阿司匹林降低成骨介质和Wnt信号操纵诱导的成体主动脉瓣间质细胞矿化在体外

摘要

在世界范围内，钙化主动脉瓣疾病是心脏异常患者发病和死亡的主要原因之一。主动脉瓣矿化和钙化是成人钙化主动脉瓣病变表现和功能不全的关键事件。由于严重的矿化和钙化，成人主动脉瓣尖部呈散乱的分层，伴钙化结节沉积，严重损害成人瓣膜功能。有趣的是，在发育过程中，骨形成细胞和心脏瓣膜细胞之间发现了共享的基因调控途径。Asporin是一种富含亮氨酸的小蛋白聚糖(43 kDa)，在牙周韧带细胞中抑制矿化，也在正常小鼠成年主动脉瓣小叶中检测到，但功能未知。因此，为了了解Asporin在主动脉尖矿化和钙化中的作用，我们建立了成体禽主动脉瓣间质细胞培养体系，并成功诱导这些细胞成骨。诱导成骨后，表达降低Asporin与没有成骨诱导的细胞相比，检测到mRNA和骨和成骨标记物的表达增加。重要的是，人重组Asporin蛋白治疗降低了成骨介质诱导的主动脉瓣间质细胞的矿化水平，同时伴有Wnt/水平的降低β连环蛋白信号。总的来说，所有这些数据都高度表明Asporin这可能是一种新的生物分子靶点，用于治疗钙化主动脉瓣疾病，而不是目前的尖状瓣膜置换术。

1.简介

心脏疾病常与成人主动脉瓣尖结构和功能不全有关[1，2］．其主要特征是主动脉瓣矿化，然后是钙化和随后的功能障碍，在人类中有严重的发病率和死亡率[3.，4］．根据世界卫生组织的数据，2017年估计有1790万人(31%)死于不同的心血管疾病。钙化主动脉瓣疾病(CAVD)的患病率约占所有类型心血管疾病的5-25%。大量的研究工作都是为了更好地理解CAVD的机制。CAVD预计约占全球人口的13%，并持续成为全球严重的健康问题。在65岁以上的人群中，大约25%的人患CAVD的风险增加。人类CAVD的特征是由于遗传和各种环境因素导致的主动脉瓣尖钙盐积累，严重损害了瓣膜功能[5- - - - - -7］．

在成人心脏瓣膜发生过程中，流出道(OFT)垫层的胚胎心内膜细胞分化形成成熟的、分层的、三层的主动脉瓣尖[8］．在这一发育过程中，心内膜垫层的高度增殖、迁移和未分化的细胞产生了具有分层细胞外基质(ECM)的成熟主动脉瓣[9，10］．成熟瓣膜小叶分层为富含弹性蛋白的房/室、富含蛋白聚糖的海绵状组织和高度组织的富含胶原纤维的纤维组织[5］．CAVD主要与纤维瘤中三叶结构和ECM成分的完全紊乱和无组织有关。据报道，与骨和软骨发育相关的基因表达也在CAVD患者中升高[11］．先前的报道表明，发育中的心脏瓣膜和骨形成细胞之间存在共同的基因调控途径[12］．瓣膜细胞有两种不同的类型，即瓣膜内皮细胞(VECs)和瓣膜间质细胞(VICs) [13］．这些vic有可能在几种病理线索下分化为成骨前细胞，但机制相对未知。

Asporin，又称牙周韧带相关蛋白1 (PLAP1)，是ECM蛋白中富含亮氨酸的小蛋白多糖(SLRP)家族的一员[14，15］．此前，有报道称Asporin在小鼠和人类组织中表达，包括骨关节炎关节软骨、主动脉、子宫、心脏和肝脏[12，15- - - - - -17］．此外，最近的报道显示强烈的表达Asporin成年小鼠主动脉瓣小叶中的mRNA，尽管没有任何功能相关性[12］．它通过与Bmp受体竞争性结合抑制骨形态发生蛋白2 (BMP2)-Smad/1/5/8信号通路，在骨细胞钙化过程中发挥重要的负调控作用，从而降低牙周细胞的钙化水平[16］．Wnt /β-连环蛋白信号在胚胎发育中有多种多样的作用，包括心脏和骨骼的形成。重要的是，据报道，Wnt/β-catenin通路特异性基因在CAVD期间增加并促进成骨[18］．主动脉瓣矿化的依赖性调节伴随着原钙性Wnt/的表达β-catenin信号在此之前还没有得到很好的研究，特别是在成人钙化主动脉瓣疾病或CAVD的情况下。因此，研究两者之间的调节机制Asporin和Wnt /β-catenin信号通路在瓣膜矿化过程中可能值得在CAVD治疗的范围内探索。

在这篇报道中，我们首次证明了asporin介导的矿化水平抑制培养成骨的成体禽主动脉瓣间质细胞(AVICs)。此外，我们的数据还表明，在诱导成骨的培养AVICs中，Asporin在矿化和钙化促进途径上游的作用是活跃的。

2.材料与方法

2.1.鸟类心脏收藏

在指定胚胎时间点的受精鸡胚胎从当地政府注册的孵化场(西孟加拉邦加尔各答Tollygunge国家家禽农场)获得，成年鸡心脏从当地屠宰场获得。使用的特定鸟类品种是家养的Gallus Gallus(罗得岛红黑澳洲)[19］．重要的是，不需要动物伦理/使用批准，因为总统大学不以繁殖为目的饲养动物。尽管所有受精卵和成年心脏的采购都是按照总统大学的采购准则进行的。

