抗衰老因子Klotho通过toll样受体4-NF-延缓椎间盘退变进程κB通路

摘要

抗衰老蛋白Klotho具有良好的抗炎作用，但在椎间盘损伤后早期下降，使Klotho复位成为治疗椎间盘炎性疾病的一种有吸引力的策略。在这里，我们发现Klotho在髓核(NP)细胞中富集，Klotho过表达使H减弱₂O₂主要通过抑制toll样受体4 (TLR4)诱导急性炎症。促炎NF-κ在两种NP细胞中，B信号通路和细胞因子表达与Klotho抑制和TLR4升高平行(H₂O₂治疗)和大鼠椎间盘(针刺治疗)。过表达TLR4会下调Klotho的表达，而干扰TLR4表达则会降低H₂O₂在NP细胞中的Klotho。在椎间盘退变(IDD)模型中，RNA干扰对Klotho的抑制在很大程度上降低了抗炎和椎间盘保护作用。因此，我们的研究表明TLR4-NF-κB信号和Klotho在NP细胞中形成负反馈循环。此外，我们还证实了Klotho的表达是由TLR4-NF-的上调和下调平衡调控的κB信号。

1.简介

椎间盘退变是腰椎间盘突出症的主要原因。腰椎间盘是人体最重的部位。一般认为椎间盘在20岁后开始退变，但现在进一步证明，退变从15岁开始。细胞核的含水量逐渐下降。椎间盘的弹性和抗负荷能力也有所降低。近期研究发现，一系列炎症因子参与了IDD过程，与IDD的发生发展密切相关[1- - - - - -3.］．然而，各种炎症因子的作用和参与IDD的分子机制尚不完全明确。

椎间盘由中央髓核、外部纤维环和上下两端的终板组成。它的主要功能是维持脊柱的正常结构，承担脊柱的生物应力。NP组织中含有大量的水和蛋白聚糖，这是椎间盘生理功能和应激的必要前提。在椎间盘细胞胚胎发生过程中，NP细胞在组织形成中起着关键作用，并可能直接负责髓核的发育。在某些物种中，如人类，NP细胞可能最终会丢失，并被类软骨细胞所取代，直到椎间盘完全由纤维组成[4，5］．因此，衰老是椎间盘退变的危险因素之一。

Klotho是一种新发现的抗衰老基因。Klotho基因缺失可导致哺乳动物出现多种衰老样表型[6，7］．相反，在Klotho -/-小鼠中过表达Klotho可延长小鼠寿命[8］．Klotho是一种富含肾脏的蛋白质，在矿物质代谢和肾脏保护中发挥关键作用[7，9- - - - - -11］．它也表达在心脏，大脑和甲状旁腺[12- - - - - -14］．Klotho基因编码单个跨膜蛋白和分泌蛋白，通过影响多个细胞膜受体和转运蛋白以及衰老、炎症、凋亡、氧化应激等相关信号通路，促进多种细胞过程的调控。人类Klotho基因多态性与衰老病理性骨质流失相关[15]，脊椎疾病[16]、骨钙素水平[15]，以及骨密度[17］．此外，Klotho蛋白在椎间盘中的表达也有报道。但其在椎间盘内特异作用的分子机制尚不清楚。

炎症因子是细胞和体液产生炎症反应的一类物质，在椎间盘退变中起主要作用。他们参与及促进缺碘症的发展[18］．有研究表明，炎症因子在退变椎间盘组织中的表达水平明显高于正常椎间盘组织，且炎症因子的表达水平与退变椎间盘的程度呈正相关[19］．Interleukin-1β(il - 1β)，肿瘤坏死因子α(肿瘤坏死因子α)、前列腺素E2 (PGE2)等炎症因子可在退变的椎间盘组织中检测到[20.，21］．这些炎症因子是导致椎间盘组织炎症反应的主要因素，在IDD过程中发挥了重要作用[22］．因此，本研究的目的有两个:一是确定髓核细胞中Klotho的表达，二是确定椎间盘退变过程中Klotho表达与炎症反应的关系。这些研究将为klothoi靶向炎症因子治疗IDD提供新的见解。

