保存方法及γ辐照灭菌对TGF-β冻干羊膜(FD-AM)和羊膜海绵中bFGF的水平

摘要

背景．羊膜移植可保存为冻干羊膜(FD-AM)和羊膜海绵。保存好的移植物需要用射线照射消毒。然而，这一过程的每一步都可能影响其生物特性。尽管如此，关于保存方法和γ射线照射对保存羊膜移植物生长因子水平的影响的研究也很少。方法．这是一个在体外在特定时间对一批羊膜捐献者进行连续取样，采用前后组设计的实验研究。将羊膜制成FD-AM和羊膜海绵制剂，分别用γ辐照(15 kGy和25 kGy)消毒。以未辐照标本为对照，每个标本粉碎20 mg，采用ELISA法测定生长因子水平。结果．与FD-AM相比，羊膜海绵中转化生长因子β (TGF-β)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)水平，以及预辐照和25 kGy辐照后的制剂( )．15 kGy和25 kGy辐照前和辐照后FD-AM的生长因子水平差异显著( )．同样，预辐照羊膜海绵组的生长因子水平与辐照后的羊膜海绵组相比也有显著降低( )．结论．TGF -β羊膜海绵中bFGF水平低于FD-AM。γ辐照灭菌后，FD-AM和羊膜海绵制剂的生长因子水平降低。尽管生长因子水平显著下降，但生长因子水平的数量仍足以促进组织愈合。

1.简介

近几十年来，羊膜作为一种生物材料被广泛应用于各种临床应用。羊膜来源于胎盘，是一种胚胎外组织，由胎儿成分(绒毛膜板)和母亲成分(蜕膜)组成[1］．羊膜具有特殊的特性，包括抗炎、抗菌、抗病毒、抗纤维化、抗瘢痕和非常高的拉伸强度[2，3.］．还可以减少刷状组织的发生，保护创面，减轻疼痛，增加基底上皮细胞的粘附，促进细胞分化，增强再上皮化，是组织愈合的理想选择[3.］．

体外研究已经证明，羊膜产生的生长因子有助于血管生成、再上皮化和免疫调节[4］．ELISA检测发现人羊膜含有7种生长因子:bFGF、TGF-αTGF -β1, -β2、EGF、KGF和HGF [5］．在伤口愈合中，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)负责肉芽组织的形成、再上皮化和组织重塑[6),而TGF -β抑制ECM(细胞外基质)降解并增加胶原蛋白的生成[7］．

有一些方法可以保存羊膜;冻干是最常用的方法之一[3.］．冻干羊膜可以长时间保持羊膜的生存能力，而不需要−80°C的冷冻机进行保存[2］．另一种保存羊膜的方法是把它变成羊膜海绵。羊膜海绵是将羊膜切成约250块大小必威2490μM，与粘结材料混合，冷冻干燥[1］．羊膜海绵的凝胶形式无疑比冻干羊膜(FD-AM)更容易使用，后者是一种片状的形式。羊膜海绵是一种很容易获得、价格实惠的生物材料，作为加速伤口愈合过程的替代材料，它很容易应用[1］．

灭菌技术是生物材料制备全过程的组成部分[3.］．灭菌是必要的，以防止病原体传播或污染。另一方面，选择的灭菌工艺必须保留生物材料制备的生物潜力。已经制定了几种方法来消毒生物材料，即使用热、化学和电子辐射或伽玛射线消毒[3.］．Soetomo博士综合学术医院细胞和组织库用于羊膜消毒的常规灭菌技术是25 kGy γ辐照[8］．

常用的辐射灭菌方法是使用Co-60的伽马射线，因为它实用、可靠、可预测，并具有高穿透性，所以即使在最终包装后组织也可以灭菌[3.，9］．如ISO 11137所述[10]，医疗设备的灭菌剂量可为15 kGy或25 kGy，取决于产品的初始生物负荷、产品的微生物含量[3.］．实际上，每个组织库的辐射剂量使用情况各不相同。亚太地区的大多数组织库一直使用25千吉的辐射灭菌剂量。直到最近，他们才要求不同的剂量，因为25 kGy可能会对移植物产生负面影响[11］．大多数库使用25 kGy作为辐射灭菌的参考剂量。另一方面，有些选择较高的剂量，以确保产品的无菌性，有些选择较低的剂量，以保持组织的生物力学性能。不幸的是，高剂量的辐射灭菌可能会引起化学和物理变化，从而改变产品的生物特性[12］．认为初始生物负荷数越低，灭菌剂量越小，所造成的生物损害也就越小[13］．