2.2.RNA分离与逆转录酶PCR

从解剖和堆积的组织中分离总RNA，这些组织包括10-12个胚胎日5.0 (E5) OFT垫层组织、成体心室组织、5-6个成体主动脉尖，每个病例使用200只禽类实验组μl Trizol (Invitrogen, 15596026)。然后2μg总RNA用Bio-Rad试剂盒(iScript™reverse Transcription Supermix for RT, 170-884)反转录cDNA合成μ根据制造商提供的协议，为总容积的L。总RNA也从瓣膜间质细胞(VIC)培养使用200分离μl试剂盒。然后合成cDNA，取1μg的RNA逆转录Supermix。20例进行RT-PCRμl的总体积使用DNA Taq聚合酶(Bioline, BIOTAQ DNA聚合酶BIO-21040)。这些PCR使用表中提到的20 pmol以下引物对(IDT)进行35个循环1．对各引物组进行标准化和优化，为检测最佳退火温度，进行梯度PCR反应，详见附图我．

2.3.实时定量PCR (qRT-PCR)分析

采用实时定量PCR (Quantitative real-time PCR, qRT-PCR)定量检测基因表达变化。在这里，我们还展示了三种必需基因引物的引物效率(Asporin，β连环蛋白,纤连蛋白)，在我们的数据分析中广泛使用。我们已经遵循Qiagen指南来获得针对cDNA靶标的引物对的“效率和斜率”[20.］．对于cDNA的合成，我们取1μg的模板RNA。然后用无核酸酶水按1:1、1:10、1:100、1:1000、1:10000顺序依次稀释cDNA。然后，用cDNA稀释度和Cq值的对数绘制标准曲线(补充图)2)．从标准曲线来看，斜率( ）计算，效率由公式确定: ．

10例进行实时荧光定量PCRμl采用Bio-Rad实时PCR试剂盒(SSO快速Eva绿色超级混合，172-52 03AP)，按照之前的标准化协议检测总体积[19］．基因表达水平由Bio-Rad CFX管理软件得到的Cq值确定β肌动蛋白表达式。每个qRT-PCR结果均代表生物学和技术上的三份副本( )．对培养的禽类瓣膜间质细胞(AVICs)，根据实验产生的Cq值计算出的fold change的增加或减少来分析基因表达Cq和Cq。用Student 's对观察到的差异进行统计学意义计算 -测试和被认为是重要的 值。

2.4.成年鸡主动脉瓣间质细胞(AVIC)培养及成骨诱导

以成年鸡心脏主动脉瓣尖为材料，建立了原发性主动脉瓣间质细胞(AVICs)。按照标准化方案分离这些细胞，并在胶原蛋白涂层板和载玻片上培养，如其他人先前所述[9］．简单地说，从主动脉基部区域找到成人瓣小叶，并根据需要使用精细的镊子和剪刀进行解剖。随后，在棉签的帮助下，从解剖的尖上刮出上层VECs层。接下来，将牙尖外植，用含有M199培养基(Invitrogen, 11150-059)和1%青霉素/链霉素(Pen-Strep)鸡尾酒(Invitrogen, 15140122)的胶原酶II (Sigma 234153)在37°C进行处理， 在摇动的水浴中浸泡几分钟[9］．从7-8阀中分离的上清液以800转/分的速度离心5分钟，将颗粒重悬于3ml含M199培养基+10%胎牛血清(FBS)和1% Pen-Strep的完整M199培养基中。最后的细胞悬液经尼龙网(国产)筛分，镀于0.01% collagen- (collagen I rat tail-， 3mg /ml, A10483-01)含有完整M199培养基的涂布板上，培养2-5天。建立后，进一步使用无任何污染的AVIC外植体进行所有实验。

为了研究成骨基因诱导，培养的细胞用含完整M199培养基的成骨培养基处理，β-甘油磷酸(10mm)， l -抗坏血酸(10nm)，地塞米松(0.1μM)如前所述[9］．在VICs培养3天后加入成骨诱导培养基，并在健康状态下保持最多4天(96小时)的治疗。

2.5.培养成人禽瓣膜性间质细胞(AVICs)中激活剂和抑制剂的测定

为了补充培养AVICs中的Asporin蛋白，直接用重组人Asporin蛋白(150ng /ml;Abcam 132382)在OS诱导介质中放置24小时4天。对于典型的Wnt信号通路操作，用重组人Wnt3A (rhWnt3A)蛋白(150 ng/ml;Abcam ab81484) 24小时后激活Wnt信号，进行激活试验。同样，用Xav939处理培养细胞24小时(2μM;Abcam ab120897)用于Wnt信号抑制试验[19，21］．在所有处理完成后，进行实验，进行总RNA分离以定量分析mRNA表达，或进行细胞固定以进行免疫染色。此外，还进行了定性和定量茜素红染色，以比较处理细胞与未处理对照组的矿化情况( )．

2.6.疣状

将AVIC外植体在1%多聚甲醛中固定3分钟，然后再用4%多聚甲醛固定10分钟(Affymetrix, 19943)，并用1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)和PBST溶液(PBS+0.01% tween 20)洗涤。然后根据抗体制造商提供的方案进行免疫染色。以下抗体用于免疫荧光(IF):抗asporin(1:500稀释，Abcam ab154404)和抗α-Sma(1:40 0稀释，赛默飞世尔科学，14-9760-82)。应用兔多克隆二抗(Goat anti-Rabbit IgG H&L, Alexafluor 488, ab150077)对抗Asporin一抗。所有一抗在4°C下孵育过夜。所有细胞核用DAPI染色(SRL, 18668)。作为阴性对照，培养的avic只与二抗孵育，而不与一抗孵育。

