序列块面扫描电镜观察合胞环节动物雌性生殖系囊肿中线粒体的形态

摘要

线粒体根据细胞的代谢和功能状态改变其形态和分布。在这里，我们分析了线粒体和选择的结构在雌性生殖系囊肿的代表阴蒂环节动物-白虫Enchytraeus albidus其中，每个生殖细胞都有一个细胞质桥，将其连接到一个共同的细胞质块。使用连续块面扫描电子显微镜(SBEM)，我们准备了一个囊肿在卵发生晚期的整个选择室室的三维超微结构重建，即所有16个细胞(15个护理细胞和卵母细胞)的护理细胞、胞量和细胞质桥。我们发现了广泛的线粒体网络在护理细胞，胞量和线粒体通过细胞质桥，这表明线粒体网络可以扩展到整个囊肿。动态灌注状态被认为是这种线粒体聚集。我们测量了线粒体的分布，揭示了它们在护理细胞中的极化分布，并且与护理细胞相比，它们在细胞库中的积累更丰富。还揭示了线粒体网络与分散的nuage物质的密切联系，这似乎是结构上的Balbiani体，迄今为止还没有在环带环节动物中描述过。

1.简介

线粒体是高度动态的细胞器，主要通过产生大多数三磷酸腺苷(ATP)来产生能量。为了维持细胞正常的能量代谢和稳态，它们还在中间代谢、钙信号通路和细胞凋亡中发挥其他重要作用[1- - - - - -5］．在这种情况下，线粒体的形态，它们的空间分布和活性在细胞中是可变的，这取决于它们的临时需求。线粒体的活力是两个相反过程的结果:融合，这导致它们合并成更大的线粒体网络和裂变，这是一个单独的线粒体从网络分离的过程。线粒体的形态取决于这些过程之间的平衡[3.，6- - - - - -16］．

线粒体网络的一个基本作用是使细胞器之间的通信成为可能，以促进mtDNA表达产物的获取或交换[3.，12，17］．融合还可以缓冲单个线粒体中出现的短暂缺陷。另一方面，线粒体裂变可以作为线粒体选择的一种机制，它会导致线粒体内的有害成分被清除[2，3.，18］．线粒体网络已经在不同类型的细胞中被发现。它们的遗传基础以及它们如何融合成更大的系统或分裂成单个细胞器的分子机制已在模式生物如酵母和哺乳动物组织细胞培养物中得到了深入研究[18- - - - - -22］．

线粒体动力学和线粒体网络在不同细胞系统中的分布的分析主要基于共聚焦荧光显微镜[21，23- - - - - -27]或高分辨率4Pi显微镜[28，29］．在超微结构水平上揭示线粒体形态和分布复杂性的研究很少，这些研究不是基于单个超薄切片，而是以三维(3D)重建的形式[30.］．最近，在昆虫卵母细胞生长过程中的巴尔比亚尼体(Bb)中，线粒体网络在超微结构水平上得到了证实，Thermobia释放有［31］．Bb(线粒体云)，这是一种特有的细胞器复合体，存在于许多无脊椎动物和脊椎动物物种中[32]，被认为参与了卵子发生过程中功能失调线粒体的选择性消除[31］．然而，卵发生Thermobia这只是未来卵细胞单独发育的众多例子中的一个，而在许多动物中，卵细胞的形成是在一组连接的生殖细胞中发生的(见下文)。

无论使用何种技术，致力于线粒体分布、活力和能量过程的研究都是基于一些单独的体细胞，如神经元、胰腺β-细胞及肝细胞[28，33，34］．即使我们考虑到研究线粒体问题的合胞体系统(如大鼠心肌细胞、大鼠和人的骨骼肌、果蝇胚皮胚)[34- - - - - -38]，仍然存在体细胞系的合胞系统。

如上所述，在许多动物的卵发生和精子发生过程中，会出现临时的相互连接的生殖细胞群，这些细胞实际上是功能性合胞体[33- - - - - -36］．这些系统被称为种系囊肿、巢或无性系，它们的空间排列变化很大(其中最著名的是果蝇卵巢中的高度分枝的囊肿)[30.，37- - - - - -41］．此外，在卵发生的情况下，聚集成囊的生殖细胞可能没有相同的发育潜力。随着卵发生的进行，一些相互连接的生殖细胞(称为护士细胞;NCs)开始为其他细胞(卵母细胞，即未来的卵细胞)工作，将不同种类的大分子(主要是rna)和细胞器(包括线粒体)输送到正在生长的卵母细胞[40- - - - - -43］．相互连接的细胞之间的细胞器和大分子的交换(细胞质共享)是由宽的存在(平均10μ米d .腹)细胞连接，称为细胞间桥或环管[42，44- - - - - -46］．虽然NCs没有发育成卵细胞的潜力，但通常它们是高度特化的多倍体细胞，在它们完成功能后，通过程序性细胞死亡-细胞凋亡从囊肿中消除[34，37，40，42- - - - - -50］．