据我们所知，只有少数研究报道了辐射灭菌对同种羊膜移植物生长因子水平的影响。根据羊膜的保存方法，关于羊膜中生长因子水平的资料也很少必威2490。因此，在本研究中，我们的目标是通过酶联免疫吸附试验(ELISA)，确定γ辐照灭菌剂量对羊膜保存方法(冻干羊膜(FD-AM)和羊膜海绵)生长因子水平的影响。

2.材料和方法

这项研究是在体外实验研究采用前测后测组设计。本研究使用的抽样技术是在特定时间内对一批羊膜供体(包括8名患者)进行连续抽样，这些患者符合选择标准。这项研究于2019年6月至12月在雅加达泗水和巴丹Soetomo博士综合学术医院(印度尼西亚国家原子能机构)的细胞和组织库进行。

本研究使用的材料是来自符合资格标准的捐赠者的8块羊膜。每个胎盘分为6个标本;冻干羊膜(FD-AM)和羊膜海绵制剂各三份。根据保存方法，对每个标本分别给予不同的γ辐射剂量(15 kGy和25 kGy)。其余未受辐照的标本作为对照。每个样本最多收集20毫克，然后制成羊膜粉，用ELISA法评估其生长因子水平。

2.1.冻干羊膜(FD-AM)和羊膜海绵制剂的制作

羊膜取自18-42岁的捐赠者的新鲜胎盘，这些捐赠者自愿捐献了自己的胎盘，并给出了书面同意。对捐赠者进行评估并确认其无药物滥用、人体免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和梅毒。本研究排除胎粪污染胎盘及妊娠并发症患者的胎盘。

胎盘是在剖宫产的手术室或正常分娩的产房无菌采集的。下一步是评估胎盘是否变色、是否有碎屑或其他污染物、气味变化和其他损伤迹象。如果胎盘状况良好，则继续进行羊膜和绒毛膜分离。分离后，用生理盐水(0.9% NaCl)清洗羊膜，清除血块、黏液和碎片。然后，在无菌容器中浸泡在0.9% NaCl溶液中，密封，贴上标签，准备在温度为−4°C的冷却盒中送往Soetomo博士综合学术医院的细胞和组织库。

新鲜羊膜到达组织库后，对其容器状况、无菌性和管理文件的完整性进行评估。然后将它们放入−20°C的隔离柜中，直到进一步加工。

羊膜是在无菌的房间里，在无菌的桌布上，用消毒的仪器处理的。将羊膜从无菌容器中取出，转移到室温下填充0.9% NaCl的容器中。将羊膜置于室温下，约10分钟后，移入处理盘，作为羊膜移植物处理。首先将羊膜用0.05% NaOCl溶液浸泡10分钟消毒，然后放入室温填充0.9% NaCl的水浴摇床(Julabo SW23)中。0.9% NaCl每15分钟更换10次。随后，将洗净的羊膜展开，安装在无菌纱布上，绒毛膜侧面对纱布。

为了制作冻干羊膜(FD-AM)，然后将羊膜在−80°C的温度下深度冷冻至少24小时。下一步将羊膜冻干(Lyovoc GT2)至−40°C -−50°C，持续6-8小时，至羊膜含水量为6-7%。然后将冻干后的羊膜切成所需的尺寸，用真空封口机密封在三层聚乙烯塑料中。这一过程是在层流柜中进行的。

羊膜海绵制剂的制备步骤与胎盘组织收集处相同，0.05% NaOCl溶液消毒羊膜，0.9% NaCl洗涤羊膜，直至将拉伸好的羊膜置于无菌纱布上。羊膜海绵的不同之处在于这些步骤之后;羊膜被切成小块，与生理盐水按1:1的比例研磨，直到达到所需的质地。然后将混合物成型为羊膜海绵制剂，在- 80°C的深度冰箱中储存至少24小时，然后冻干，因此，包装在三层聚乙烯塑料中。

2.2.灭菌

冷冻干燥羊膜(FD-AM)和羊膜海绵制剂在三层聚乙烯塑料真空密封后灭菌。将FD-AM和羊膜海绵制剂放入最终包装中，用15 kGy和25 kGy的伽马射线(Co-60)辐照(Kimura, Chemical Plants Co.， Ltd, Osaka, Japan)进行灭菌。这一进程在雅加达的巴丹(印尼国家核能机构)执行。

2.3.测试生长因子水平

收集预辐照和辐照的FD-AM和羊膜海绵制剂各多达20mg，并粉碎以检查它们的生长因子水平。将粉碎后的FD-AM和羊膜海绵溶于1cc的0.9% NaCl中，超声水浴(ELMA 1040 H)均质10分钟。1500 rpm离心5分钟。收集离心后的上清液，测定bFGF和TGF-的水平βELISA试剂盒BTLab人bFGF14］．

