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国际生物材料杂志/2021/文章

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体积 2021 |文章的ID 8828194 | https://doi.org/10.1155/2021/8828194

Guilherme A. D. Ramires, Julia Taino Helena, Júlio C. S. De Oliveira, Leonardo Perez Faverani, Ana Paula F. Bassi 牛和猪胶原膜诱导骨再生的评价:组织形态计量学和免疫组织化学分析",国际生物材料杂志 卷。2021 文章的ID8828194 9 页面 2021 https://doi.org/10.1155/2021/8828194

牛和猪胶原膜诱导骨再生的评价:组织形态计量学和免疫组织化学分析

学术编辑器:张文政陈
收到了 17 Sep 2020
修改后的 12月8日
接受 2021年3月10日
发表 2021年3月30日

摘要

引导骨再生(GBR)是一种用于促进骨再生的技术,它使用生物相容性膜作为物理屏障来防止邻近结缔组织侵入骨缺损。本研究的目的是利用组织学、组织计量学和免疫组织化学分析,评估和比较牛和猪胶原膜在大鼠颅骨严重骨缺损修复过程中作为结缔组织入侵屏障的有效性。本研究将72只大鼠分为3组:凝块组(CG)、牛胶原组(BCG)和猪胶原组(PCG)。在第7、15、30和60天进行分析。组织学结果显示,PCG从第7天开始出现骨新生,部分动物修复30天后,手术缺损被完全填充。对于BCG,初始阶段骨新生活动很少,从第30天开始,骨新生活动增加,第60天增加更大。在组织计量学分析中获得的数据显示,在第30天,PCG和BCG之间的新生骨面积变化不大,尽管两者都与CG不同。到第60天,PCG比BCG呈现更大的新生面积。免疫组织化学结果证实了这些结果。根据所得结果,可以得出结论,本研究所研究的所有膜都促进了GBR。

1.介绍

牙科和医学面临的巨大挑战之一是寻找能够满足创伤性生理变化或病理条件引起的骨缺损的物理-生物重建要求的骨替代品[12]。因此,膜似乎是引导骨再生(GBR)的一个很好的选择,因为它们支持骨促进、生物相容性、非细胞毒性和机械稳定性,即在骨修复过程中保持空间的能力[3.- - - - - -7]。

文献表明,在适当的环境条件下,体内某些组织在愈合过程中具有再生的生物学潜力[89]。在ROG过程中使用生物膜的主要适应症是矫正无牙边缘或残留缺陷[10],拔牙和开裂后的肺泡,中间种植体和直接种植体放置后的开窗[11]。骨新生必须具备以下条件:必须有成骨细胞的来源(缺损附近的活骨);必须有充足的血管化;伤口部位在愈合过程中必须保持机械稳定(因为微运动可能影响组织形成);在膜和骨表面之间必须有一个适当的空间,以防止膜在这个关键的空间内塌陷(因此,这个空间被血凝块填充,成骨细胞将在其中繁殖);膜必须具有渗透性,允许血浆和营养物质扩散,但不允许非成骨细胞通过;膜必须具有生物相容性;在血栓形成过程中必须保护脆弱的血管网。12]。

根据andade - acevedo [13],与GBR和膜的使用相关的最常见的问题是膜的全部或部分塌陷,由于软组织开裂(局部感染)而导致的膜暴露,以及技术水平低下。市场上的选择包括可吸收膜和不可吸收膜。第一批用于GBR的膜是不可吸收的。它们需要随后的手术切除,并且通常与暴露问题和临床成功率降低有关。14]。目前,在GBR过程中研究和使用最多的膜材料是由膨胀聚四氟乙烯(e-PTFE)形成的结构,在生理条件下不能被化学分解。尽管使用e-PTFE膜的骨再生具有很高的可预测性,但主要的缺点是其暴露会导致细菌污染。该区域的炎症反应可能需要尽早切除膜[15]。几位作者报道了在这些情况下骨骼再生量的减少[15- - - - - -17]。

可吸收膜必须通过水解和酶降解进行吸收和大分子降解,这发生在酶的存在下,如酸性磷酸酶和胶原酶。生物再吸收要求完全消除降解产物而不产生局部残留效应[18]。制造这些膜是为了避免第二次手术。这些生物材料已被广泛研究。研究了由聚乳酸-聚乙醇酸共聚物和聚乳酸组成的新一代膜。14]。