种系囊肿是研究合胞系统形成和功能的有趣模型，包括线粒体的组织和活力。线粒体是在单个聚集细胞内形成网络，还是线粒体是单个细胞器?如果网络存在，它们是通过RCs在细胞之间延伸，线粒体能否与囊肿其他腔室中的线粒体接触，还是彼此隔离?本论文是第一次尝试分析线粒体的活力，形态，和分布在这样的合胞室。此外，我们选择了独特的合胞体，在合胞体中，生殖细胞通常不像在模型生物中的囊肿中那样直接相互连接d .腹而且非洲爪蟾蜍光滑的［30.，39，51]，但每个生殖细胞都有一个RC，将其连接到位于囊肿中心的一个共同的无核细胞质团(细胞量)[52- - - - - -54］．这种包囊装有中央细胞质团(形态各异)，见于阴蒂类环节动物[52，53]、棘轮环节动物[55，56),秀丽隐杆线虫其他线虫[57- - - - - -61]，而甲螨[62，63］．此外，在我们选择的囊肿中，生殖细胞在发育命运中分化，两种细胞类别- 15个nc和一个生长中的卵母细胞-聚集在一起。这种结构类型的雌性生殖系囊肿在白色蠕虫中表现出来Enchytraeus albidus(属于阴蒂环节动物)选择这是为了我们的研究目的。

为了可视化生殖系囊肿内线粒体的形态和分布，我们使用SBEM技术准备了三维超微结构重建。该技术是基于在扫描电镜腔内安装超微显微组，从而能够以EM分辨率获得所分析结构的连续超微结构显微照片，这是3D可视化的基础[64，65］．值得一提的是，我们并没有把注意力仅仅集中在细胞的一个片段上(就像在Bb中被重建的那样)t .释放有卵母细胞)[31]甚至在单个细胞中(如在其他几项研究中)[64，66]，但我们重建了一个生殖系囊肿的整个选择区室，即连接所有16个生殖细胞的NC、细胞库和RCs。在生殖细胞中，我们集中研究了NCs，还没有重建生长中的卵母细胞内线粒体的分布，因为它是一个非常广泛的细胞(平均大小~200µ米)(52]，并应单独分析。值得一提的是，在大肠albidus， NCs不像其他物种那样高度专门化(例如。d .腹)，因为缺乏多倍体(只有4个C水平的倍性)和缺乏凋亡过程，因为它们在卵发生结束时被卵母细胞吞噬。这些细胞通过环状管的宽通道(~4)连接到共同的细胞库µ直径为M) [52］．与其他种属的孢子囊相似，种系的孢子囊也有孢子囊大肠albidus也与卵母细胞的发育有关[52］．

在我们的研究中，SBEM适用于详细研究这些细胞器的形态和分布，并与经典光镜和透射电镜一起显示了NCs的极化，表现为在RC对面的细胞极的核附近出现广泛的线粒体网络，以及细胞库中线粒体的密集聚集。在细胞库和RCs内，线粒体也可以融合，这表明线粒体网络似乎延伸到整个种系囊肿。我们的观察表明，所选NC中的线粒体处于动态灌注状态。因此，囊肿可以在特定的腔室之间交换这些细胞器，这表明存在功能性线粒体合胞体。此外，我们还揭示了NC线粒体聚集与分散的nuage物质(特定于生殖细胞)以及大量其他细胞器(高尔基复合体，内质网)的密切联系，这些细胞器似乎是Bb的结构等价物，Bb是在卵母细胞和未来胚胎的正确形成中重要的细胞器复合体[67，68]，在其他动物中也有发现，但在大肠albidus还有其他环节动物。

2.结果

2.1.种系囊肿结构

的架构大肠albidus最近报道了女性种系囊肿[52］．卵巢内的单个囊肿代表卵发生的连续阶段。最初，所有相互连接的细胞在形态上都是相同的(直到1^圣减数分裂前期)(图1(a))但稍后，生殖细胞会根据其命运而分化，并发育成两种细胞类型:15个护理细胞(NCs)和一个卵母细胞(图1，2(一),4(a))。只有卵母细胞继续减数分裂，大量生长并成为卵细胞，而NCs作为支持细胞，至少向卵母细胞输送细胞器[52，69］．囊肿的结构总是相同的-生殖细胞位于囊肿周围，它们连接到位于囊肿中心的一个共同的细胞质团(细胞量)。胞量是一个小的、大致为球形的细胞质团块，没有细胞核，每个生殖细胞通过一个环管(RC)与其相连(图)1(一),1(c),2(一),4(a))。RCs为开放的细胞质通道，约为4必威2490µm的直径(在nc的情况下)，并由富含f -肌动蛋白的环形内缘稳定(图1(c))。囊肿的结构及超微结构已作详细描述[52，69，70］．在这里，我们分析了卵母细胞已经开始吸收蛋黄(所谓的早期卵黄性卵母细胞)的囊肿，并与其余15个细胞明显区分开来，后者不吸收蛋黄，只是作为支持细胞(图)1，2(一),4(a))。在3D中，我们在一个随机选择的NC、整个细胞库和所有16个rc中，在超微结构水平上重建了线粒体和其他选定的结构(例如nuage材料)。