2.4.数据分析

获得的数据使用配对进行分析t-测试评估辐照前后(15 kGy和25 kGy辐照)和独立的生长因子水平t-test比较TGF-β冻干羊膜(FD-AM)组与羊膜海绵组间bFGF水平呈正态分布数据。

3.结果

本研究采用前测后测组设计进行实验研究。我们对两组进行了初始测量(前测)，随后进行治疗和最终测量(后测)。我们的研究评估了伽玛射线照射和保存方法对TGF-的影响β以及羊膜移植物，即冻干羊膜(FD-AM)和羊膜海绵中bFGF的水平。FD-AM和羊膜海绵的准备工作见图1而且2在下面。

第一个步骤是测量TGF-β和预照射FD-AM中bFGF水平，并与TGF-进行比较β以及被进一步加工成羊膜海绵的羊膜的bFGF水平。在FD-AM和羊膜海绵分别接受15 kGy和25 kGy剂量的伽马射线辐射灭菌后，我们评估了两种制剂的TGF-β和bFGF。我们将它们与辐照前的生长因子水平进行了比较。我们预计，在加工成羊膜海绵和接受伽马射线辐射后，生长因子水平都会下降，因为这些处理会导致构成生长因子的氨基酸断裂。

《独立报》t- TGF-检测结果β与FD-AM相比，羊膜海绵中的bFGF水平显著降低，无论是辐照前还是辐照后25 kGy。TGF -β以及与羊膜海绵相比，辐照前和辐照后冻干羊膜(FD-AM)中的bFGF水平见表1．

配对样本的结果t- TGF-测试β与辐照后的羊膜海绵组相比，15 kGy和25 kGy的羊膜海绵组的水平均显著降低( ）(表2)．另一方面，TGF-无明显差异β15 kGy和25 kGy辐照前和辐照后FD-AM的水平比较( ）(表3.)．我们还计算了TGF-降低的百分比β来自FD-AM中预辐照标本的25 kGy辐照后标本以及羊膜海绵的水平。TGF-平均百分比下降βFD-AM为82.35±7.58%，羊膜海绵为73.89±2.61%4)．

的paired-samplet-预辐照冻干羊膜(FD-AM)的bFGF水平与15 kGy和25 kGy辐照后的FD-AM相比显示了显著差异( 而且 ，)(表5)．同样，预照射和后照射羊膜海绵制剂中bFGF水平的差异也具有统计学意义，均为15 kGy和25 kGy ( ）(表6)．在FD-AM中，25 kGy辐照后的样品比辐照前的样品的bFGF水平平均下降了30.57±10.33%。FD-AM组和羊膜海绵组辐射灭菌前后bFGF水平及下降百分比见表7．

TGF-无明显差异β和bFGF水平在FD-AM和羊膜海绵之间的平均百分比下降( 和0 = 0.662，分别)t以及结果(表8)．

4.讨论

4.1.保存方法

羊膜含有胶原蛋白基质和主要的生物活性分子，如各种生长因子。我们都知道，羊膜中生长因子的水平因人而异，并会影响其生物效应[15］．目前可供选择的羊膜保存方法很多，有风干、冷冻干燥、甘油保存等[16］．这些过程会改变生物特性，影响羊膜最终形态的生长因子水平。

结果TGF-β冻干羊膜(FD-AM)制剂与羊膜海绵制剂的bFGF水平差异有统计学意义，其中羊膜海绵制剂( )．这可能是由于羊膜海绵经历了不同的步骤，即将羊膜海绵切碎，并用0.9%的NaCl研磨，以创造不同的质地，而FD-AM则没有经过切碎状态。应认为实际TGF-β由于FD-AM和羊膜海绵均需要粉碎后，ELISA技术才能评估生长因子水平，因此bFGF水平高于本研究结果。

在被用作羊膜移植之前，羊膜要经历从处理、储存到准备的各个阶段。每个阶段都可能影响羊膜移植物的生长因子水平[17］．以往研究表明，冷冻干燥保存和辐射杀菌等方法对羊膜异体移植物的组织学和生物物理性质有显著影响[12］．

根据Ihsan [18]，冻干羊膜中表皮生长因子水平下降的原因有几个，比如冻干过程中的损伤、冻干、包装和辐射。他解释说，在他的研究中，新鲜和冻干羊膜中的EGF水平低于其他研究人员的结果。这可能是由于不同的提取过程和使用的ELISA测试。本研究中EGF水平的降低可能是由于冻干羊膜制造过程中的几个阶段造成的。在样品冷冻、冻干和辐射过程中可能会发生一些组织损伤[18］．

