六种新一代正畸丝细胞活性及化学成分的比较

摘要

正畸钢丝是由含有不同金属的合金制成的，包括镍。由于它们在患者中长期使用，因此在使用前评估它们的生物相容性非常重要。这在体外研究比较了Fantasia®、Tanzo®、FLI®、NT3®、DuoForce®和Gummetal®六种最新正畸丝的细胞毒性和化学成分。使用前一组是没有在口腔中使用的金属丝，使用后一组是在口腔中使用了两个月的金属丝。将金属丝与人牙龈成纤维细胞(HGF)接触72小时，用再蓝脲试验测定细胞毒性。通过光谱分析和扫描电子显微镜对其化学成分和表面表征进行了评价。两组比较采用方差分析和Kruskal-Wallis检验。只有FLI®钢丝产生36%的HGF活性降低( ）并呈现出较大的不规则性和聚合物结构的损失。使用后的电线显示了镍的百分比的显著降低和新元素(氧和碳)的出现。因此，可以得出结论，在本研究中没有发现有毒离子的释放。铑涂层导线比ptfe涂层导线更稳定，只有FLI®导线显示轻微的细胞毒性作用。

1.简介

目前，在正畸治疗中使用了几种不同金属合金的金属丝。固定正畸钢丝由不锈钢(SS)和镍钛(NiTi)制成，镍钛由铬、钴、镍和钛组成[1］．口腔内的化学和微生物条件有利于合金和涂层中的金属离子释放[2］．这些条件包括唾液的碱性性质、食物残渣形成的电解质、pH值的变化、机械作用和微生物区系[3.］．其中一些释放的金属元素可以调节引起炎症的免疫反应[4，过敏和全身反应[5，以及过敏[6］．除了过敏反应外，离子的释放甚至可能引起细胞毒性作用、诱变和致癌[7］．正畸用金属丝的生物相容性及其潜在毒性相关离子备受关注。这是一个关键问题，因为它们与口腔黏膜的长期接触和不同材料的潜在腐蚀[8］．在选择正畸钢丝时，对其成分、致敏性和毒性有充分的了解是很重要的。此外，由于大多数正畸医生购买的材料都是市面上可以买到的，不需要考虑其生物相容性，因此需要考虑材料、成分和制造过程的变化。必威2490

在众多具有形状记忆材料的合金中，含有NiTi的合金因其机械稳定性和生物功能性而成为正畸医生的首选[9］．目前，有几个创新的镍钛正畸弓可用，为正畸医生提供多种选择。其中一些新导线是超弹性镍钛导线、镍钛铜导线、钛铌导线和镀有铑或聚四氟乙烯的镍钛导线。

超弹性镍钛丝抗永久变形能力强，加载和卸载力一致，表面高度抛光[10］．

相反，根据制造商的说法，新的铜镍钛线保持了一致的加载和卸载力，因此弓每次都提供相同的可预测的性能，允许弓在口内工作更长时间。它们经过高度抛光，减少了摩擦和碎片的积累[11］．在镍钛合金中加入铜，改善了金属丝的热性能，同时仍然可以控制力。它能抵抗永久变形和温度变化[11］．

在铜镍钛热激活正畸弓中，铜提供的力比镍钛弓小。它还具有两个不同的强度区，因此可以从第一阶段的处理中使用矩形截面的拱，从而实现更快的三维控制[12］．

牙齿矫正治疗中对美观部件的需求增加;因此，用环氧树脂聚四氟乙烯(特氟龙)或铑涂层的电线已经被开发出来。这些镀有铑的电线反射率低，被宣传为不易被看见，改善美观，镀层还能抵抗美观层的剥落或开裂[13］．涂有聚四氟乙烯(PTFE或特氟龙)的电线已被发现是不反应的，无腐蚀性和抗剥落。此外，在处理过程中，它具有较低的摩擦水平[14］．