在可用的膜中,胶原膜满足大多数要求:它们具有生物相容性和止血作用,它们促进成纤维细胞和成骨细胞的趋化性,并且是半透性的,它们允许营养物质的转移[19- - - - - -24]和显著修复牙周组织骨内缺损[25]。此外,当与各种类型的骨移植物结合使用时,胶原膜可以提高其有效性,增加刺激牙周组织修复的能力[26- - - - - -28]。目前,人们正在寻求替代方案,以帮助骨组织修复,并通过高性能和低成本的生物材料降低患者的成本[29]。Lumina-coat®牛胶原膜-用于口腔组织再生-防止软组织渗透到骨缺损中,为骨、软组织和血管的正确形成提供指导,在愈合过程中均匀地血管化,使膜与邻近组织良好融合,并降低成本[30.31]。

本研究的目的是通过组织形态学和免疫组织化学分析,评价牛胶原膜和猪胶原膜在引导骨再生过程中修复大鼠颅骨严重骨缺损的潜力。

2.材料与方法

本研究已提交给保利斯塔大学araparatuba牙科学院动物实验伦理委员会并获得批准(协议号01062-2017),并遵循ARRIVE指南。

选取体重约200 ~ 300 g的3 ~ 4月龄雄性褐家鼠(Rattus norvegicus albinus, Wistar) 72只,随机分为3组,每组24只。它们分别在手术后7天、15天、30天或60天被安乐死。大鼠饲养于圣保罗州立大学(UNESP)牙科学院(araparatuba)动物园内,每笼3只。给大鼠喂食含1.4%钙和0.8%钾的均衡饮食(NUVILAB, Curitiba, PR, Brazil),并给予自由饮水。

2.1.外科手术

手术于上午在位于阿拉帕拉图巴的圣保罗州立大学(UNESP)牙科学院的动物园内进行。术前禁食12小时,肌肉注射盐酸氯胺酮(50mg /kg Francotar;Virbac do Brasil有限公司,São Paulo, Brazil) combined with xylazine (5 mg/kg Rompun; Bayer S. A. Animal Health, São Paulo, Brazil). Trichotomy was performed in the cranial calvaria region. Antisepsis procedures were performed with polyvinylpyrrolidone-iodine (PVPI, 10% Riodeine; Rioquimica, São Jose do Rio Preto, Brazil) and topical PVPI (10% Riodeine; Rioquimica, São Jose do Rio Preto, Brazil), and the rats were placed in a sterile field.

在颅骨前部的头皮上每侧各做一个约1cm的v形切口,以便在后方向反射全层皮瓣。一个直径为8mm的临界尺寸的缺损是用一个直径为7mm的内径环钻(3i Implant Innovations, Inc., Palm Beach Gardens, USA)制成的,放置在低速机头中,用无菌生理盐水连续冲洗。该缺损位于颅骨中央部分,涉及矢状缝以维持硬脑膜的完整性。根据所提出的治疗方法,在不粘贴膜(CG)的情况下,在粘贴牛胶原膜(BCG)或猪胶原膜(PCG)后,缺陷被不同的血凝块填充。

手术后,将软组织重新定位并在不同平面上进行缝合:可吸收缝线(聚乳酸,Vicryl 4.0;深层使用Ethicon, Johnson Prod., s o jos dos Campos,巴西),单丝线(mononylon, Nylon 5.0;最外平面采用Ethicon, Johnson Prod.)间断缝合。

术后即刻,每只动物接受单次肌肉注射0.1 mL青霉素G苄星(小动物用兽用五元生物;福特道奇沙特动物有限公司。巴西坎皮纳斯州)。在术后7、15、30和60天通过过量麻醉剂(硫喷妥钠,150 mg/kg)对动物实施安乐死。将颅骨取出,在10%甲醛溶液中固定48小时,在自来水中洗涤24小时,在20% EDTA中脱钙7周,在酒精溶液中脱水,并透明。将制备好的颅骨纵向从中间切开,分离骨缺损。这样得到的碎片被单独添加到石蜡中,6μ获得M厚切片。切片用苏木精和伊红染色。

2.2.Histomorphometric分析

所有形态学分析使用带有×6.3, ×12.5, ×25和×40镜头的双目光学显微镜进行,并附带AxioCam ICc相机(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)记录组织切片图像。