2.2.线粒体的排列

使用光学和透射电子显微镜(TEM)对图像进行分析，以及通过超薄切割和块表面串行扫描(SBEM)获得的数据显示，NC和细胞库中存在大量线粒体(图2，3.(一)-3.(c)4，补充视频1- - - - - -5在线)。测量线粒体总体积为964个µ米^3.所选NC和221µ米^3.在细胞贮存器中。当比较NC的细胞质和细胞库中每体积的线粒体体积时，可以清楚地看到，细胞库中线粒体的积累量比NC中多25%(表2)1)．在nc中，线粒体在细胞质中分布不均匀，更多的聚集在细胞核周围，特别是在与rc相对的细胞极上(图)2(一),2(b)4(b) -4(d)补充视频1而且2在线)。线粒体减少(见图)5)，均在红点附近;因此，线粒体在RC轴(与RC相对的细胞极)的分布有明显的梯度(图)2(一),2(b),4(一)-4(d)5) -因此nc明显是两极分化的。在选择重建的NC中，线粒体聚集在一起，形成了广泛的由长而分枝的线粒体组成的网络，在3D重建中清晰可见，在重建细胞和囊肿中其他NC的超薄切片中也可见到(图)2，3.(一)-3.(c)4(b) -4(d)补充视频1而且2在线)。值得注意的是，在相互连接的线粒体中，还发现了小的、独立的、豆状的线粒体(图)4(b) -4(d)补充视频1而且2在线)。我们测量了单个(个体)线粒体的体积，平均值为0.0259±0.01µ米^3.（ )．NC中这些线粒体的数量为726个，约占NC线粒体总体积的3%。必威2490为了检查线粒体的连通性水平，我们测量了有多少这样的单个线粒体包含在更长的相互连接的线粒体中。分析显示，3个大的(融合的)线粒体(由超过1.000个单独的线粒体组成)约占NC线粒体总量的65%，还有许多连接但较小的线粒体(约占NC线粒体总量的32%)(图)必威24906)．

如上所述，与分析的NC相比，细胞库中线粒体的积累更为丰富(表1)．对线粒体定位的分析表明，它们均匀地分布在细胞质内(图2(b),4(b),4(e)5，补充视频1- - - - - -3.)．对细胞库的3D分析还显示，线粒体融合并形成了一个长而分枝的细胞器网络(图4(b)和4(e)补充录像2而且3.在线)。与重建的NC相似，它们之间有一些单独的小线粒体(图)4(b)和4(e)补充录像2而且3.在线)。线粒体连通性水平的测量显示，一个大的连接线粒体(包括4650个单个线粒体)占细胞库线粒体总体积的55%，许多较小的连接线粒体占41%，同时还有241个小的单个线粒体，占细胞库线粒体总体积的4%。表中列出了测量值的陈述和NC和细胞库中线粒体分布的示意图1,数据5而且6．

线粒体也在离rc很近的地方(从nc、卵母细胞和胞量的一侧)以及rc的细胞质管道内观察到(图)2(b) -2(d),4(b),4(e)4(f)，补充录像2- - - - - -4在线)。对16个RCs的3D重建显示，不同囊室内的线粒体彼此紧密接触并通过RCs的细胞质，但在两个重建的RCs中没有线粒体通过(图)4(b),4(e)4(f)，补充录像2- - - - - -4在线)。

在透射电镜分析中，我们观察到NCs细胞质内和卵发生早期的生殖细胞内存在单个自噬囊泡(自噬体)(囊细胞尚未分化为护理细胞和卵母细胞)。自噬体含有细胞器的残余，如线粒体和高尔基复合体(图3.(e) -3.(我))。