2.7.蛋白质分离和蛋白印迹

根据制造商说明，使用含有蛋白酶抑制剂混合物(Genetix GX2811AR)和磷酸酶抑制剂混合物(Genetix GX0211AR)的冰冷RIPA裂解缓冲液(250 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7.5, 0.1% SDS, 1% Triton X和5 mM EDTA)从VICs中分离蛋白裂解物。如前所述进行Western blot (Evans-Anderson et al.， 2008)，并用二抗(1:40 00;Abcam ab97051)。免疫印迹采用Clarity Western ECL Substrate试剂(Bio-Rad 1705060)进行化学荧光检测，并使用ChemiDoc MP (Bio-Rad)进行扫描。用ImageJ软件(NIH)量化信号强度。阿司匹林的稀释度为2.5μg/ml (Abcam, ab58741)。Gapdh (1: 2000;BioBharati, BB-AB0060)抗体反应性作为加载对照。用Student 's来确定统计学意义 -测试( )．

2.8.亮场和荧光显微术

所有光镜图像均使用倒置显微镜和相机(尼康SMZ800)拍摄。培养中的AVICs也在明亮场中使用倒置显微镜(蔡司)成像。对于免疫染色切片，使用显微镜(蔡司实验室、流感显微镜和徕卡荧光显微镜)检测荧光，并使用蔡司软件捕获图像:ISC捕获和徕卡软件，LAS X。

2.9.茜素红S染色

茜素红S染色时，用1X冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞，用4%多聚甲醛在PBS中4℃固定45分钟。定性染色使用2%茜素红S (Sigma)溶液，定量分析使用40 mM茜素红S溶液[5］．细胞固定后，用新鲜制备的2%茜素染色30分钟。然后用蒸馏水(dH₂O) 2-3次，每次2分钟，风干。使用LAS X软件(徕卡)拍摄数字亮场图像。

另一方面，固定细胞用新鲜制备的40 mM茜素红S染色30-40分钟，在室温下轻轻摇动。用于定量分析，800μ用L 10%的乙酸(每个60mm细胞板)在室温下培养固定细胞30分钟。然后，使用细胞刮板将细胞悬液收集到新鲜的1.5 ml微量离心管中。然后将这些样品涡旋30秒，然后在85°C下加热10分钟。之后，样品在20000 g下离心20分钟。然后,500年μ每种上清液各取L，取200μ在每根管中加入10%的氢氧化铵以中和酸。pH值在4.1 ~ 4.5之间。最后，将制备的样品溶液在96个孔板(150μL每个)为吸光度。使用Gene5软件(BioTek, microplate reader)对对照组和os诱导的样品进行OD值测定。然后用Student 's计算最终的定量差值 -测试和被认为是重要的 值, ［22］．

2.10.考马斯蓝染色

为了观察和捕捉培养中分离的成年禽瓣间质细胞(AVICs)的形态，培养4天后用考马斯亮蓝染色。用1X PBS清洗培养细胞一次，用考马斯亮蓝溶液孵育30-40分钟。然后用dH清洗考马斯蓝污渍₂O 2-3次，风干后再成像。然后用倒置显微镜(蔡司)捕捉亮场图像。

2.11.统计分析

为了获得qRT-PCR数据中基因表达的所有折叠变化，我们使用周期阈值(CT)值对所有独立实验的生物和技术重复的三次归一化表达进行了分析。我们已经申请了学生申请 -检验，具体为(双侧)双尾检验，观察统计学意义( )．

接下来，对于Asporin免疫染色实验，取所有计数值，生成每组实验的百分比后，绘制图形。总体而言，所有统计分析报告均采用Student’s的平均标准误差(SEM) -测试( )．

在茜素定量分析中，OD(光密度)值被认为是茜素红染色细胞溶液的吸光度，用于统计分析。在这里，我们也应用了学生的 -测试并考虑了显著的褶皱变化 值。

2.12.细胞活力测定

重组孢素蛋白(rhAsp)处理后，通过计数DAPI染色的细胞核来测定细胞活力。为此，我们用以下公式计算了活细胞(DAPI阳性细胞)的百分比: ．

3.结果

3.1.成人禽瓣间质细胞的建立与鉴定及标记基因表达分析

先前的一些报道已经确定，培养的主动脉瓣间质细胞(AVICs)发生成骨细胞分化，导致AVICs矿化和随后的钙化[3.，7，23］．已经收集了成年鸟类的整个心脏，并从每个样本中解剖出三个主动脉瓣尖。接下来，从主动脉三尖分离出中航栓塞并进行培养。亮区图像显示主动脉基部有三个细而明显的尖点(图中箭头所示)1(一))．按照方法一节中提到的标准化协议，中航工业集团的主要文化已经成功建立。在播种48-72小时后，细胞开始生长并显示出明显的、清晰的丝状形态。明场显微图像显示AVICs具有明确的纺锤状形态(图中箭头)1 (b))．接下来，用考马斯亮蓝染色进一步在高倍放大倍率下显示更清晰的AVICs形态(图中箭头所示)1 (c))．为了进一步鉴定分离的AVICs，对其进行免疫染色α-Sma抗体是已知的VIC标记物，已检测到强表达，如图所示1 (d)- - - - - -1 (f)(箭头)。培养4-5天后，健康的avic被用于进一步的实验。