下一步是冷冻干燥过程;干燥组织直接从冰相进行，不经过液相，以防止组织自溶。冻干过程中温度的变化被认为是造成样品损坏的原因。冻干羊膜处理的最后一步是辐射杀菌。辐射与物质的相互作用有两种方式，一种是直接由辐射本身电离产生，另一种是通过自由基的形成间接产生。辐射过程是在低温、无水及无氧(真空)下进行的，以防止氧自由基受辐射的影响[18］．

羊膜冷冻的目的是制备冷冻干燥工艺，降低组织抗原的性质。在−80°C冷冻可造成冻伤，表现为微小冰晶或细胞内液体的浓度和组成发生变化。它破坏细胞的扩散和渗透过程，导致细胞损伤。此外，冷冻还会引起蛋白质应激，导致蛋白质变性。冷冻过程发生的时间越长，形成的冰晶越多，因此细胞损伤也就越严重。本研究中，羊膜冷冻时间为24-36小时[18］．另一方面，羊膜海绵是一种羊膜，它被压碎到250左右的大小必威2490μM与黏合剂混合，常温冷冻干燥[19］．本研究预计，与冻干羊膜相比，羊膜的生长因子水平会显著降低，因为羊膜在加工成羊膜海绵之前需要研磨。

Russo等人采用与本研究类似的“羊膜粉”制造阶段[17］．本研究获得的预照射bFGF水平为21.72±5.33 pg / g新鲜羊膜，TGF-β1 5.37±0.93 pg/g [17］．很难将Russo等人的研究结果与本研究直接进行比较，因为他们将羊膜湿重作为对照。因此，使用的单位是不同的。在本研究中，每个羊膜供体的生长因子水平不同[17］．Wu等人从五种新鲜羊膜中提取了未经冻干和γ灭菌的提取物，得到了更高的bFGF水平，为646.4 pg/ml (172-1913 pg/ml) [20.］．然而,TGF -β研究中的水平要低得多;一种TGF-β亚型,即TGF -β1、仅为346 pg/ml (257-468 pg/ml) [14］．这与López-Valladares等人对总蛋白含量的研究相似。bFGF、HGF、KGF和TGF-β每个羊膜样本1个，与胎龄和供体年龄相关[21］．

冷冻干燥的羊膜可以保存，并在各种保存条件下保持稳定，而不失去其临床功能。根据用途和储存方式的不同，低温保存的羊膜可以在一年后使用，而经冷冻干燥和辐照的羊膜可以使用数年。22］．冻干是指通过升华除去羊膜中的水分，从而抑制可能导致组织破坏的化学反应[23］．有人怀疑，保存和辐照的羊膜中生长因子水平的下降是否会使伤口愈合无效。然而，一项研究[24]发现低温保存的羊膜与冻干羊膜在角膜表面重建中的差异不显著。此外，之前的文献报道，在动物模型研究中，作为角膜重建的生物材料，冻干羊膜与非冻干羊膜同样有效[2］．这些结果证明，降低生长因子水平的冻干羊膜仍可用于临床。

4.2.灭菌方法

灭菌是制造生物材料的一个重要过程，但大多数灭菌技术会影响产品的生物性能。然而，射线辐射杀菌是冷杀菌。它被推荐用于生物组织，因为它能在不显著升高辐照材料温度的情况下使微生物失活。此外，伽马射线还具有很高的穿透性，因此即使在最终包装后是散装的组织也可以进行消毒[9］．

如ISO(国际标准化组织)11137所述，根据其生物负荷，可在15 kGy或25 kGy的剂量下对医疗设备进行灭菌[10］．认为初始生物负荷数越低，给予的灭菌剂量越小，造成的生物损害越小[13］．需要考虑的是，所选择的辐射杀菌剂量必须可靠有效，足以消灭微生物，并造成尽可能小的损害[3.］．

本研究显示TGF-有显著差异β以及冻干羊膜(FD-AM)和羊膜海绵中辐照前和辐照后产品中的bFGF水平。通过计算TGF -β和bFGF水平的降低，其中TGF-的降低比例最大β水平25 kGy辐照后冻干羊膜(FD-AM)，数量为82.35±7.58%。辐照后25 kGy冻干羊膜(FD-AM)的bFGF水平下降幅度最小，较辐照前制剂下降至30.57±10.33%。