最后，β -钛合金结合了低值弹性模量和极高的硬度。这种合金的元素组成是钛-铌-钽-锆[9］．它的特点是超弹性，易于控制正畸强度，塑性变形没有任何扭曲，低摩擦。此外，由于重金属不含重金属，它们不会诱发毒性[9］．

由于这些金属丝最近已经商业化，文献中很少有证据表明它们在口腔中的生物相容性，以及由于在口腔中使用而导致的化学成分变化。因此，本研究旨在确定并比较6种最新一代正畸丝的化学成分，并评估其对人牙龈成纤维细胞活力的影响在体外．

2.材料与方法

2.1.测试材料

这是一个实验在体外该研究选取了六种近期上市的正畸钢丝:Fantasia Wire®(International Orthodontics Services IOS, Stafford VA, USA)、Tanzo®(American Orthodontics AO, Sheboygan WI, USA)、FLI®(Rocky Mountain Orthodontics RMO, Denver CO, USA)、NT3®(American Orthodontics AO, Sheboygan WI, USA)、DuoForce®(Forestadent Pforzheim, Germany)和Gummetal®(Rocky Mountain Orthodontics RMO, Denver CO, USA)(表1)1)．这些金属丝在正畸治疗的前两个月使用，一旦丢弃，就分析其化学成分和细胞毒性。

2.2.样本的收集和储存

我们从私人诊所收集了六种不同类型的金属丝。为了消毒，将获得的钢丝浸泡在0.5%的酶皂Bonzime (Laboratorios Eufar S.A, Bogotá Co.)中5分钟，用水冲洗，并在2%戊二醛(Sigma-Aldrich，武汉，中国)中保存3小时。最后，它们被用水重新清洗，用纸巾擦干，并储存在分别标有合金类型、尺寸、样品数量和日期的袋子里。

2.3.细胞毒性测试

使用从成人(HGF) (ATCC®PCS-201-018™)中获得的原代牙龈成纤维细胞。细胞以50000细胞/孔的速度接种于24孔板中。在杜尔贝科改良Eagle培养基(DMEM)中保存，添加10%胎牛血清(FCS)和1%青霉素/链霉素，在37°C的5%湿润CO中培养₂根据ISO 10993-5标准，在空气中维持72小时[15，直到他们达到约80%的统一度。

这些电线被分成两组。使用前一组包括未在口腔中使用过的导线，使用后一组包括使用了两个月的导线。总共评估了90根导线:使用前组30根导线(每根导线剪5刀)，使用后组60根导线(每种导线剪10刀)。每组使用不同数量的钢丝，因为组前钢丝被理解为在受控实验室条件下具有最小变异性的对照标本。作为细胞毒性阴性对照，使用未暴露于任何导线的细胞，作为阳性对照，使用Triton X-100处理HGF (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)。将导线切成1厘米长的片段，并与HGF接触72小时，如先前报道的那样[7］．随后，利用荧光法测定再蓝脲的细胞毒性。将钢丝置于细胞上72小时后，提取培养基，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗孔。随后,400μ从44的初始溶液开始，不添加10%的再青嘌呤(v/v)的DMEM培养基Lμ每孔加入M (Sigma-Aldrich, MO, USA)，在标准条件下孵育4小时，使再青嘌呤还原为再间苯磺酸[16］．在孵育期结束时，分别在激发波长和发射波长为535 nm和595 nm的条件下，在microplate reader (Infinite 200 PRO Tecan Männedorf，瑞士)中读取板。

由于只有代谢活跃的细胞才能导致这种减少，所以每孔中再间苯硫芬的数量与存活细胞的数量成正比。然后根据Ahrari等人的分类对细胞活力进行评分。[17]，如下:90%以上细胞活力，无细胞毒性(无);细胞活力60%-90%，细胞毒性轻微;细胞活力30%-59%，细胞毒性中等;而细胞活力低于30%，细胞毒性严重。

