凝胶蜂蜜和5-氟尿嘧啶对人腺癌结肠癌HT-29细胞体外毒性作用的研究

摘要

天然产物与化学药物的结合正在成为发现新的治疗方法以提高癌症治疗过程的趋势。在本研究中，我们旨在研究Gelam蜂蜜(GH)联合或不联合5-氟尿嘧啶(5-FU)对HT-29细胞的细胞毒性和凋亡诱导作用。用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑法测定细胞活力，以评估细胞毒性。通过倒置显微镜、Annexin V-FITC和流式细胞术分别检测细胞形态变化和细胞凋亡。我们的研究结果表明，与单独使用GH和5-FU相比，联合治疗对HT-29细胞具有显著的浓度依赖性细胞毒作用。流式细胞仪分析显示，联合治疗组早期凋亡事件更为明显。此外，与单独使用5-FU相比，GH和5-FU联合处理的HT-29细胞凋亡显示出DNA碎片百分比增加。我们的结果表明GH与5-FU在HT-29细胞系中具有协同的细胞毒作用在体外．虽然分子机制尚不清楚，但结果表明GH与5-FU的联合应用可能具有作为治疗药物的潜力。

1.简介

自古以来，蜂蜜就被当作一种日常营养补充剂来食用。它的主要成分是碳水化合物，如葡萄糖、果糖和蔗糖。蜜蜂从花朵上收集花粉，然后通过反刍和蒸发将它们转化为蜂蜜。马来西亚有几种蜂蜜，如蜂蜜、土朗蜂蜜和菠萝蜂蜜。所有这些都是根据它们的优势花粉量来区分的，这可以通过花粉分析来识别，因为花粉是种特异性的[1］．经科学证实，蜂蜜具有多种药用特性，如抗菌[2，3.]，抗氧化剂[4]，消炎[5]、抗肿瘤[6]，以及伤口愈合能力[7］．蜂蜜中的酚类化合物，如没食子酸、绿原酸、咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸、鞣花酸、槲皮素、橙皮素和白菊素，是蜂蜜抗炎和抗肿瘤作用的主要贡献者[6，8］．

在结直肠癌的初始治疗中，通常使用一种称为5-氟尿嘧啶(5-FU)的化疗药物。其主要机制除了抑制胸苷酸合成酶的功能外，还包括通过氟核苷酸错掺入序列而破坏DNA和RNA的正常功能[9］．然而，据报道，由于5-FU在肝脏中被双嘧啶脱氢酶(DPD)降解，其在细胞内的可用性较低。因此，在治疗期间需要大剂量[10］．高剂量的这种药物除了对人体有很大毒性外，还会对患者产生严重的副作用。过去的研究发现，将这种药物与蜂蜜等天然物质结合使用，可以增强其对癌细胞的作用，并将毒性降至最低。11］．与单独使用5-FU治疗不同，GH联合使用5-FU已被证明可显著降低HCT-116细胞的生长[12］．此外，GH +生姜提取物在上调caspase-9表达方面对HT-29细胞具有协同作用[13］．

本研究使用Gelam蜂蜜、5-氟尿嘧啶及其组合对HT-29细胞的细胞毒作用和凋亡作用。观察膜完整性、DNA碎片和细胞凋亡早期事件的变化。这些都有助于建立未来治疗结直肠癌的新策略。

2.材料与方法

2.1.蜂蜜样品

本研究中使用的Gelam蜂蜜来自马来西亚登嘉楼市Besut的Gelam森林。将蜂蜜与RPMI-1640培养基混合，用0.22-过滤杀菌，制备蜂蜜原液μM注射器过滤器。本研究中使用的Gelam蜂蜜已经过认可实验室的测试，并确认为纯蜂蜜。

2.2.细胞系

人结直肠腺癌HT-29细胞来自美国组织培养收藏(Manassas, VA, USA)。细胞在RPMI-1640培养基(Sigma, St. Louis, USA)中培养，添加10%胎牛血清(GIBCO, USA)和抗生素(即100.0单位/mL青霉素和100.0单位/mL青霉素)μg/mL链霉素)(PAA，奥地利)。在37°C和5% CO的培养箱中保存₂以及潮湿的环境。HT-29细胞每2 - 3天在半流动条件下进行传代培养，其中用胰样酶和酚红(GIBCO, USA)处理5分钟。然后将细胞重新悬浮在含有血清的培养基中，然后转移到2或3个新的烧瓶中。在整个研究过程中，细胞活力为95%及以上的样本被选择使用。