2.材料与方法

2.1.缺碘症的动物研究

所有动物和实验步骤均经《大学指南》批准，并经西京医院机构动物护理委员会(IACUC)批准(2018007)。12周龄雄性sd - dawley大鼠购自西京医院模型动物研究中心，饲养于无特定病原体(SPF)条件下，标准温度( )，湿度(50-60%)和光照条件(12小时明暗循环)。大鼠缺碘症模型取自既往研究[23］．大鼠被分为两组( 各组中):(1)假手术组:不治疗;(2) IDD组:针刺。siRNA体内研究采用大鼠Klotho小干扰RNA (small interference RNA, siRNA)，靶向ATATT TATTG TAGAA AATGG。对照siRNA包含一个打乱的RNA序列。单剂量siRNA (10nm / 200μ每只大鼠于IDD术前1天尾静脉注射l剂量的PBS，然后在IDD术前和IDD期间每周做两次IDD模型( 在每组中)。实验结束后，CO处死大鼠₂手术切除大鼠尾盘，保存于-80°C，以供进一步分析。

2.2.NP细胞的分离

这项研究总共使用了20只12周大的雄性sd大鼠。采用已报道的方法分离NP细胞[24］．简而言之，大鼠被注射过量的戊巴比妥钠安乐死。尾盘在无菌条件下分离。用显微镜下的痰液完全去除胶状NP组织，并将其置于含有PBS的培养皿中。组织被切开 用眼剪阻断，收集组织悬浮液，以1000rpm离心5分钟。将颗粒置于2体积0.1% II型胶原蛋白中，37℃摇动4 h，收集细胞悬液，1000 rpm离心5 min，弃上清，重悬于完全培养基中(含10% FBS, 1%青霉素-链霉素，DMEM/F12培养基)。计数细胞，接种于25厘米²在饱和湿度培养箱(37°C, 5% CO)中培养₂)．4天后，第一次换液。传代细胞90%融合后，以1:1的比例接种到新的培养瓶中。分别记录粘附时间和细胞生长至90%融合的时间。由于从大鼠椎间盘组织中获得的细胞在传代2至3之前形态各异，我们所有实验均采用单层培养的传代(<3)细胞。

2.3.免疫荧光染色

NP细胞在盖片上培养并处理后，4% PFA(多聚甲醛)在室温下固定30分钟， 清洗3次，每次5分钟，0.1% Triton X-100(稀释 ）透明10分钟， 洗涤3次，每次5min, 5% BSA在37℃阻塞1 h，一抗(5% BSA稀释)在4℃孵育过夜， 洗涤3次，每次5min，二抗(5% BSA稀释)37℃避光孵育1 h， 洗涤5次，每次5min, DAPI (1μG /ml)孵育5 min 洗5次，每次5分钟。最后，通过共聚焦显微镜(Olympus, Japan)收集图像。

2.4.组织学研究

准备椎间盘切片，并将(4μm)采用苏木精-伊红染色(H&E法)。组织学样本由实验室观察员盲选。正常椎间盘可见AF胶原层组织良好，NP细胞分布均匀。损伤后，NP的大小减小，核细胞被密集的蛋白多糖基质区聚成和分离，胶原层变得无序。每只动物随机选择10个区域进行检查。

2.5.反转录PCR (RT-PCR)及实时定量PCR (qRT-PCR)

采用TRIzol RNA分离方案(Invitrogen)从大鼠髓核细胞或组织中提取总RNA。cDNA用FastKing RT试剂盒(gDNase) (Qiagen)合成。RT-PCR和qRT-PCR采用SuperReal PreMix Plus试剂盒(SYBR Green) (Qiagen)进行。所有引物均由Takara Bio, Inc. (Tokyo, Japan)合成。il - 1β: f-cacct ctcaa gcaga gcaca g, r-gggtt ccatg gtgaa gtcaa c;no2: f-gacca gaaac TGTCT cacct g, r-cgaac atcga acgtc tcaca;Il-18: f-atatc gaccg aacag ccaac, r-ttcca TCCTT cacag atagg;Gapdh: f-ggcac agtca aggct gagaa tg, r-atggt ggtga agacg ccagt a。