选择性标记基因表达已确定，以验证AVICs分离。数字1 (g)从培养的AVICs中分离出的标记基因mRNA水平，与从用于分离AVICs的成年禽心脏中分离出的左心室组织相比。我们对avic特异性标记(纤连蛋白而且Sm22α)，Asporin作为我们感兴趣的分子，以及心肌细胞(CM)特异性标记(Myh7而且Gata4)，利用逆转录酶PCR (RT-PCR)对分离的成鸟心脏AVICs和心室(VEN)组织进行扩增(图1 (g))．两者都是1μg的总RNA被用作模板，合成特定的cdna进行逆转录酶PCR分析。两个中航工业标志(纤连蛋白而且Sm22α与VEN组织相比，AVICs中表达增加。还有，意义的表达Asporin与VEN相比，AVICs中检测到mRNA。相比之下，cm特异性标记的表达(Myh7而且Gata4)与AVICs相比，VEN组织中增加。此外,补充3(逆转录酶PCR)数据也显示较高的表达Asporin与胚胎流出道垫层(胚胎发育中主动脉瓣和肺动脉瓣的前体结构)组织相比。因此，所有这些特征和基因表达数据表明，在培养中成功建立了初级成鸟中性体。

3.2.培养中性人成骨诱导

成功建立AVICs并诱导成骨在体外，用成骨诱导培养基处理AVICs 96 h。全培养基中添加OS诱导成分(β-甘油磷酸(10mm)， l -抗坏血酸(10nm)，地塞米松(0.1μM))，如前人所述[9］．对照和os处理的健康AVICs培养物的亮场图像如图所示2(一个)而且2 (b)(箭头)。接下来，正如预期的那样，RT-PCR数据表明几种成骨标记特异性基因(骨桥蛋白，Runx2，高山，Msx2,Osterix与未处理的对照AVICs相比，OS治疗后的表达显著上调(图2 (c))．

同样，与RT-PCR数据一致，mRNA水平表达骨桥蛋白，Runx2，高山，Msx2,Osterix通过实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析，与未处理的对照组相比，os处理的AVICs基因分别增加了3.65、2.68、0.4、2.68和17.12倍(图2 (d)电流-电压)。总的来说，这些数据证实了OS培养基的成骨诱导导致AVICs中几种成骨标记物的表达增加。因此，这些数据表明在培养中成功诱导成骨。

3.3.成骨诱导的内源性Asporin在培养avic中的表达降低

成功建立成骨诱导成人AVICs后，在培养AsporinRT-PCR数据分析mRNA表达μg的总RNA模板，用于合成cDNA。此外，还分析了Asporin蛋白在对照组和os处理的AVICs中的表达。有趣的是，降低的水平AsporinRT-PCR数据和qRT-PCR检测结果显示，与未处理的对照组相比，os诱导的AVICs中检测到mRNA。在图3(一个)，我，RT-PCR数据表明Asporin与对照AVICs相比，os处理AVICs的核酸琼脂糖凝胶带强度明显下调。同样，与逆转录酶PCR数据一致，Asporin与未处理的对照组相比，os处理的AVICs的mRNA表达降低了0.62倍(图3(一个)(二)。

同样在蛋白质水平上，与对照AVICs相比，os处理AVICs中的Asporin也减少了。在图3 (b)， I和II, western blot数据显示Asporin下调了0.67倍( ）与对照蛋白相比

此外，为了进一步验证成骨诱导和两者的结果Asporin用Asporin- (Asp-)特异性抗体对经os处理的AVICs的mRNA和蛋白表达进行免疫染色。与mRNA表达数据一致，asporin阳性(Asp⁺)单元格(图中的箭头)3 (c)， I)在os处理的AVICs中被检测到，与未处理的对照组AVICs数量相比(图中箭头所示)3 (c)定量细胞计数数据进一步显示，与未处理的对照组相比，os处理的AVICs中阿司匹林标记细胞分别减少了约12.65%(图2)3 (d))．至少500 DAPI⁺在每组实验中计算原子核( )．

总的来说，这些数据表明成骨诱导减少内源性Asporin培养AVICs在mRNA和蛋白水平上的表达。

3.4.成骨培养基诱导AVICs标记基因表达分析

接下来，采用对照和os处理的AVICs，并确定了额外的选择性标记基因表达。几种细胞外基质(ECM)和Wnt/的表达β通过qRT-PCR检测成骨诱导敏感的-catenin信号通路特异性基因。的表达Col1a1作为ECM标记物，与对照AVICs相比，os处理的AVICs显著下调0.97倍(图4(一)， I).肌成纤维细胞标志物，Sm22α与对照AVICs相比，os处理的AVICs增加了17.25倍(图4(一),(二)．另一个ECM标记，纤连蛋白，上调了8.51倍(图4(一)，三)，中间灯丝标记，波形蛋白，下降了0.83倍(图4(一)， IV)，细胞粘附标记物N-cadherin与对照AVICs相比，os处理的AVICs增加了4.42倍(图4(一)两种基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs) Adamts5和Adamts9增加了0.23倍(图4(一)， VI)，降低了0.62倍(图4(一)， VII)，分别在os处理的AVICs中与培养中的对照AVICs进行比较。有趣的是，胶原蛋白(Col1a1)及瓣膜间质细胞标记物(波形蛋白)也表明激活细胞表型诱导成骨。此外，我们还检测到增加(3.36倍)(图4(一)，八)表达PiT2与对照组相比，指示os诱导的AVICs细胞内磷酸盐水平的mRNA。但我们无法检测到的表达PiT1在os诱导的AVICs中转录。总的来说，在诱导成骨的培养AVICs中，几个负责病理重塑的ECM基因已经显著改变了矿化和钙化表型。

此外，在os处理的AVICs培养中，与之前的报道一致[9]，涉及Wnt/的基因/蛋白质β-catenin信号，包括但不限于β连环蛋白，Wnt3a,Dkk1与未处理的对照组相比，mRNA的表达有所改变。在os处理的AVICs中，qRT-PCR数据显示β连环蛋白而且Wnt3amRNA的表达分别降低了1.44和4.73倍Dkk1mRNA(0.27倍)，与未处理的对照组相比(图4 (b)》)。