2.3.MTT细胞毒性试验

如Ali等所述，MTT检测在96孔板中进行。[14］．100.0μ将L完整的生长培养基放入96平底微量滴度板(Nunclon, USA)。随后又增加了100.0μL HT-29细胞在1-2 × 10浓度⁵细胞/mL，使用前已播种24小时。蜂蜜样品(400 mg/ml)在RPMI-1640培养基中分三份连续稀释倒入孔中。未处理的细胞作为对照。培养皿在CO中孵育72 h₂37°C恒温箱。孵育后，20.0μ每孔加入1 L MTT溶液(5.0 mg/mL)，继续孵育4 h，然后从孔中取出培养基，100.0μ每孔加入一升二甲基亚砜(DMSO)，使所得的甲马甲溶解[15］．使用平板阅读器(BIOTEK，美国)在570nm处分析井的光密度(OD)，并在630nm处进行参考。随后绘制了细胞活力与样品浓度的剂量-反应曲线。

2.4.吖啶橙与碘化丙啶染色(AO/PI)分析

HT-29细胞分别用GH、5-FU和两者的组合处理24、48和72 h。孵育24 h后，将细胞收集到离心管中，以300 × g压球10 min。按上述方法用PBS离心清洗细胞球。然后将颗粒悬浮在50.0μL吖啶橙(10.0μg/mL)和50.0μL碘化丙啶(10.0μg/mL)静置5分钟μ将L染色细胞移液管移到玻片上并用盖片覆盖。Ali等人描述，使用倒置荧光显微镜(Nikon TE2000-U, Nikon, Japan)对100多个细胞群中的存活细胞、凋亡细胞和坏死细胞进行评分。[16］

2.5.磷脂酰丝氨酸外化的流式细胞仪分析

采用细胞凋亡检测试剂盒(BD Annexin V-FITC)进行流式细胞分析。该试剂盒包含Annexin V与氟铬FITC、碘化丙啶和结合缓冲液。HT-29细胞(2 × 10⁵细胞/mL)分别用GH、5-FU和两者的组合在6孔中处理3,6,12 h。处理完成后，将细胞收集到5 mL试管中，在摆动转子中以300 × g的速度离心10分钟。细胞颗粒用PBS清洗两次，然后100μ在试管中加入L的结合缓冲液。体积为5μ附件V FITC的l和5μ将1 / l的PI作为染色液加入试管中。然后将混合物在黑暗中孵育15分钟。随后又增加了400人μL的绑定缓冲液到每个管。在使用CytoFLEX流式细胞仪(Beckman Coulter, USA)分析之前，将管子轻轻旋转。大约10,000个事件被相应地分为存活、早期凋亡、晚期凋亡和坏死细胞阶段[17，18］．

2.6.末端脱氧核苷酸转移酶dUTP镍端标记(TUNEL)分析DNA片段

TUNEL检测使用APODIRECT™Kit，按照制造商的方案(Becton Dickinson, USA)进行。细胞浓度为1 × 10⁶细胞/mL在1% (w/v)多聚甲醛和PBS (pH 7.4)中固定在冰上60分钟。然后用300 × g离心5分钟将细胞制成颗粒，然后用5 mL PBS洗涤两次。然后将细胞在70% (v/v)的冰冷乙醇中重悬，并在-20°C保存1周。孵育后，除去乙醇，用洗涤缓冲液清洗细胞两次。然后对细胞进行末端标记，在50℃内孵育μl DNA标记液(含有TdT酶和FITC dUTP溶解在反应缓冲液中)在37°C下浸泡60分钟。孵育后，细胞在1 mL漂洗缓冲液中洗涤两次，然后用0.5 mL PI/RNase染色缓冲液染色。染色过程在黑暗环境中进行30分钟。之后，使用CytExpert软件在CytoFLEX (Beckman Coulter, USA)对细胞进行分析。

2.7.统计分析

数值参数以均数±标准误差均数(S.E.M.)表示。所有实验均重复三次，采用单向方差分析(ANOVA)进行分析，然后进行Tukey事后检验。p≤0.05为置信水平，认为有统计学意义。