扫描的图像保存在TIFF文件中。组织形态学分析使用2.5获得的图像进行x/ 0.07的目标。使用photoshopcs6软件,使用Photomerge工具,对幻灯片的全景图像进行组装。评估了从载玻片获得的全景图像中存在的骨组织面积,仅排除了残肢的骨面积。

2.3.免疫组织化学分析

免疫组织化学检测免疫过氧化物酶活性。过氧化氢抑制内源性过氧化物酶活性。随后,用磷酸柠檬酸缓冲液(pH 6.0)对载片进行抗原回收处理,并用脱脂奶粉阻断内源性生物素。采用抗骨钙素(Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA)和骨桥蛋白(Santa Cruz Biotechnology)的一抗。在抗体孵育期间,用柠檬酸缓冲液在60°C下孵育20分钟,然后用脱脂牛奶和牛白蛋白阻断非特异性反应。从驴中提取的多克隆生物素化山羊二抗(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA)与Avidin and Biotin amplification Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)一起使用。二氨基联苯胺(Dako, Carpinteria, CA, USA)作为显色剂。对于每种抗体,根据骨修复过程中免疫标记的细胞数量,通过分配不同的分数,对相关蛋白的免疫标记强度进行半定量评估。使用光学显微镜(Leica DM4000B LED, Heerbrugg,瑞士)进行分析,使用以下评分:零标记(0),轻度标记(1),中度标记(2)和强烈标记(3)。免疫染色用所评估的每种蛋白质的平均标记百分比表示。因此,评分1显示约25%的免疫标记;必威2490 score 2, 50%; and score 3, 75% of immunolabeling. Immunolabeling is known to be an indicator of the dynamics of bone tissue, and diaminobenzidine markings were considered positive, taking care to carry out negative controls (clot without membrane) to assess the specificity of the antibodies [32]。

2.4.统计分析

在分析中获得的数据被转换成像素的绝对值,然后转换成相对百分比值,以尽量减少图像之间的尺寸差异的干扰。为了比较不同组和实验时期的平均值,首先对它们进行均方差统计检验,然后根据数据在正态曲线上的分布情况,应用最合适的检验(参数或非参数)。使用生物学研究统计程序Sigma Plot 12.3 (Systat Software, Inc., San Jose, CA, USA)进行分析,显著性水平设为 所有试验均< 0.05。

3.结果

3.1.Histomorphometric分析
3.1.1.CG

在凝块组(CG)中,在前7天,图像显示血管增生伴成纤维细胞活性。第15天,骨缺损边缘向创面中心移动,仅在手术创面残端形成新骨。原代骨组织随机分布,骨细胞丰富,表面覆盖成骨细胞。第30天,在缺损残端附近观察到一个新形成的骨区。它们之间的空间充满了松散的、未经修饰的结缔组织。第60天,缺损处充满未成熟结缔组织,存在炎症浸润,未见骨新生迹象,证实这些是严重缺损(见图)1)。

3.1.2.波士顿咨询公司

在第7天的牛胶原蛋白组(BCG)中,观察到组织良好的肉芽组织,没有明显的炎症过程迹象,并且有一层膜覆盖在细胞入侵的缺陷上。第15天,出现肉芽组织穿插新生骨组织;在残肢旁,缺损的中心显示有组织的结缔组织,还有一层膜,里面有骨新生岛。第30天,缺损中心出现新生骨组织。第60天,新生骨组织成熟,结缔组织穿插,未见膜残,新生骨区中间有血管(见图)12)。

3.1.3.PCG

在猪胶原蛋白组(PCG)中,在每一个缺陷中都发现了猪胶原蛋白膜的存在,可能是由高度血管化的组织填充,第7天没有炎症浸润。血管化较少的组织也存在,并且观察到残肢新形成的骨组织区域。在第15天,在缺损的中心也有骨样组织斑点。在第30天和第60天,有大量新形成的骨组织夹杂着猪胶原蛋白膜的碎片,在一些标本中有缺陷完全闭合的迹象,而在另一些标本中,缺陷几乎闭合,没有膜残留物(见图)12)。

3.2.免疫组织化学分析

使用骨桥蛋白(OP)和骨钙素(OC)来评价骨矿化的阶段,评估关键缺损中心区域的免疫标记。OC是矿化最后阶段成骨细胞中观察到的标志物,表征着更成熟的骨组织,OP是骨细胞中观察到的阳性标志物;因此,它是未成熟/年轻骨组织的标志。