2.4.金属丝的化学成分和表面变化的评价

使用配备了x射线光子定量能谱(EDS)的扫描电子显微镜(SEM)对电线的表面降解进行了分析(JEOL - JSM-6490LV Peabody MA, USA)。其化学成分的变化是通过荧光光谱法和线材中各元素的能谱分析确定的。对所有线材的每一截面进行分析，最终的半定量化学成分与ZAF (Z=荧光)，产生导线中存在的每种元素的原子量百分比值。

2.5.统计分析

参数资料采用方差分析(ANOVA)进行统计解释，非参数资料采用Kruskal-Wallis检验进行组间比较分析。采用夏皮罗-威尔克斯检验检验数据分布的正态性。

曼-惠特尼测试用于确定哪些组之间有显著差异。类型1错误率使用Bonferroni校正进行调整。对两组(使用前和使用后)每种类型导线的细胞毒性作用和化学成分数据进行了比较t-test或Wilcoxon符号秩检验根据数据的分布。使用统计软件包STATA(统计软件:第14版)进行分析。College Station, StataCorp Cary, NC, USA)。利用x射线散射光谱(EDS)得到的数据进行了统计分析R(版本3.0.3,2014，智利)。一个 被认为具有统计学意义。

3.结果

3.1.正畸钢丝的细胞毒性作用

当比较在口腔中使用前后的活细胞数量时，所有被研究的金属丝的活力百分比都有最小的下降。NT3®、Tanzo®、DuoForce®、Gummetal®和Fantasia®的细胞毒性百分比分别为15%、8%、1%、2%和12%。然而，这种生存能力的降低在统计学上并不显著( )．只有FLI®钢丝显示了36%的细胞毒性效应，这在统计学上是显著的，对应于轻微的细胞毒性(图1和表2)．

3.2.化学成分的变化

在评估六种金属丝化学成分的变化时，发现NT3®金属丝中的碳(C)含量增加，从使用前的1.7%到使用后的18.5%不等。在同一组钢丝中，观察到钛(Ti)和镍(Ni)的减少，使用后组出现了6.2%的氧(O)(图2(一个))．在使用后的组中，Tanzo®金属丝的Ni和Ti含量减少了20%，C(15%)和O(5%)出现(图2 (b))．在DuoForce®电线中，测定了Ni和Ti的还原，与NT3®和Tanzo®电线中发现的相似。C元素(19.6%)和O元素(6.6%)在使用后组中出现，磷(P)、硫(S)和硅(Si)的比例较低(图2 (c))．

相反，FLI®足弓显示C从11.5%(使用前组)增加到23.3%(使用后组)。此外，观察到Ni, Si, O和Ti的显著减少(图2 (d))．

Gummetal®牙弓在使用后组中C(从5.5%增加到25.5%)和O(从8.1%增加到14.4%)显著增加，铌(Nb)和钛(Ti)显著减少(图)2 (e))．在Fantasia®拱门中，镍(44%)、钯(1.1%)和铑(3.2%)含量下降。C和O出现，使用后组仅Ti升高至33.1%(图2 (f))．

3.3.电线表面改变

在使用前的组中观察到平行线、裂缝和井。在使用后的那一组中，这种影响更深。此外，在NT3®中观察到与食物残渣或菌斑相容的暗区(图3(一个))， Tanzo®(图3 (b))和DuoForce®电线(图3 (c))．

在FLI®拱门中，观察到粗糙的表面与特氟龙涂层兼容(图3 (d))．在使用后，观察到该涂层的剥落。这导致菌斑或食物等物质在其表面积聚更多(图3 (d))．

在使用Gummetal®钢丝的组中，由于缺乏镍，观察到粗糙的表面。此外，非平行线加深观察在使用后组。在同一组中，观察到暗区，可能是由于斑块和食物残渣粘附在钢丝上(图3 (e))．