这里应该指出的是，在我们的研究中，我们多次尝试监测线粒体功能及其在种系合胞体中的作用，使用现有的测定方法。我们尝试使用以下方法:(1)荧光染料JC-1(5,50,6,60-四氯- 1,10,3,30-四乙基苯并咪唑碳氰碘化物)，它是线粒体活性的标志，可以检测线粒体内膜电化学电位的变化，(2)活性MnSOD抗体(兔抗MnSOD多克隆抗体)检测线粒体超氧化物歧化酶(MnSOD)，(3) MitoTracker Orange cmmros用于活细胞中的线粒体可视化(基于线粒体膜电位)，(4)DiOC6(3)用于染色线粒体和其他内膜，如活细胞的内质网。尽管进行了多次尝试和实验修改，但所使用的所有染料始终无法穿透生殖细胞和细胞质，在其细胞质中未发现线粒体染色。线粒体在某种程度上被标记的唯一细胞是生长中的卵母细胞。这可能是由于外体细胞包膜的渗透性低，由扁平的体细胞组成，紧密地覆盖在囊肿表面。如先前的研究所示[52]，当卵母细胞生长时，覆盖它的体细胞包膜破裂，可能正是由于这个原因，获得的唯一信号来自卵母细胞和种系囊肿周围的体细胞(补充图)1在线)。有趣的是，在男性生殖系囊肿的类似研究中，在生殖细胞中实现了标记[71]，但没有体细胞围绕在簇周围，因此试剂可以自由地穿透囊肿内部。为了弥补荧光显微镜分析的不足，我们使用与SBEM相同的方法处理的材料，通过透射电子显微镜分析了线粒体的超微结构，这允许生物膜的良好可视化。因此我们在线粒体中观察到大量的嵴，尽管它们在线粒体基质的电子密度上有所不同:一种线粒体具有电子光基质，而另一种基质的电子密度更高(在这些线粒体中，由于基质与嵴的对比相似，有时嵴几乎不可见)(图)3.(一)-3.(c))。

2.3.Nuage材料

我们还分析了与线粒体网络密切相关的NC成分，如内质网、高尔基复合体和无界颗粒纤维物质的电子致密堆积，这些物质是许多动物种系细胞的特征，被统称为“nuage物质”[32，51，53，54］．利用透射电镜和SBEM获得的三维重建分析显示，出现了片状的电子致密颗粒-纤原性物质，分散在线粒体之间，也与线粒体直接接触(图)3.(b)和3.(c)补充录像5在线)。值得一提的是，用硫黄素T染色的种系囊肿(据报道硫黄素T是淀粉样结构的标记物)在NCs中显示了小的荧光信号，这标志着nuage区域的淀粉样结构(图)3.(d))。内质网的长膜性小管网络和众多由其包围的高尔基复合体也位于NCs中，特别是在RC相对的细胞极(图)2(b),3.(一)-3.(c),4(g)4(h)，补充录像5在线)。透射电镜对种系囊肿的分析也显示了细胞库中的nuage物质(图3.(c)插图)。

3.讨论

3.1.合胞胚系囊肿中的线粒体空间组织

线粒体融合和裂变似乎是细胞生存和适应不断变化的环境所必需的，也是细胞分化过程中细胞生长、分裂和线粒体分布所必需的[28，36］．这些相反的过程使受损的线粒体能够通过将它们组合在一个网络中来“拯救”，并通过线粒体自噬(一种程序性细胞死亡-自噬)分离和降解它们来补偿任何现有的缺陷和/或消除受损的线粒体(累积突变)[19，72，73］．

线粒体在连接程度上有显著差异，因此具有不同的形态[11］．这些差异是由于融合与裂变事件的比例不同造成的，基于这一比例，可以区分线粒体活力的以下状态:(1)没有融合或裂变的碎片化线粒体;(2)微融合和中融合线粒体，其中裂变优于融合;(3)动态灌注，其中融合具有优势，但也会发生裂变;(4)静态灌注，其中裂变非常罕见，线粒体活力表现为线粒体高度融合，有时只存在一个巨大的线粒体[11］．我们的观察表明，在分析的NC和细胞库的情况下，线粒体处于动态灌注状态(分类和命名取自Hoitzing和同事，2015年)，因为在分析的网络中，我们在NC和细胞库中没有观察到一个大的线粒体，而是观察到许多广泛的、长而分枝的线粒体，这些线粒体与小的单个线粒体结合在一起。它与一般的建议一致，即静态血流灌注是对细胞应激的反应，如饥饿，而这里观察到的动态血流灌注状态是一种优化ATP生产和选择线粒体种群的方法[1，11，14］．与静态灌注不同，动态灌注使线粒体在囊室之间交换;由于裂变的发生，线粒体网络的部分可以自行撕裂，与不同腔室中的另一个网络融合，或者在线粒体自噬过程中被破坏[1，11，14］．