此外，BMP/Smad信号通路和Notch/Sox9信号通路特异性基因标记也在对照组和os处理的AVICs之间进行了比较(补充图)4)．在这里，与未处理的对照细胞相比，os处理的AVICs中BMP2增加了0.07倍，Smad1减少了0.15倍，Smad5和Smad8分别增加了7.51倍和6.11倍。同样的,Notch1mRNA增加了1.62倍Sox9与未处理的AVICs相比，os处理的AVICs的mRNA下降了0.67倍。因此，其他参与瓣膜成骨的信号通路基因也在OS诱导AVICs时发生显著改变(补充图)4)．

有趣的是，早期的报道表明，Sox9通过阻断成骨分化来指导软骨分化[24，25］．在这里，我们发现了Sox9AVICs成骨诱导后mRNA表达降低。相比之下，我们还表明(图2）Runx2在os诱导的AVICs中，mRNA表达增加，表明Runx2参与了成骨过程。综上所述，其他人和我们的数据可能表明，这两种转录因子之间的平衡对于AVICs的成骨诱导很重要在体外．

总的来说，所有这些数据都表明，在培养的AVICs中，几种AVICs标记物、ECM基因和多种对OS诱导敏感的信号通路的表达发生了改变，包括Wnt/β连环蛋白信号。

所有显示对照和os诱导的AVICs之间变化的基因表达分析结果均以表中的列表表示2．

3.5.Asporin的过表达降低了成骨培养基中AVICs的矿化

接下来，为了确定Asporin蛋白对AVICs矿化的影响，我们还用Asporin重组蛋白(rhAsp, 150 ng/ml)处理os诱导细胞24小时，通过茜素红S染色评估定性和定量矿化。通过免疫染色评估Asporin蛋白定位，比较OS-和OS+ hasps处理的AVICs在培养中的表达。同时，通过qRT-PCR验证rhAsp处理后标记基因表达的变化。用OS诱导培养基处理3天后，茜素红S染色显示AVICs矿化增加(图5(a)， nI-nIII中的箭头)。有趣的是，与图中的操作系统控制单元相比5(a)图中观察到矿化程度降低5(b) (nI-nIII中的箭头)用rhAsp处理后。接下来，图中茜素定量试验进一步证实了这一数据5(c).该定量数据表明，与没有任何rhAsp的OS对照(0.064)相比，茜素染色的rhAsp处理过的AVICs吸光度(OD)(0.089)下降。接下来,数据5(d)和5(e)显示了OS对照和haspp处理的AVICs之间Asporin- (Asp-)阳性AVICs的差异。正如预期的那样，它显示在rasps处理的细胞中，asporin阳性AVICs数量增加(图5(e))与单独的操作系统控件相比(图5(d))。通过分析和量化OS+rhAsp组与OS对照组相比，asporin阳性avic增加的百分比(1.75%)，进一步验证了这一点(图2)5(f))。

此外，在OS对照和hasps处理的AVICs上，通过qRT-PCR检测相关基因表达子的mRNA表达水平(图5(g), I-VI)。这些数据已经发现了这一点AsporinmRNA显著上调0.9倍;两种成骨基因标记(骨桥蛋白而且Runx2)与OS对照相比，hasps处理的AVICs分别降低了0.29倍和0.79倍。此外，Wnt信号的正向调节因子(β连环蛋白，Wnt3a)与OS对照组相比，hasps处理的AVICs分别降低了0.55倍和0.8倍。相比之下，表达Dkk1Wnt信号的负调控因子，与OS对照相比，hasps处理的AVICs增加了0.3倍。因此，这些数据清楚地表明，Asporin对OS诱导介质诱导的瓣膜矿化有明显的抑制作用。

此外，为了确定rhAsp蛋白对AVICs活力的影响，我们进行了细胞活力测定。同样，我们在培养的AVICs中以剂量依赖的方式使用了三种浓度(100 ng/ml、150 ng/ml和200 ng/ml)的rhAsp蛋白，如补充图所示V．该数据显示，在对照组、100 ng/ml-、150 ng/ml-和200 ng/ml处理的AVICs中，活细胞分别为88%、81.21%、93.81%和76.7%(补充图)V模拟)．在所有测试浓度的rhAsp蛋白中，AVICs的活力没有观察到统计学意义(补充图V E)．统计每组DAPI阳性核的总数，每组至少500个核( )．

总之，这些数据有力地表明重组Asporin蛋白显著降低了在OS诱导培养基中维持的成鸟AVICs的矿化水平在体外．

所有基因表达分析的结果，显示OS控制和OS+ hasp处理的AVICs之间的变化，在表中以列表形式表示3.．

3.6.人重组孢素蛋白抑制成骨介质诱导的AVICs矿化和Wnt信号激活

接下来，为了确定重组Asporin蛋白对OS诱导介质中维持的AVICs矿化和Wnt信号水平升高的AVICs矿化的影响，我们进一步用Wnt3a重组蛋白(rhWnt3a, 150 ng/ml, 24小时)处理AVICs，在OS诱导的同时激活Wnt信号。令我们惊讶的是，重组Asporin蛋白(rhAsp, 150 ng/ml, 24 hrs)与OS+rhWnt3a维持的AVICs相比，可以抑制补充OS+rhWnt3a的AVICs矿化。同样地,数据6(一)- - - - - -6 (c)经茜素染色成骨培养基诱导的AVICs (OS)培养6天，然后用rhWnt3a或rhWnt3a+rhAsp处理24小时。矿化的基本水平已在图中被检测和定性标记6(一)(箭头)。与OS单独诱导相比，OS+ rhwnt3a处理的AVICs矿化水平增加(图中箭头所示)6 (b))．有趣的是，当OS+rhWnt3a AVICs进一步用rhAsp处理时，矿化水平下降，茜素反应活性降低(图中箭头所示)6 (c))．这些定性数据在图中通过定量分析进一步验证6 (d)．与OS单独诱导相比，OS+ rhhwnt3a处理的AVICs茜素强度的吸光度(OD)增加(0.160)。有趣的是，当OS+ rhwnt3a处理的AVICs进一步用rhAsp蛋白处理(0.065)时，发现茜素的吸光度(OD)下降。总之，通过茜素红S染色检测到，添加Asporin蛋白在定性和定量上都抑制了OS介质诱导的AVICs矿化。

