S. A. Lund, C. M. Giachelli和M. Scatena，“骨桥蛋白在炎症过程中的作用”，细胞通讯与信号传递杂志，第3卷，第3期。3-4，页311-322,2009。视图:出版商的网站|谷歌学者
51. P. Krzyszczyk, R. Schloss, A. Palmer和F. Berthiaume，“巨噬细胞在急性和慢性伤口愈合中的作用和促进伤口愈合表型的干预措施，”前沿生理学， vol. 9, p. 419, 2018。视图:出版商的网站|谷歌学者
52. 基因(互联网)。贝塞斯达(MD):美国国家医学图书馆，国家生物技术信息中心;2004，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6352．
53. 基因(互联网)。贝塞斯达(MD):美国国家医学图书馆，国家生物技术信息中心;2004，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/5329．
54. R. Zucehlen, A. Walz，和A. Rot，“人IL8和延迟多肽的病理生理的体外和体内活性”，国际实验病理学杂志1993年，第34B卷，第27-42页。视图:谷歌学者
55. W. L. Garner, J. L. Rodriguez, C. G. Miller等人，“急性皮肤损伤释放中性粒细胞化学引诱剂，”手术第116卷第1期。1，第42-48页，1994年。视图:谷歌学者
56. S. Luanraksa, P. jindatan一塌糊涂，T. Boonsiri, T. Nimmanon, T. Chaovanalikit和P. Arnutti，“MMP/TIMP比值评分系统作为糖尿病足溃疡愈合的潜在预测标记”，伤口护理杂志第27卷第4期。12, pp. 849-855, 2018视图:出版商的网站|谷歌学者
57. M. Zubair和J. Ahmad，“生长因子和细胞因子在糖尿病足溃疡愈合中的作用:详细综述”，内分泌与代谢疾病综述，第20卷，no。2, pp. 207-217, 2019。视图:出版商的网站|谷歌学者
58. T. D. Crafts, A. R. Jensen, E. C. Blocher-Smith和T. A. Markel，“血管内皮生长因子:缺血治疗的可能性和挑战”，细胞因子第71卷第1期。2, pp. 385-393, 2015。视图:出版商的网站|谷歌学者
59. K. a . Thomas，“血管内皮生长因子，一种有效的选择性血管生成剂”，生物化学杂志，第271卷第4期。2，第603-606页，1996年。视图:出版商的网站|谷歌学者
60. J. C. Gardner, H. Wu, J. G. Noel等人，“角化细胞生长因子通过维持肺泡抗菌蛋白水平和巨噬细胞功能支持肺固有免疫防御。”美国生理学杂志-肺细胞和分子生理学第310卷第3期。9, pp. L868-L879, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学者
61. R. S. Herbst，《表皮生长因子受体生物学综述》国际放射肿瘤生物学物理杂志2004年，第59卷，第21-26页。视图:出版商的网站|谷歌学者
62. 学术界。Heldin和B. Westermark，“血小板衍生生长因子的作用机制和体内作用”，生理上的评论，第79卷，no。4，页1283-1316,1999。视图:出版商的网站|谷歌学者
63. r·库兹罗克，"干细胞因子"Holland-Frei癌症医学B. C.德克尔公司，加拿大汉密尔顿，第6版，2003年。视图:谷歌学者
64. H. T.伊德里斯和J. H.奈史密斯，“TNF?和TNF受体超家族:结构-功能关系，”显微技术研究与技术，第50卷，no。3，页184-195,2000。视图:出版商的网站|谷歌学者
65. A. Bikfalvi, S. Klein, G. Pintucci和D. B. Rifkin，“成纤维细胞生长因子-2的生物学作用。”,内分泌检查，第18卷，no。1，第26-45页，1997年。视图:出版商的网站|谷歌学者
66. D. A. Clark和R. Coker，《聚焦转化生长因子- β分子(TGF-)》β),“国际生物化学与细胞生物学杂志，第30卷，no。3，页293-298,1998。视图:出版商的网站|谷歌学者
67. G. Kolumam, X. Wu, W. P. Lee等人，“IL-22R配体IL-20, IL-22和IL-24促进糖尿病db/db小鼠伤口愈合，”《公共科学图书馆•综合》， vol. 12, p. e0170639, 2017。视图:出版商的网站|谷歌学者

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