因为大量的线粒体聚集是高能量需求细胞的特征(即使是细胞的特殊区域，例如精子的中部)[19，66也因为卵发生过程是消耗能量的，所以在所研究的种系囊肿中也存在广泛的线粒体网络就不足为奇了。我们的观察结果与一个广为接受的说法一致，即线粒体形态的变化会影响能量的产生，而且一般来说，细长的(融合的)线粒体比碎片化的线粒体产生更多的ATP [19，27，74，75］．在分析的nc中，线粒体形成了一个广泛的管状细胞器相互连接的网络，围绕着细胞核，并在细胞的一个极上延伸，较小的线粒体分布在整个细胞质中。在细胞核附近存在的线粒体被认为通过产生活性氧(ROS)在基因表达调控中发挥作用[76，77］．细胞核内线粒体分布的极化也可能使能量产生更有效。由于大多数线粒体位于与rc相对的nc的一端，因此位于囊肿的外部部分，它可以确保ATP生产所需的更好的氧气可用性[78］．对选定的囊室内线粒体分布的分析表明，细胞库中的线粒体聚集(线粒体密度)比NC中更丰富。线粒体也通过连接生殖细胞和细胞质的RCs。这些网络可以整合整个合胞体，并可能有助于密集的能源生产。未来对线粒体网络的研究以及在卵发生的其他阶段监测它们在包囊中的动态可以提供更全面的数据。将线粒体网络的分布与其在合胞囊肿中的活动联系起来，极化细胞和共同的细胞载体也可以提供有趣的信息，正如最近在阴蒂环节动物雄性囊肿中发现的那样[27，79]以及蚯蚓卵巢中的雌性生殖细胞和体细胞Dendrobaena veneta［80］．在d . veneta在卵巢中，并不是所有的线粒体都是活跃的，并且所测量的特定类型的生殖细胞(卵母细胞，NCs，卵母细胞)的线粒体活性水平是不同的;但与体细胞内的线粒体活性相比，始终较低[80］．不幸的是，我们尝试使用现有的测定(JC-1, MnSOD抗体，MitoTracker Orange cmmros, DiOC6(3))来监测线粒体功能和活性的尝试是不成功的(见结果部分)。所使用的试剂始终不能渗透到种系囊肿中。由于体细胞包膜紧紧地包裹着囊肿，因此只有未被包膜紧紧包裹的体细胞和正在发育的卵母细胞显示出标记的线粒体。透射电镜观察合胞体囊内线粒体的形态(具有大量低或高电子密度基质嵴的线粒体)表明其具有较高的活性。到目前为止，我们只能推测线粒体在NCs中，特别是在细胞库中大量聚集，线粒体以广泛网络的形式连接的显著程度也可能在能量生产中发挥作用，并更好地应用于更有效地为生长的卵母细胞提供动力/支持。

在未来卵细胞形成期间(即卵发生期间)线粒体形态的动态及其行为影响这些细胞器向后代的传递(因此线粒体DNA的遗传)。因此，在卵发生过程中，通过消除受损线粒体和/或其选择机制来保持线粒体处于良好状态对后代的健康至关重要[81，82］．这一点尤其重要，因为众所周知，未来生物体中的所有线粒体都只继承自卵母细胞[83]只有个别双壳类动物例外[84，85］．

应该记住，虽然NCs是生殖细胞的特定类型，不具备发育成功能性配子的潜力，但它们在卵母细胞的形成中发挥着重要作用，为卵母细胞提供了许多结构-细胞器和核糖核蛋白(RNPs)等大分子[43，86］．因为这些储存在卵母细胞中的成分对胚胎的正常发育至关重要，所以应该保护它们免受任何危险条件的影响。研究表明，线粒体网络的形成与ROS的低产量有关，ROS被认为是破坏细胞成分的主要因素。线粒体网络的功能之一是提供抗氧化保护，防止细胞死亡和线粒体自噬[28，66- - - - - -68］．尚未解决的问题是，NCs中的线粒体是否是未来胚胎线粒体的来源，它们是否被打包进细胞库，并随着卵发生的结束而退化。在NC和细胞器的广泛线粒体网络中观察到大量单个线粒体，在NC和年轻生殖细胞中注意到单个自噬囊泡(自噬体)含有线粒体和其他细胞器的残余。这表明生殖细胞可以通过对有害线粒体的清除(线粒体自噬)来选择和清除它们。因此，线粒体网络可能参与了线粒体的分裂并从网络中消除它们。在分析的囊肿中，细胞质中未见有丝分裂的迹象。另一方面，令人困惑的是，仅仅在细胞库中线粒体网络大量聚集的原因是什么。在配备有细胞库的男性包囊中，细胞库在精子形成和从包囊中释放的过程中充当细胞质残余的地方[87］．在含有晚期精子细胞的包囊的细胞库中，形成了大量的线粒体聚集，最后它们与细胞库和包囊残余物一起被清除[71］．然而，在女性生殖系囊肿中，细胞质是NCs和生长中的卵母细胞之间的中介结构，是细胞器和大分子转移的途径[52，88］．考虑到卵母细胞在生长过程中聚集了大量的线粒体，细胞库可能是选择的线粒体储存并最终进入卵质的地方。此外，如之前的研究所示，在卵发生后期大肠albidus一个大的卵黄源性卵母细胞包围着囊肿的其余部分，有人认为卵母细胞可以在末端吞没它[52］．

3.2.Nuage材料是Balbiani体的等价物?