3.结果

3.1.凝胶蜂蜜、5-氟尿嘧啶及其组合对HT-29细胞和正常结肠细胞的细胞毒性

用MTT法检测Gelam蜂蜜对HT-29细胞的细胞毒性。测定得到的甲马甲蓝的光密度，反映活细胞中线粒体脱氢酶的正常功能[15］．GH、5-FU和它们的组合在72小时后的毒性程度(相对于未处理的细胞)，根据它们各自的浓度将细胞群减少到50% (CD₅₀)．Gelam蜂蜜降低了CD中HT-29存活细胞的数量₅₀36.2毫克/毫升。同时，CD₅₀5-FU的含量为15.5μ克/毫升(图1)．从结果来看，CD₂₅和CD₇₅为6.25μG /ml和227.4μ分别g / ml。乳糜泻的组合₅₀用三种不同浓度的GH (CD₂₅、CD₅₀、CD₇₅)降低了CD₅₀GH的含量分别为30.4 mg/ml、13.2 mg/ml和2.4 mg/ml(图2)．GH和5-FU的细胞毒性也在正常结肠细胞系CCD-18Co上进行了测试。CD₅₀cd - 18co细胞GH值为89.8 mg/ml。同时CD₅₀5-FU在CCD-18Co细胞中的含量为203.1μ克/毫升(图3.)．因此，36.2 mg/ml GH与15.5μg/ml 5-FU均低于CD，因此选择5-FU₅₀GH和5-FU在正常结肠细胞中的值。通过计算组合指数来确定GH与5-FU组合的协同活性[19］．得到的联合指数(CI)分析值小于1，说明GH与5-FU之间存在协同作用。CD₅₀GH, 5-FU的值及其组合(均在CD₅₀浓度)用于本研究后续的每项测定。

3.2.吖啶橙和碘化丙啶双染色细胞死亡模式

对细胞进行形态学评估(使用吖啶橙和碘化丙啶)，以确定处理HT-29细胞在CD时的死亡模式₅₀剂量。如图所示4， GH处理后凋亡细胞数量显著增加，由24 h时的20.67%增加到48h时的34.67%，72 h时的41.03%。同样，阳性对照(5-FU处理的细胞)，24 h时的相应值为7.67%，48h时的相应值为22.02%，72 h时的相应值为23.01%。GH + 5-FU联合处理时的凋亡细胞比例最高，24 h时为25.33%，48h时为33.05%，72 h时为46.67%。各处理组坏死细胞比例较低，与未处理组无显著差异。

3.3.早期凋亡事件中的磷脂酰丝氨酸外化分析

磷脂酰丝氨酸外化是细胞凋亡的早期事件，可通过Annexin V和PI染色进行评估。在这项研究中，我们发现在CD治疗3小时内，所有组都检测到细胞凋亡的早期事件₅₀剂量(数据6而且7)．对于gh处理的标本，3 h时早期凋亡事件的百分比为4.66%，6 h时为6.20%，12 h时为12.31%。晚期事件的百分比在3 h时为4.5%，6 h时为3.85%，12 h时为10.16%。gh处理的标本中未检测到坏死事件。对5- fu处理过的样品进行了类似的测量。早期凋亡事件的百分比5-FU-treated标本随着时间的增加(6.66%,3 h, 8.11%在6 h,在12 h)和16.56%。然而,有较低的百分比的凋亡事件5-FU-treated标本相比GH-treated组(4.41%,3 h, 6 h, 3.05%和6.79%在12 h)。得到了更高的凋亡细胞百分比的总和(GH +研究者用)治疗组和GH或研究者用孤独。在联合治疗中，3 h时早期凋亡事件的百分比为7.51%，6 h时为9.37%，12h时为18.64%。

3.4.DNA碎片分析:标志性细胞凋亡检测

DNA碎片是细胞凋亡的标志性事件之一。使用TUNEL法对细胞内DNA片段进行定量评估。处理24 h后，所有处理组HT-29细胞内DNA开始发生裂解(GH处理组为4.44%，5-FU处理组为4.21%，GH + 5-FU联合处理组为71.67%)。数字8显示GH + 5-FU联合治疗组tunel阳性细胞百分比显著增加(48 h后为92.49%，72 h后为94.90%)₅₀剂量随时间增加tunel阳性细胞的百分比。相比之下，对照组在整个治疗期间DNA切割的发生率非常低(小于0.3%)。这说明在健康的HT-29细胞中，DNA断裂并不是正常的现象，这可能是GH和5-FU的细胞毒性所致。