γ辐照与Co-60的嫁接杀菌可能影响组织的生物力学性能，以剂量依赖的方式。不幸的是，组织库必须确保移植物的照射剂量足够高，以保证不育水平(SAL)为10⁻⁶同时保留其作为体内生物材料的功能[25］．辐射杀菌可导致在骨诱导过程中起作用的生长因子(骨形态发生蛋白和TGF-)的降解β) [26］．Costa等人2006年的一项研究发现，辐照后羊膜粉的bFGF水平为425.7±153.9 pg/ml，而刺激内皮细胞增殖需要约500 pg/ml或0.5 ng/ml [27］．在我们的研究中发现，最小的bFGF量为15.50 ng/mL，来自辐照后25 kGy的羊膜海绵。既往文献证明，虽然将移植物作为羊膜海绵保存，并给予25 kGy的照射，但仍足以促进内皮细胞和上皮细胞增殖[27］．

Russo等人测量了来自两名供体的25 kGy辐射羊膜预照射和后照射膜粉的上皮生长因子(EGF)水平[17］．通过对两个样品的检测发现，辐照后羊膜的EGF浓度仅较辐照前略有下降，为98.72±0.67% [17］．Skopiński等人表明，γ灭菌处理的羊膜在35 kGy剂量下对内皮细胞培养的影响与未照射的羊膜不同[28］．Russo等人测量了来自两名捐赠者的羊膜粉在25 kGy射线照射前后的上皮生长因子(EGF)水平[17］．通过对两个样品的检测发现，辐照后的EGF浓度仅较辐照前略有下降，为98.72±0.67% [17］．

特定剂量的电离辐射会对细胞结构造成损伤。另一方面，细胞有一个复杂的修复系统来保护自己免受辐射伤害。这个系统的效率，尤其是细胞的存活，取决于DNA序列编码的基因。因此，基因的状态和基因产物的活性依赖于DNA序列的完整性[29，30.］．辐射暴露会导致交联反应和蛋白质碎裂、聚集和氧化[24］．辐射引起内皮细胞功能改变，导致细胞凋亡或有丝分裂死亡。它可以直接或间接地导致网络中各种生长因子或其他要素的数量和质量下降。确定辐射剂量对维持羊膜等同种异体移植物中各种生长因子的数量和质量非常重要。31］．

辐射灭菌后最显著的组织移植物变化是移植物的机械完整性及其生物物质，包括生长因子的丧失。尽管如此，移植物仍然具有其他良好的特性，例如它的屏障功能可以防止伤口污染，因此在有迹象表明开放性伤口覆盖时可以验证它的使用[32］．一项研究报道，15、20、25和30 kGy的伽马射线照射后，羊膜结构没有明显变化[33］．

尽管在接受辐射消毒后，生长因子水平可能会下降，但一些研究表明，给予移植器官25 kGy的辐射消毒仍能维持其提供组织愈合的功能。Djefal等人进行的一项研究得出结论，维持25 kGy的γ辐照剂量可以证实对人冻干羊膜(FD-AM)消毒[34］．Yusof和Hilmy表示，25 kGy的辐射可以很容易地给予生物负荷较低的羊膜，以达到保证不育水平10⁻⁶［3.］．相比之下，Deocaris等人推荐的羊膜灭菌剂量为25和35 kGy，以平衡产品无菌性的要求，同时防止对移植物的过度破坏[24］．然而，尽管组织消毒是制作羊膜移植物必不可少的过程，但需要记住的是，组织消毒绝不能取代正确和卫生的组织处理。

5.结论

保存的羊膜移植制剂，包括冻干羊膜(FD-AM)和羊膜海绵，生长因子水平低于新鲜羊膜移植。这项研究发现TGF-β羊膜海绵中bFGF水平低于FD-AM。保存羊膜中生长因子的减少无疑是不可避免的。然而，需要考虑的是，生长因子水平的显著下降并不一定意味着移植物不适合临床使用。尽管保存的羊膜具有较低的生长因子水平，但研究证明保存的羊膜在临床应用中与未保存的羊膜一样有效。

在给予15 kGy和25 kGy剂量的辐照灭菌后，FD-AM和羊膜海绵制剂的生长因子水平均下降。γ射线辐照杀菌是处理羊膜移植物的一个重要因素，不能被损害。建议用25 kGy辐照进行接枝杀菌，以保证不育保证水平(SAL)达到10-6。

本研究使用FD-AM和羊膜海绵，评估其TGF-β和bFGF的水平。我们希望更多的研究辐射杀菌在其他类型羊膜移植物中的作用，以及在体内分析生长因子水平对活组织的差异。

数据可用性

支持这项研究结果的数据包括在文章中。

的利益冲突

作者声明，关于这篇论文的发表不存在利益冲突。

致谢

作者希望对Soetomo博士综合学术医院的细胞和组织库再生医学对这项研究的支持表示感谢。

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