在许多动物的卵母细胞中，线粒体被组织成一种称为巴尔比亚尼体的短暂结构(线粒体云;Bb)。除线粒体外，Bb还由内质网、高尔基复合体和nuage堆积等其他细胞结构组成[67，89，90］．Nuage是种系细胞中无所不在的成分[67，91］．简而言之，它源于细胞核，因此构成RNPs的来源，并参与卵母细胞中各种mrna在胚质中的正确定位(即种系的决定因素)[32，51，53，54，92］．最近在昆虫的卵母细胞中发现了Bb组分之间的关系Thermobia释放有，在线粒体动力的背景下，线粒体在一个网络的融合和从这些聚集的单个线粒体的裂变被证明。这种机制被认为可以从未来的卵细胞中选择和消除功能失调的线粒体。31］．虽然Bb尚未在环节动物中被描述，但在迄今已研究的许多环节动物物种中，在卵母细胞和NC中都发现了一种颗粒-纤原性电子致密nuage材料[72，73，93］．我们观察到密集的线粒体网络不仅与nuage材料密切相关，而且与内质网和高尔基复合体密切相关，这表明这种聚集可能是一种形态上不太突出的结构上的Bb(出现在整个种系囊肿中，而不仅仅是在卵母细胞中)。细胞质中nuage物质的存在表明NC可能参与了胚质决定因子的产生和向卵母细胞的运输。虽然环节动物中nuage物质的组成目前还不清楚，但值得注意的是它含有淀粉样结构，硫黄素T染色证实了这一点。尽管环节动物中缺乏适当的、结构上分离良好的Bb，但在包囊组成部分中分散的nuage物质和密集的线粒体网络可能弥补了这一点。在环节动物卵母细胞中，也可以预见到与细胞器一起聚集的nuage物质，其分析应该是未来研究的下一步。人们普遍认为，种系命运的诱导可能有两个来源:合子诱导或母体细胞质遗传[92，94，95］．第一种情况发生在胚胎发生期间，由细胞间信号传导初始化;它在动物类群中广泛存在，可能代表了祖先的机制。种系起源的第二种方式是基于种系决定因素，如mrna和蛋白质，它们在卵发生过程中沉积在卵母细胞的特定区域(种质)。通过遗传母系信息形成种系的模型系统为秀丽隐杆线虫，d .腹而且x光滑的，这被认为是一个导出条件[92，94，95］．NCs和细胞量中nuage物质的存在代表了母系对种系命运的决定。这表明，种系决定因子虽然最初分布在囊肿的所有细胞中，但最终将通过细胞量转移到未来的配子中。类似的情况发生在d .腹在该过程中，NCs中产生种系决定因子，通过环管运输到卵母细胞，然后定位于卵母细胞的后极，形成极质。此外，人们认为在发育过程中，胚质中含有健康的线粒体，可以遗传给后代[96］．在生殖系合子诱导的动物中，如脊椎动物，也形成了Balbiani体，其作用是在持久的卵子发生过程中保护线粒体和其他细胞器的质量[68，96］．染色的大肠albidus用硫黄素T染料染色生殖细胞，这种染料可以染色淀粉样蛋白中富含β薄片的结构，[96，97揭示了nuage含有淀粉样结构。相似的结构最近在非洲爪蟾蜍卵母细胞。在这个模型物种中，Balbiani体中高度富集的Xvelo蛋白富含淀粉样蛋白[96］．这种富含淀粉样蛋白也有一个朊病毒样结构域，如实验所示，被认为在结构上组织Balbiani体。该结构域可以形成稳定的基质，其中嵌入线粒体等细胞器，并可能参与细胞器与RNA的结合和浓缩[96］．在大肠albidus因此，nuage物质与线粒体的密切接触可能表明其在保护线粒体质量方面的作用，并可能将它们聚集在线粒体-nuage聚集物中，这些聚集物可能通过环管一起传递并进一步移动。这可能表明淀粉样蛋白可能形成一种进化保守机制，以某种方式参与种系的规范，如例。奥斯卡·RNA在d .腹，是参与极质组织的主要蛋白质之一[89，91，98]，表示与非洲爪蟾蜍Xvelo [96]，以及酵母中rna结合蛋白的淀粉样聚集，这对配子发生和有性生殖的调节很重要[99］．