Fantasia®钢丝使用后表面粗糙，非平行线、裂纹和孔在使用前减少(图3 (f))．

4.讨论

本研究评估了六种弹性正牙弓丝的生物相容性，其中两种具有美观的涂层:涂有PTFE的FLI®线和涂有铑的Fantasia®线。使用HGF进行细胞活力测定来评估这些新的市售合金的生物相容性和细胞毒性行为，因为它们是临床暴露于正畸钢丝潜在毒性作用的主要口腔细胞之一[18］．

在进行细胞活力分析时，对比使用两个月前后未涂有美观涂层的金属丝，发现其存活细胞数量没有明显变化。

DuoForce®和Tanzo®钢丝在口腔内使用前后表现出相似的细胞活力。这些结果与David和Lobner等人的发现相似。[19]，他们评估了镍钛铜丝对小鼠神经元和神经胶质细胞的细胞毒性。虽然这些拱形结构中含有镍，但它们也含有钛，由于形成了一层被动膜，钛可以减少金属的释放，避免在细胞中产生毒性作用。暴露于Gummetal®丝的成纤维细胞的活力也没有受到影响。Niinomi等人也得到了类似的结果。[20.，同时评估β - ti - nb - ta- zr丝在7天和14天后对小鼠L929细胞的细胞毒性。然而，Rongo等人。21]在评估β -钛丝(TMA)时，在第1天和第7天发现了轻微的细胞毒性，但在第14天没有细胞毒性。

此外，对两种具有美观涂层的导线进行了评估:FLI®，一种镀有PTFE的铜镍钛导线和镀有铑的Fantasia®导线。在评估镀铑金属丝(Fantasia®)的细胞毒性时，如前所述，成纤维细胞的活力没有发生诱导变化[22］．

在评估的六种导线中，只有FLI®导线诱导细胞活力显著下降36%。根据Ahrari等人建立的分类，FLI®钢丝诱导的细胞活力降低对应于轻微的细胞毒性。2010 [17]，并考虑ISO 10993-5标准[23]，用于直接接触医疗设备的生物学评价，该评价指出，当细胞活力降低30%以上时，就被认为具有细胞毒性作用。朗戈等人。[21]确定了几种有和没有美观涂层的正畸电线的细胞毒性作用。作者评估了镀有来自Forestadent的Teflon Titanol Cosmetic®的NiTi线，发现在所有分析时间内HGF的活性都有轻微下降。这些结果与本研究的结果相似，考虑到FLI®钢丝也有PTFE涂层，随着在口腔中使用逐渐磨损，由于表面不规则，产生更多的离子释放和更多的斑块积累，如前所述[24］．Rongo等人的结论是，在实验条件下，所有NiTi美学拱形钢丝都具有轻微的细胞毒性，未涂层钢丝也是如此。因此，它们的临床使用可能与未涂层弓丝有类似的风险[21］．

然而，在目前的工作中，也评估了未涂覆镍钛(NT3)丝的细胞毒性效应72小时，没有发现在这段时间内细胞数量的显著变化。这些差异可能与细胞毒性评估方法和时间的差异有关，因为在Rongo等人的研究中，细胞毒性评估是在1、7、14和30天进行的。根据之前的结果，美丝与金属丝相似，具有轻微的细胞毒性，因此其临床应用是安全的[21］．

注意到这一点很重要在体外细胞毒性试验不能完全反映材料在口腔环境中的细胞毒性特性。众所周知，口腔黏膜通常比细胞培养物更能抵抗有毒物质，因为存在黏液蛋白和角蛋白层[17］．然而，细胞毒性测试允许在可用产品和信息之间进行比较，以选择具有最佳特性的材料。