3.2.1.Osteocalcin-BCG

7天后,在残肢附近和缺损中心(在新形成的骨组织上以沉淀的形式)、骨细胞和结缔组织细胞上观察到骨钙素的中度阳性标记,表明可能存在成骨细胞活性。15天后,观察到骨钙素阳性标记的细胞外基质,从残肢向中心延伸,评分中等(根据前面描述的免疫组织化学评分系统)。30 d后观察骨小梁形成,骨钙素呈阳性,评分中等。60天后,观察到中等至强烈的免疫染色,显示骨成熟和缺损闭合(见图2)3.和表1)。


骨钙素 骨桥蛋白

BCG 7天 ++ ++
BCG 15天 ++ +
BCG 30天 ++ +
BCG 60天 +++ ++
PCG 7天 ++ ++
PCG 15天 ++ ++
PCG 30天 +++ +
PCG 60天 +++ +

3.2.2.Osteocalcin-PCG

在PCG中,在细胞外基质中观察到骨钙素的免疫染色,骨钙素评分中等。15天后,在细胞外基质中观察到该蛋白的免疫染色,评分中等。30和60天后,在细胞外基质中观察到轻度评分的免疫染色(见图)3.和表1)。

3.2.3.Osteopontin-BCG

7天和60天后,细胞外基质骨桥蛋白免疫染色呈阳性,评分中等。15、30 d后观察轻度免疫染色。

3.2.4.Osteopontin-PCG

7天后,可以观察到细胞外基质骨桥蛋白免疫染色阳性,评分中等,显示骨形成过程的开始。15天后,观察到该蛋白的中度免疫染色。30d和60d后,观察到该蛋白轻度免疫染色;这与骨成熟一致,在此期间,这种蛋白质的标记较少。

3.3.统计分析

所有试验均使用Sigma Plot 12.3统计程序(Systat Software, Inc., San Jose, CA, USA)进行。最初,将数据提交给正态性检验(Shapiro-Wilk),该检验不能识别同质数据( < 0.05);也就是说,测试失败。因此,采用Kruskal-Wallis检验,所有相互作用均显示统计学上显著的变化( < 0.05)。此外,为了准确识别统计变化,考虑到显著性水平为5%,应用了Tukey后验。

在骨修复时间演变的组织计量学评估(组内分析)中,实验组(BCG)在60天的骨新生面积比其他分析时期(7、15和30天)更大( < 0.05)。然而,30天与60天的骨形成差异无统计学意义( = 0.745)。与对照组比较,7 ~ 15 d时CG(阴性对照组)和PCG(阳性对照组)的结果相似( = 0.985),而在30至60天( = 0.422),只有将两个初始阶段与两个最终阶段进行比较( < 0.05)(见图4)。

PCG的AON值最高,在第30天和第60天相似( = 0.721)。在20世纪30年代,BC组和PC组之间也有相似之处。 = 0.762)和60天( = 0.980)(见表2)。


组×时间结果

7天 > 0.05(相似)
15天 > 0.05(相似)
30天 (bcg = pcg = 0.762)) > cg ( < 0.05)
60天 (bcg = pcg = 0.980)) > cg ( < 0.05)

4.讨论

GBR的主要目标是在关键缺陷区域获得具有足够体积和质量的新骨,具有高可预测性和低并发症风险。其次,采用GBR,手术次数少,患者发病率低,修复期短,效果好。众所周知,在过去的20年里,在技术和材料的发展方面取得了重大进展,使GBR以可预测的方式发生[3334]。

临界大小的骨缺损是指那些在动物的整个生命周期中不能自发再生的骨缺损,也就是说,没有生物材料或骨传导膜的帮助。因此,使用生物材料和/或自体移植物有助于骨修复,因此与仅使用血块的修复相比,这些修复将显著优于使用血块的修复[35]。根据几项研究,本研究中产生的骨缺损外径为8毫米,被认为是严重的[35- - - - - -37],并被本文提出的结果所证实,因为有可能通过组织学分析和组织计量学分析来验证,如果不进行干预,缺陷是无法修复的。因此,使用阴性对照组(无膜血块)旨在确定如何以标准方式进行修复;也就是说,骨的形成局限于缺损的边缘,而中心则充满了纤维结缔组织。