总之，这里提出的观察是研究具有共同细胞质的合胞生殖系囊肿内线粒体活力过程的第一步。所使用的连续块面扫描电镜方法使我们首次使用高分辨率的三维重建来分析线粒体及其相关的细胞器和结构的分布。利用SBEM和其他微观方法证明:(我)nc是极化的——密集的线粒体聚集在与rc相对的细胞极的细胞核附近。(2)与护理细胞相比，在细胞库中线粒体的富集量多25%，并且线粒体均匀地分布在细胞质中。(3)线粒体连接成几个大的和许多连接较少的细胞器，在这些细胞器之间也有小的单个线粒体;线粒体连接水平与个体连接水平的比较表明它们处于动态灌注状态。(iv)线粒体可以穿过rc;因此，它们可以在特定的囊肿室之间交换。(v)分散的nuage材料似乎在结构上等同于Bb。

4.材料与方法

4.1.动物材料

白虫标本Enchytraeus albidus(Henle, 1837)是从商业来源获得的。它们是在实验室条件下在装满盆栽土的塑料箱中培育的。他们每周吃一次浸泡在水里的面包和蔬菜。只有成熟的标本与清晰可见的阴蒂被用于分析。

4.2.利用差分干涉对比和荧光显微镜制备分析材料

标本的大肠albidus在PBS(磷酸盐缓冲盐水，NaCl, 137 mM;KCl, 2.7 mM;Na₂HPO₄8毫米;KH₂阿宝₄， 1.5 mM, pH 7.4)在室温下30-40分钟，并在PBS中清洗。将含有生殖系囊肿的卵巢解剖，安装在显微镜载玻片上，在配备Nomarski差分干涉造影剂的Olympus BX60显微镜下分析，或用罗丹明偶联phalloidin双染色(2)μg / ml;Sigma)和DAPI (1μg/ml)在黑暗中放置40分钟，在PBS中洗涤，并在配备适当过滤器的同一显微镜下分析。

为了检测生殖细胞中淀粉样聚集物，将有性腺的身体部位按上述方法固定，在一系列30%、50%、70%、96%和100%乙醇溶液中脱水15分钟，在乙醇/Steedman蜡溶液中饱和:3:1、1:1、1:1和100%乙醇中分别脱水24小时。然后将材料嵌入斯蒂德曼蜡中，进行聚合，切成7μm厚切片，蔡司HYRAX M40切片机。染色前，切片安装在显微镜载玻片上，使用反向系列乙醇脱蜡:100% 2 × 15分钟，90、70和50%双蒸馏水(ddH₂O)每次15分钟。脱蜡切片用1% Triton X-100在PBS中洗涤，然后在纯PBS中洗涤，然后在1% BSA(牛血清白蛋白)PBS中孵育1小时。该材料在1%硫黄素T水溶液中在室温下黑暗中染色20分钟。染色组织切片在配备适当滤光片的Olympus BX60显微镜下分析。

4.3.利用光学显微镜，透射电子显微镜和SBEM制备分析材料

带性腺的解剖体段在0.1 M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中2.5%戊二醛中室温固定1小时。在相同的缓冲液中洗涤后，用3%亚铁氰化钾在0.3 M碳酸钙酸盐缓冲液中与等体积的4%四氧化锇水溶液混合后固定1小时。然后在ddH中洗涤三次5分钟₂O，在1%的硫代氨基脲(Ted Pella)溶液中在60℃下孵育20分钟。之后，在ddH中洗涤3次5 min₂O，置于2%四氧化锇水溶液中30分钟，然后在ddH中再次清洗组织3次5分钟₂O，在1%的乙酸铀酰水溶液中4°C孵育过夜。然后在ddH中冲洗三次5分钟₂O，放入新鲜制备的Walton’s lead aspartate中，60°C, 30分钟，ddH中洗涤5次，3分钟₂O在一系列30、50、70和96%乙醇溶液中脱水10分钟，然后置于无水100%乙醇中三次20分钟，丙酮和乙醇1:1的溶液中15分钟，在100%丙酮中两次15分钟。脱水后，将样品置于50%环氧树脂包埋介质(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)的丙酮混合物中3小时，然后放置一夜使丙酮蒸发。将制备好的材料嵌入两层Aclar (EMS)之间，然后进行聚合。

用光学显微镜分析材料，半薄片(0.8µm厚)亚甲蓝染色，使用Olympus BX60显微镜，配备XC50数码相机(Olympus, Tokyo, Japan)和cellSens Standard软件(Olympus, Tokyo, Japan)进行分析。为了使用透射电镜分析材料，在Leica Ultracut UCT超微切片仪(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)上切割超薄切片(80 nm)，并在日立H500透射电子显微镜(Hitachi, Tokyo, Japan)下在75 kV下进行检查。