暴露时间是细胞毒性试验的另一个重要参数。导线和HGF之间的直接接触测试类似于实际暴露在材料中的细胞，因为它会发生在活的有机体内．然而，文献报道的评价时间较短，如ISO10993-5:2009标准所建议的，在24 - 72 h之间[7]进行直接接触细胞毒性研究。很少有研究将分析时间延长到3天以上[15，21，25]这是由于更大的污染可能性、细胞融合、成本等等。因此，在本研究中，无法建立材料的细胞毒性与评价时间之间的相关性。

当两者之间存在直接联系时，很难建立直接联系在体外细胞毒性，但导线的使用确实会引起急性临床事件在活的有机体内．因此，临床研究中由于使用这种金属丝而导致的亚急性症状的评估，如舌炎、金属味、出血、炎症或牙龈肥厚，先前报道[26不应排除其他材料。

在本研究中，除了测定细胞毒性作用外，还评估了6根钛丝的化学成分变化和表面变化。正畸器具的细胞毒性与腐蚀过程中金属离子的释放有关。从生物材料中释放的物质，无论是通过合金的腐蚀或过氧化物的降解而释放的金属离子，都可能导致毒性、过敏和致突变性等不良影响。此外，暴露在离子中可能会限制细胞修复所需的恢复时间[27，28］．这些发现很重要，因为人们已经发现，由温度、唾液质量和数量、菌斑、pH值、蛋白质和食物中固体和液体的化学性质等因素引起的电化学攻击降解材料，可以启动腐蚀过程并诱导细胞毒性效应[29，30.］．其他研究表明，含氟和酸性环境，如面霜或漱口水产生的环境，会增加某些金属，特别是钛的易受腐蚀程度[31，32］．

在分析所研究的六种金属丝的化学成分时，通常确定它们在口腔中使用后组成元素的百分比减少。金属丝合金的生物降解可导致这种减少，因为口腔环境诱导了离子、热和微生物的有利变化，有利于离子在口腔中的释放[27］．腐蚀会使器具变粗糙，增加拱丝和槽之间的摩擦，并释放金属或合金离子，从而导致牙釉质和软组织变色、局部疼痛和易感患者的过敏反应[33］．镍和铬被认为是腐蚀产品中最重要的元素，因为它们能引起副作用。耐腐蚀是生物相容性的基本原则之一，取决于合金的类型、制造工艺和材料的表面特征[34］．本研究的结果表明，除了与无镍合金相对应的Gummetal钢丝外，在口腔中使用后，钢丝组中的镍含量显著减少。镍是引起接触性皮炎的最常见的金属，并诱发更多的过敏反应。作为现代正畸器具主要成分的镍含量可能从不锈钢的8%到镍钛合金的50%以上不等[35］．然而，在大多数在活的有机体内在评估生物液体中金属离子从正畸器具中释放的研究中，得出的结论是，某些元素的金属离子水平达不到日常饮食的正常摄入量[2］．尽管如此，牙科合金释放的无毒阳离子浓度也可能足以产生生物改变(例如，DNA合成或碱性磷酸酶活性)的可能性仍然存在[2］．

因此，抗腐蚀是正畸钢丝必不可少的，不仅因为释放的离子会产生细胞毒性和生物反应，还因为这会导致表面粗糙，严重限制了疲劳寿命和抗材料断裂能力。有些合金之所以耐腐蚀，是因为其固有的高贵性或形成了一层表面保护层[36］．

钛合金依赖于被动表面氧化膜的形成来抵抗腐蚀。然而，即使这些保护性氧化膜存在于金属表面，金属离子仍然可以被释放出来。不仅保护氧化层容易受到机械和化学破坏，而且当电线暴露在来自周围介质的氧气中时，氧化膜也会慢慢溶解[37］．

在这项工作中，我们观察到所有金属丝中都出现了氧和碳等新元素，这可能与金属的氧化过程有关。在口腔内使用后，金属丝中这些元素的存在，可能是由于食物残渣、菌斑的粘附，以及金属钝化的机制，即从环境中吸取氧气作为保护机制[28］．