当我们添加一个机械屏障,即一层膜时,预计新形成的骨骼数量会增加,因此组织再生的面积会更大,与对照组相比,骨骼新生的面积会更大[9]。因此,我们想要评估GBR过程在不同膜之间是否发生不同,以及新形成骨的数量和/或质量是否不同。

目前,我们在市场上有各种各样的GBR膜。膜的选择必须基于临床需要,必须满足基本标准,如生物相容性、细胞闭塞性、组织整合性、空间形成和维持、易于操作、对并发症的易感性等[38- - - - - -41]。

胶原膜取自不同的动物组织(肌腱、皮肤和肠)、牛或猪[3842]。虽然胶原蛋白有许多优点,如低免疫原性、牙龈成纤维细胞的吸引力和生物相容性[4142],降解率很高,膜可能维持的时间不够长,无法进行足够的组织修复[38]。胶原膜的可预见性不仅取决于其组成,还取决于应用于胶原蛋白的化学和物理过程,以消除杂质,稳定纤维,从而提高其机械性能,降低胶原蛋白降解的速度[384142]。

根据本研究获得的结果,可以观察到PCG膜(Bio-Gide®)保持了高水平的性能,如文献[43- - - - - -46]。PCG中使用的膜具有基于纯猪源I型和III型胶原蛋白的组成,不含交联或化学添加剂,经过精制以去除抗原[47]。文献中描述的降解周期从8周不等[48]至4-6个月[474950]。在本研究中,通过形态学分析,在四个时期观察到膜的存在;没有观察到巨细胞的存在,也不可能观察到急性炎症反应。其吸收以肿块的形式发生,提示部分吸收(约8周)和骨组织渗透,可能是由于其高渗透性,允许血液渗透。30d和60d后缺损闭合较多,30d后获得的骨体积保持到60d修复过程结束[4349]。

卡介苗实验组使用的膜(Lumina-coat®)由从脱钙牛骨皮质中提取的I型胶原组成。BC组呈现纤维细胞结缔组织,在30天内仅检测到膜碎片,在60天内甚至更少。这些结果证实了Costa等人、Accorsi-Mendonca等人和bernab等人先前的研究,他们观察到,在30天,只有膜的碎片[35]或完全没有[3651]。

在PCG中,骨新生进展更明显。通过显微镜分析,与卡介苗相比,其吸收过程较慢。在30天内,BCG组在膜外表面观察到多核巨细胞,这表明该生物材料被重吸收,如先前报道[35]。这在60天的时间内得到证实,当时观察到少量残余的膜。

对比组织学,PC组骨新生面积比BC组大,这可能与该膜降解的性质直接相关:可以在后期观察到其存在,并伴有巨细胞的存在。尽管PCG中膜的降解速度更快,但膜加速了骨修复:30天后形成的骨的总体积保持到修复结束。牛胶原膜虽然在60天后仍有残余存在,但作为屏障的功能略低于PCG,因此允许结缔组织在缺损中心生长并抑制骨新生;因此,没有完整的骨新生物可以闭合缺损。

免疫组化评价显示BC组和PC组的生物学行为不同。PC组呈现了一些重要的细节,显示了更好的序列事件:骨桥蛋白在7天和15天后免疫染色更多,表明它们有更多的类骨组织存在,而在30天和60天后,骨桥蛋白仅轻微标记。正是在这个阶段,骨钙素增加了其活性,并表现为一种强烈的免疫标志物,因为成熟的骨组织已经存在。在BC组,骨桥蛋白在7天后出现轻度免疫染色,15天后出现中度免疫染色,这种状态一直维持到60天。这可能是由于膜水解和组织解体延迟骨成熟的区域。至于BC组的骨钙素标记,在初始阶段保持温和,并在第60天变得强烈,证实了组织测量结果。

本研究的主要障碍之一是缺乏先前使用本实验的牛胶原膜的工作,可能是由于其最近的商业化。本研究结果表明,该膜具有辅助GBR过程的潜力,与PCG相关的骨新生没有统计学差异,PCG是一种已经建立的膜,文献研究报道了其有效性。

5.结论

在采用的方法中,可以得出结论,本研究中研究的膜在大鼠颅骨关键缺陷的引导骨再生中促进了ROG。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据包含在文章中。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

作者感谢UNESP arapalatuba Dental of School的矿化组织研究实验室(LSMT) (FAPESP, 2016/12053-0)执行免疫组织化学分析。

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