对于3D重建，在树脂硬化后，用刀片切出的方形，用非常少量的氰基丙烯酸酯胶水连接到铝钉(金属铆钉，牛津仪器)上，然后安装到超微仪上(Ultracut UCT超微仪，徕卡微系统，Wetzlar，德国)，并修整样品块。接下来，将样品用银漆(Ted Pella, 16062-15)固定在针上并干燥24小时。使用Sigma VP(蔡iss)扫描电子显微镜收集一系列150 nm超薄切片的图像，该扫描电子显微镜配备了超显微室3View (Gatan)和数字显微软件(Gatan)以及背散射电子探测器。扫描参数:变压18pa, EHT 4kv，孔径15μM，停留时间7μS，像素大小15 nm。

4.4.三维重建

选择的囊肿成分的三维重建是基于一系列超薄切片。显微图像浏览器(MIB)，这是一个方便的图像管理工具[One hundred.]，用于制备三维模型。在MIB中使用刷和阈值工具手动分割感兴趣的单元室。获得的模型在Amira (Thermo Scientific, Waltham, MA)的试用版本中可视化。美国)。

4.5.线粒体的测量

基于一系列超薄切片的三维重建，使用Imaris(瑞士苏黎世Bitplane Scientific software开发的定制软件)中构建的表面物体检测功能对线粒体和线粒体聚集进行分割。同样的方法分别用于护理细胞和细胞库。细胞量、护理细胞和环管使用表面建模进行分割，这在Imaris中具有手动轮廓。在每个检测到的线粒体中，使用估计的固定线粒体大小来计算线粒体的聚集对象数。线粒体的大小是通过在一系列超薄切片上精确地手工绘制几个单个线粒体形状来确定的。使用表面物体检测构建3D物体，并计算每个物体的体积估计。使用随机选择的25个物体的平均体积值来确定最终的线粒体大小。利用计算出的线粒体聚集体体积和单个线粒体的估计，计算出每个聚集体中的线粒体数量。独立计算线粒体元件的总体积相对于细胞库和护理细胞的体积，分别允许确定细胞库中相对线粒体浓度比与护理细胞。

测量了在细胞库和护理细胞内检测到的所有线粒体的三维位置坐标。因此，我们计算了每个线粒体与细胞库和护理细胞中环管中心之间的欧氏距离。所计算的距离由基于线粒体定位的细胞库或护理细胞的最大长度归一化。使用R环境进行统计分析。3.4.2)。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据可根据要求从通讯作者处获得。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

作者的贡献

研究概念和设计，为研究准备材料:Anna Z. Urbisz。进行实验，分析数据，准备数据:Anna Z. Urbisz, Karol maolota。使用SBEM获取数据:mautgorzata A. Śliwińska。卡罗尔·马约塔进行了三维重建。Sebastian Student进行了测量并准备了图表。Anna Z. Urbisz和Karol maolota分析和解释了这些数据。Anna Z. Urbisz和Karol maolota撰写了主要的手稿文本。Anna Z. Urbisz, Karol maolota, Sebastian Student和mazgorzata A. Śliwińska对手稿进行了批判性修订。

致谢

作者非常感谢Piotr教授Świątek(卡托维兹西里西亚大学，波兰)的宝贵讨论、更正和建议。衷心感谢Łukasz Chajec博士(卡托维兹西里西亚大学，波兰)在准备和分析材料方面的重要帮助。这项工作得到了波兰国家科学中心的支持(合同授予号:12月-2017/01/X/NZ3/00736)。

补充材料

补充1．补充视频1:经分析的种系囊肿的序列超微结构显微图像，通过SBEM技术获得，这是3D可视化的基础。

补充2．补充视频2:重建的护士细胞和细胞库的可视化，细胞中可见线粒体(深蓝色)及在细胞库内(亮绿色)．线粒体(黄色的)穿过环形运河(浅蓝色的)、护理细胞核(蓝色的)．

补充3．补充视频3:16个环状管的可视化:15个来自护理细胞(浅蓝色的)和一种来自卵母细胞(红色的)与线粒体(黄色的)穿过它们。细胞载体线粒体(亮绿色)．

补充4．补充视频4:重建环渠的变焦(红色的)连接卵母细胞和细胞库，线粒体通过(黄色的)．

补充5．辅助视频5:用nuage材料可视化护理细胞区域。护理细胞核(蓝色的)， nuage material (亮绿色)、线粒体(深红色)、高尔基复合体(紫色的)、内质网(浅蓝色的)．

补充6．补充图1:(A) - (C)用(A) DiOC染色标记线粒体的生殖系囊肿的活细胞成像(绿色)， bar = 50µm (B) MitoTracker Orange cmmros染色线粒体(红色的)及Hoechst 33342反染色细胞核(蓝色的)， bar = 50µm (C) JC-1以可视化主动(绿色)及非活动(红色的)线粒体和Hoechst 33342反染色细胞核(蓝色的)， bar = 40µm (D) MnSOD抗体免疫标记检测线粒体超氧化物歧化酶(绿色)， bar = 50µm. NC -护理细胞，O -卵母细胞。

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