在评估ptfe涂层导线的形态变化时，发现不规则，在口腔使用2个月后，聚合物结构丢失。这些结果与以往研究的结果相似[38报告称PTFE涂层的稳定性较差，因为收到的PTFE涂层美学拱形线的涂层层较制造商报告的薄。另一项研究[39]还报告说，与环氧树脂相比，ptfe涂层拱门钢丝在pH为6.75的人工唾液中浸泡28天后表面粗糙度最高。

在镍钛NT3®导线中，在使用前观察到平行线、裂纹和孔。这些发现与Puspitasari等人的报告相似。[40]，在人工唾液中浸泡的超弹性镍钛丝的表面形貌被发现具有纤维状表面。在NT3®导线组中，在口腔中使用后，我们发现深色区域与食物残渣或细菌斑块相容，也可能与点蚀有关。这与Puspitasari等人的报告相似。[40，用超弹性镍钛丝浸泡在人造唾液中。镍钛铜导线，Tanzo®和DuoForce®，与NT3®导线有相似的特性，在使用前在拱处呈线性分布，使用后有更高的粗糙度和压痕。在Fantasia®电线，非平行线，裂缝，和井观察到使用后在口腔。Asiry等人[22比较了环氧、PTFE和铑涂层，发现环氧涂层钢丝的表面粗糙度值最高，其次是PTFE钢丝。在表面粗糙度方面，镀铑的金属丝是最好的镀层金属丝，与未镀铑的金属丝相比。扫描电镜图像显示，在使用后，金属丝表面的PTFE涂层发生了显著的变化。此外，裂纹的存在代表了外部涂层的恶化。以往的研究[38]报道了PTFE涂层由于涂层层较薄，稳定性较差。此外，这种变质和涂层损失暴露了核心金属线，导致大量氢气的吸收，因为钛吸引氢气和不良的美观效果，如变色和破裂出现时，拱形线在临床上使用[37］．这就导致了必须考虑的机械性能的逐渐变化。

为了减少生物风险，牙医应选择具有最高生物相容性和最低腐蚀的合金。合金的选择应根据制造商提供的腐蚀和生物数据，或在对这些新材料的调查中获得的数据，逐案进行。在使用口腔后，只在FLI®钢丝中发现细胞活力的显著降低，更多的证据表明，由于其涂层的降解，表面的改变。虽然在食用后，金属丝的化学成分没有发生重大变化，但所有元素的水平和其他元素(如氧和碳)的出现都有所下降，这可能与饮食和金属钝化有关。

许多变量，如磨损[41，刷牙[42]和生物力学应力[43]会改变正畸钢丝和牙科材料表面的金属释放。因此，进一步的研究应该检查这些导致导线结构和细胞毒性变化的变量，如随着时间的推移，介质中金属离子浓度的增加或美观涂层的生物降解导致的物质的持续释放。此外，还需要对导线使用过程中导致美观涂层损失的因素进行研究。

本报告的局限性是对成纤维细胞的细胞毒性作用的评估时间，这使我们无法确定细胞长时间暴露于不同类型的金属丝是否会增加细胞毒性值。相反，导线成分的变化是在使用和美观涂层恶化后确定的;然而，必须进行研究，以确定什么因素可以导致这些导线结构的变化和细胞毒性。此外，有必要进行临床研究，以评估使用这些类型的弓丝进行正畸治疗的患者的金属离子浓度，考虑诸如磨损、刷牙和生物力学压力等变量。

5.结论

总之，本研究未观察到有毒离子的释放。在评估的6根导线中，只有FLI®导线具有轻微的细胞毒性。使用后，除了Gummetal®金属线外，所有金属线的Ni含量都显著降低。使用两个月后，导线上出现了C和O元素。铑涂层导线使用后比ptfe涂层导线更稳定。ptfe涂层导线在口腔使用两个月后显示出更大的不规则性和聚合物结构的损失。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据可根据要求从通讯作者处获得。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

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