接下来，测定参与成骨的指示基因和Wnt/的mRNA表达水平β在OS-、OS+rhWnt3a-和OS+rhWnt3a+ hasps处理的AVICs中检测到包括Asporin在内的-catenin信号，采用qRT-PCR检测(图6 (e)I-VI)。AsporinmRNA在rhWnt3a处理的os诱导的AVICs中显著下调，在rhWnt3a+ raspp处理的os诱导的AVICs中显著上调。与OS对照组相比，rhWnt3A处理过的AVICs的细胞凋亡率降低了0.73倍，而与rhWnt3A处理过的AVICs相比，rhWnt3A+ raspp处理过的OS诱导AVICs的细胞凋亡率再次提高了3.43倍。同样，成骨标志物的表达，骨桥蛋白而且Runx2，在rhWnt3a处理的os诱导的AVICs中，rhWnt3a+ rasps处理的AVICs中，rhWnt3a的表达增加，而rhWnt3a+ rasps处理的AVICs中，rhWnt3a的表达减少。骨桥蛋白与OS对照组相比，rhWnt3a处理组的mRNA表达增加了1.44倍，而与仅处理组相比，rhWnt3a+ hasp处理组的mRNA表达减少了0.07倍。同样的,Runx2与OS对照相比，rhWnt3a处理组的mRNA表达增加了0.89倍，与仅处理组相比，rhWnt3a+rhAsp OS AVICs的mRNA表达减少了1.23倍。Wnt通路调制器，β连环蛋白而且Wnt3a在os诱导的AVICs的两种处理中，也确定了mRNA的表达。β连环蛋白与OS对照组相比，rhWnt3a处理的mRNA增加了2.2倍，而与仅处理rhWnt3a的AVICs相比，rhWnt3a+ rhasp处理的AVICs的mRNA减少了0.33倍。同样的,Wnt3A与OS对照相比，rhWnt3A处理的rhWnt3A+ hasp处理的OS诱导的AVICs增加了1.73倍，与仅处理rhWnt3A的AVICs相比，rhWnt3A+ hasp处理的AVICs减少了0.26倍。相反，Wnt信号负调控因子的mRNA表达，Dkk1与OS对照相比，经rhWnt3A处理的rhWnt3A+ haspp处理的OS诱导的AVICs降低了0.71倍，与仅经rhWnt3A处理的AVICs相比，升高了1.44倍。因此，这些基因表达数据与os诱导的AVICs矿化状态一致，无论是否进行处理。

总之，所有这些数据都有力地表明重组Asporin蛋白抑制了os诱导的AVICs中的矿化，同时增加了Wnt/的mRNA水平β-连环蛋白信号特异性基因表达。

所有显示OS对照、OS+rhWnt3a-和OS+rhWnt3a+ hasps处理的AVICs之间变化的基因表达分析结果均以表中的列表形式表示4．

3.7.抑制Wnt信号不能挽救os诱导的AVICs矿化在体外

接下来，为了确定Wnt信号是否足以在培养中诱导AVICs矿化，用Wnt信号抑制剂Xav939处理os诱导的AVICs (2μM)抑制Wnt信号，并用重组人Asporin蛋白(rhAsp, 150 ng/ml)处理24小时。通过茜素红S染色对os诱导和治疗的AVICs进行定性和定量矿化评估。采用qRT-PCR方法分析了Xav939 (Wnt信号传导抑制剂)和Xav939+ raspp处理os诱导的AVICs几种基因标记物的mRNA表达水平。数据7(一)- - - - - -7 (c)alizarin染色的os诱导的AVICs培养6天，然后用Xav939或Xav939+rhAsp蛋白处理24小时。矿化基础水平已被检测到，并在图中用箭头定性标记7(一)．有趣的是，在xav939处理的os诱导的AVICs中，矿化状态未变(图中箭头所示)7 (b))，与图中单独的操作系统诱导相比7(一)，表明Xav939处理os诱导的AVICs中存在其他促进矿化的活性信号通路。但是，正如预期的那样，rhAsp的治疗抑制了xav939处理的os诱导的AVICs的矿化(图中箭头所示)7 (c))与单独的Xav939治疗相比(图中箭头所示)7 (b))．此外，由茜素染色的AVICs强度产生的吸光度(OD)数据通过图中定量测定进一步验证7 (d)．与定性数据一致，os诱导的AVICs和xav939处理的AVICs茜素吸光度分别为0.089和0.88 (ODs)。但在Xav939和haspp处理的os诱导的AVICs中，它进一步下降到0.68 (OD)，表明矿化水平降低。