4.讨论

在过去的几年中，使用传统药物进行癌症化学预防和治疗在全球范围内获得了大量的研究关注。在本研究中，研究了凝胶蜂蜜(GH)与5-氟尿嘧啶(5-FU)合用或不合用对HT-29细胞的细胞毒性和凋亡诱导作用。细胞毒作用结果显示GH具有降低HT-29细胞活力的能力，且联合治疗较GH和5-FU单独治疗的细胞毒剂量呈时间和剂量依赖性降低。结果还表明GH和5-FU对HT-29细胞生长的改变具有协同作用，并采用Chou-Talalay方法定量分析[19］．既往研究表明，生长激素中含有大量的总酚类化合物，这与生长激素的生物活性密切相关[20.］．研究还发现，蜂蜜中的酚类化合物直接有助于降低结肠癌细胞的活力[21］．在正常的结肠细胞中没有发现类似的效果，这表明GH活性是细胞依赖性的，因此有可能与5-FU联合用作结肠癌治疗的替代方案。5-FU是一种知名药物，广泛应用于结肠化疗。已经建立了许多策略来提高5-FU的活性，其中之一是使用联合疗法[22- - - - - -24］．在常见的临床实践中，5-FU与亮色林、伊立替康或奥沙利铂联合使用已显示出该药物活性的改善[25然而，与5-FU相关的副作用可能会阻碍治疗癌症患者的努力[26］．为了强调GH可能增强5-FU活性的假设，Hakim等人发起的GH与5-FU的联合研究表明GH可能是与5-FU协同作用的潜在候选[12］．然而，对其潜在价值的发现还不够，需要获得更多的数据来揭示其益处。据我们所知，迄今为止没有实验证据表明Gelam蜂蜜和5-FU分别与诱导HT-29细胞凋亡有关。然而，单独对吉兰蜂蜜生物活性的研究正在加紧进行。Gelam蜂蜜是一种著名的突出物质，价格便宜，相对无毒，在市场上很容易买到。此外，关于蜂蜜的起源，自古以来就有人使用。Gelam蜂蜜被认为是一种潜在的癌症疗法，能够降低各种癌细胞系的活力，如MCF-7、HCT-116、HepG2、A549和HT-29 [12，27- - - - - -30.］．

许多体外和体内研究表明，单独生长激素对经生长激素治疗的癌细胞具有显著的抗增殖和凋亡作用[13，27，28，30.，31］．在癌细胞中，诱导细胞凋亡是一种有效的癌症治疗策略。细胞凋亡是一种程序性的细胞死亡，是细胞死亡领域的焦点，涉及内在(线粒体依赖)或外在(死亡受体依赖)途径[32- - - - - -34］．在细胞凋亡早期，磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内表面转位到细胞膜外[35，36］．我们证明磷脂酰丝氨酸(PS)早在HT-29细胞暴露于处理后3小时就发生了易位。有趣的是，联合治疗显示最高百分比的PS在细胞中易位。尽管PS易位在可逆过程中已被报道[37]，我们的形态学检查显示，与单一处理相比，联合处理的细胞出现泡疱特征，细胞数量增加(图5)．证实HT-29细胞发生凋亡，且不可逆。此外，我们的DNA片段分析结果显示GH和5-FU的结合增加了HT-29细胞的DNA片段。DNA片段化是细胞凋亡途径的晚期过程之一[38，39］．总的来说，这些发现进一步支持了GH和5-FU的细胞毒作用以及两者的组合以时间依赖的方式诱导HT-29细胞凋亡的观点。

5.结论

总之，GH和5-FU联合对人结直肠癌HT-29细胞的细胞毒作用和凋亡作用具有协同结果。5-FU和GH对HT-29细胞的协同作用值得进一步研究HT-29细胞的分子机制，重点应放在分子相互作用上，以明确GH在哪个途径增强5-FU的疗效。

数据可用性

用于支持这项研究结果的数据包含在文章中。

利益冲突

作者声明，本文的发表不存在任何利益冲突。

致谢

作者要感谢苏丹Zainal Abidin大学生物资源和食品工业学院;马来西亚登嘉楼大学基础科学学院;马来西亚伊斯兰大学为该项目提供技术和资金支持，马来西亚教育部为博士奖学金提供支持。

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