接下来，为了确定OS单独诱导、Xav939处理OS诱导和Xav939+ raspp处理OS诱导AVICs的基因表达变化，我们进行了qRT-PCR分析(图7 (e)I-VI)。与矿化数据一致，Asporin在Xav939处理的os诱导的AVICs中，mRNA表达没有变化，但在Xav939+ haspp处理的os诱导的AVICs中，mRNA表达显著上调。同样的,Asporin与Xav939处理的os诱导AVICs相比，Xav939+ raspp处理的os诱导AVICs的mRNA增加了1.71倍。此外，成骨标志物(骨桥蛋白而且Runx2)在Xav939处理的os诱导的AVICs中没有变化，但在Xav939+ raspp处理的os诱导的AVICs中显著下调。骨桥蛋白而且Runx2与Xav939处理os诱导的AVICs相比，Xav939+rhAsp os诱导的AVICs的mRNA分别降低了0.28倍和0.35倍。此外，Wnt通路基因的阳性调节因子，β连环蛋白而且Wnt3A与os诱导的AVICs相比，两个治疗组的mRNA表达也进行了分析。的表达β连环蛋白与OS对照组相比，Xav939处理的AVICs的mRNA下降了0.78倍，Xav939+ haspp处理的OS诱导的AVICs的mRNA下降了0.27倍。同样，表达式为Wnt3A与OS对照组相比，Xav939处理的AVICs的mRNA下降了0.05倍，Xav939+ hasp处理的OS诱导的AVICs的mRNA下降了0.65倍。相反，Wnt信号通路的负调控基因，Dkk1与OS对照组相比，Xav939处理的AVICs中表达增加了0.18倍，Xav939+ haspp处理的OS诱导的AVICs中表达增加了3.09倍。

因此，在os诱导的AVICs中存在矿化，Wnt/水平降低β-catenin信号进一步表明存在其他负责AVICs矿化的活性途径。但是，令我们惊讶的是，在xav939处理的os诱导的AVICs中，rhAsp对矿化的抑制表明，Asporin的潜在功能独立于多种促成骨信号通路来抑制AVICs矿化在体外．

综上所述，这些数据有力地表明，Asporin抑制矿化，可能在mRNA水平上作用于包括Wnt/在内的多个成骨诱导通路基因的上游β-catenin信号通路。

所有显示OS对照、OS+Xav939-和OS+Xav939+ haspp处理的avic之间变化的基因表达分析结果均以表中的列表形式表示5．

4.讨论

成人主动脉瓣间质细胞矿化和活跃钙化是成人心脏CAVD表型的最佳特征。但其在成人主动脉瓣尖的表达，在CAVD进展和发病机制中的作用尚不清楚。因此，在本报告中，我们首次证明了阿司匹林可能具有抑制主动脉瓣间质细胞基质矿化和钙化的功能，并具有潜在的治疗意义。

在这里，我们检测到的强表达Asporin与胚胎流出道垫层(主动脉瓣前体)组织表达水平较低相比，成鸟主动脉尖的mRNA表达水平较低。我们还成功建立了禽成体主动脉瓣间质细胞(AVIC)培养体系(图1)．由于无法将这些分离的原发AVICs维持在成骨培养基中诱导矿化超过3天在体外，我们在培养中未检测到任何Von Kossa活性细胞(数据未显示)，这进一步表明了钙盐沉积的终末期成骨过程。在诱导成骨时，我们分析并检测了几种成骨基因标记物的表达增加以及矿化水平的增加(图2)．成骨诱导导致内源性Asporin表达水平下降，同时伴随Wnt/水平升高β-catenin信号通路与培养的非诱导对照AVICs相比(图3.而且4)．

一些报告已经确定了Wnt/β-catenin信号通路是心脏发生(包括细胞增殖、谱系分化)和心脏形态发生(包括主动脉瓣钙化过程)的关键调节剂[19，26- - - - - -28］．因此，为了更好地理解在成骨培养基诱导的AVICs中促进矿化的相关信号，我们操纵了Wnt/β-catenin信号，以确定Asporin作为抗矿化ECM蛋白的功能。有趣的是，在成骨诱导后，直接添加人重组Asporin，无论是否激活Wnt信号，都会减少AVICs矿化在体外(数据5而且6)．对于矿化评价，我们对培养的AVICs进行了茜素红S染色的定性和定量分析。有趣的是，重组人Asporin的加入显著挽救了成骨培养基和Xav939处理的AVICs的矿化。总之，这些数据有力地表明，在成骨诱导培养基单独或与重组人Wnt3a蛋白联合诱导的培养中，Asporin抑制AVICs矿化。相反，与单独的成骨诱导培养基相比，直接添加Wnt信号通路抑制剂Xav939并不能明显挽救矿化，这表明在培养中存在额外的促进矿化的活性通路(图7)．与这些数据相一致的是，我们的补充图II也显示了BMP-Smad，Notch1,Sox9与培养的未诱导细胞相比，os诱导的AVICs的基因。

因此，正如假设的那样，Wnt信号激活在诱导成骨的培养中协同促进了AVICs的矿化。但直接加入重组Asporin蛋白抑制矿化。总的来说，所有这些数据都高度提示Asporin可能直接与Wnt信号受体结合，以防止Wnt配体结合竞争性抑制Wnt/β-连环蛋白信号激活，因此随后的成骨基因诱导。同样，之前的一份报告也证明了Asporin通过富含亮氨酸的motif与Bmp受体直接结合，以抑制Bmp- smad1 /5/8信号通路用于成骨诱导和牙周细胞的矿化和钙化(MPDL22)。在体外［16］．因此，与Bmp-Smad1/5/8信号通路一样，Asporin也抑制Wnt/β-catenin信号通路抑制os处理的成人主动脉瓣细胞成骨基因诱导。重要的是，到目前为止，Asporin和Wnt/之间没有功能性串扰β-catenin信号通路与AVICs矿化和钙化有关。

总的来说，阿司匹林抑制成骨诱导介质单独或联合Wnt信号激活诱导的成人AVICs矿化。因此，在本报告中，我们发现Asporin是一种新型的抗矿化分子，它可能直接与多种成骨促进通路的受体结合，竞争性地抑制各自配体和受体的相互作用以及随后的信号激活，以诱导培养的成人AVICs成骨基因程序。

数据可用性

所有用于支持本研究结果的生成数据都包含在文章中或补充信息文件中。

利益冲突

作者声明，这篇论文的发表不存在利益冲突。

致谢

本工作得到中央大学教育资助委员会重大研究项目资助(mrp - major - bios -2013-12885)的支持;印度中央政府，生物技术部，科技部赞助项目拨款(BT/PR11785/BRB/10/1324/2014);印度中央政府、生物技术部、科技部赞助的Bio-CARe (BT/Bio-CARe/01/9686/2013-14)赠款和中央大学赠款委员会启动赠款(编号:FRPDF)。F.4.5(192-FRP)/2015(BSR))到AS。我们也要感谢dbt建造计划和DST-FIST(一级)对加尔各答总统大学生命科学系的慷慨资助和支持。我们感谢SC和AS实验室所有成员提供的技术援助和科学投入。

补充材料

补充图1:温度梯度PCR对所有逆转录酶PCR引物的退火温度进行优化。对于基因表达分析，首先通过IDT PrimerQuest®工具设计所有引物集。然后，为了检测每个引物组的退火温度，我们进行了温度梯度逆转录酶PCR实验。在这张图中，我们展示了60-50°C梯度逆转录酶PCR数据(A)，包括Myh7, Gata4, Vimentin, ALP, Osteopontin, Msx2，β-catenin, Wnt3a, Dkk1, Notch1, Sox9, Osterix和Bmp2。接下来，我们展示了60-48°C梯度逆转录酶PCR数据(B)，包括Asporin, Col1a1, Sm22α， n -钙粘蛋白和β肌动蛋白。接下来，我们展示了65-55°C梯度逆转录酶PCR数据(C)，包括Fibronectin和Runx2。接下来，我们展示了52-50°C梯度逆转录酶PCR数据(D)，包括Adamts5, Adamts9, Smad1, Smad5和Smad8。最后，我们展示了PiT2的56-52°C梯度逆转录酶PCR数据(E)。引物列表中提到了所有用于进一步基因表达分析的检测到的退火温度(表1)以及产品尺寸和正向和反向引物序列。补充图2:定量实时PCR测定引物效率。为了计算引物效率，我们遵循Qiagen指南，并对重要引物组(Asporin, Asporin, Asporin)执行“效率和斜率”生成步骤β-连环蛋白和纤维连接蛋白)。这里取1μg为对照AVICs样品cDNA模板，用无核酸酶水按1:1、1:10、1:100、1:1000、1:10000顺序依次稀释。然后，通过实时荧光定量PCR进行标准曲线推导。在得到阈值(Cq)后，将这些值绘制进去 -轴和cDNA稀释对数的绘制 -轴(如图所示)。斜率( ）在MS Excel中确定，引物效率由下式计算: ．在这张图中，我们展示了生成的阿司匹林的标准曲线，β-catenin和Fibronectin分别在A, B和C中表达。这些引物对Asporin的引物效率分别为95.68%和98.84%β-连环蛋白和99.21%的纤维连接蛋白。补充图3:胚胎流出道垫层和成人主动脉尖的Asporin mRNA表达检测。为了确定Asporin的基础水平mRNA表达，我们通过逆转录酶PCR数据分析了与胚胎第5天(E5)流出道(OFT)缓冲组织比较的成人主动脉瓣组织的表达。我们显示基因表达增加(根据与胚胎OFT组织相比，成人组织中更强烈的条带)。这里，我们用了β-actin作为加载控制。补充图4:培养成人AVICs OS诱导成骨后其他成骨诱导途径的定量基因表达分析。在这里，我们分析了额外的基因表达分析，采用信号特异性标记基因比较对照和os诱导的AVICs。在A (I - IV)中分析了BMP/Smad信号特异性标记，在B (I, II)中分析了Notch/Sox9信号特异性标记。在这里，与未处理的对照细胞相比，os处理的AVICs中BMP2增加了0.07倍(A, I)， Smad1减少了0.15倍(A, II)， Smad5和Smad8分别增加了7.51倍和6.11倍(A, III和IV)。同样，与未处理的AVICs相比，os处理的Notch1 mRNA增加了1.62倍(B, I)， Sox9 mRNA减少了0.67倍(B, II)。补充图5:培养中用人重组Asporin (rhAsp)蛋白处理AVICs后的细胞活力。在这里，我们通过对AVICs进行重组Asporin蛋白(rhAsp)处理后进行DAPI染色来分析细胞活力。细胞计数后，用血细胞计(细胞/毫升;在培养过程中，在每个培养皿中加入2ml这样的细胞悬液)。然后，我们应用了剂量依赖浓度从100到200 ng/ml的rhAsp。然后用DAPI对细胞进行染色，我们将DAPI阳性细胞计算为活细胞，计算公式如下: ．我们显示(A-D)对照AVICs、100 ng/ml rhasp处理的AVICs、150 ng/ml rhasp处理的AVICs和200 ng/ml rhasp处理的AVICs的测定百分比分别为88、81.21、93.81和76.7。因此，这表明在rhAsp处理后，培养中有超过75%的dapi阳性的独立细胞核表明存活的AVICs。此外，统计分析显示细胞活力(DAPI)发生了不显著的变化(E)⁺细胞核)，与未处理的对照组相比，其中 而且 ．（补充材料）

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