2.6.质粒构建，过表达和敲除

RT-PCR从髓核细胞mRNA构建ha标记小鼠Klotho (pUSEHA)和myc标记TLR4 (pCDNA3.1)表达质粒。引物组为cklothof: TAAcCATG CCAGC CCGCG CCCCT，和cklothor: CGCTC呕吐Tt atttta taacg TCTCC ggcct;cTLR4-F: CGGGA移行细胞癌AT GATGC CTCTC TTGCA TCTGG和cTLR4-R: GGGGT ACCTC AGGTC AAAGT TGTTG CTTCT(限制性内切酶位点有下划线)。利用shRNA- tlr4引物在GV102载体的BamHI和hindi位点构建shRNA质粒。引物序列如下:F-GATCC CGGCA TAGAG GTACT TCCTA ATATT CAAGA GATAT TAGGA AGTAC CTCTA TGCTT TTTTG GAAA;R-agctt TTCCT aaaaa agcat agagg tactt cctaa tatct agatt aggaa gtacc ttat gccgg。所有引物均由Takara Bio, Inc. (Tokyo, Japan)合成。

2.7.Western Blotting分析

2.7.1.从细胞和组织中提取总蛋白

简单地说，加入1ml裂解液加10μl PMSF (100 mM)溶解30分钟后，注入细胞和组织;用移液管将裂解液转移到1.5 ml离心管中，4℃下12000 rpm离心5 min，将上清液放入0.5 ml离心管中，-20℃。30至60岁μg蛋白/lane采用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)进行电泳。分解的蛋白质通过电泳转移到硝化纤维膜“印迹”上。用5% BSA在TBST (50 mM Tris, pH 7.6, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20)中阻断印迹，并在4°C的5% BSA TBST中与anti-Klotho (1:10 00;Cell Signaling)， anti-TLR4 (1: 1000;Abcam)和anti-NF-KB (1: 1000;细胞信号)。用电化学发光试剂检测免疫标记(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA)。Western blots定量采用ImageJ像素分析(NIH Image软件)。从Western blots数据显示为带密度归一化到加载控制(肌动蛋白)。

2.8.转染

简而言之，准备细胞:接种 髓核细胞500μ转染前24 h, L不含抗双抗体的完整培养基，转染时细胞融合度为80-90%(注:植板时要彻底消化细胞，避免细胞堆积)。对于每个转染样本，准备如下:稀释0.8μg的质粒DNA与50μl Opti-MEM，轻轻移液3-5次，室温静置5分钟;轻轻倒置混合转染试剂，稀释2.0μl Lipofectamine 2000 (Invitrogen)， 50μl optimi - mem，轻轻抽吸3-5次，室温静置5分钟;将转染试剂与质粒DNA稀释液混合，轻轻搅拌3-5次，室温静置20分钟(注意:一旦形成转染复合物，应立即加入培养皿进行细胞转染);转染复合物被添加到24孔细胞板100μL /well，前后轻轻摇动细胞板;将电池板放置在37°C的5% CO中₂培养约6 h后，更换培养基，必威2490换成含10%血清的普通培养基，在5% CO中37℃继续培养24 h₂孵化器。用绿色荧光蛋白质粒转染髓核细胞，检验转染效率;对髓核细胞转染效率为60% ~ 70%。此外，在mRNA水平或蛋白水平上证实了靶标的过表达或沉默效率。

2.9.统计分析

通常情况下，数据来自至少三个独立的重复实验，每个实验在不同的培养和不同的场合进行。数据显示为 (SD)。组间数据比较使用Student进行用于评估方差的检验或方差分析。 或 被认为有统计学意义或非常显著。

3.结果

3.1.降低Klotho的表达及TLR4-NF-的激活κB退行性椎间盘的信号传递

为了深入了解Klotho与TLR4-NF-的联系κB信号在退行性椎间盘中的作用，我们采用大鼠IDD模型。大鼠接受针刺2周后，预计会出现严重的椎间盘损伤。正常椎间盘可见AF胶原层组织良好，NP细胞分布均匀。损伤后，NP的大小减小，核细胞被密集的蛋白多糖基质区聚集和分离，胶原层变得无序(图1(一))．Klotho蛋白和mRNA的表达均下降(图1 (b)而且1 (c))．然而，TLR4和p-IκBα高高在上，有我相伴κBα蛋白减少和高炎性细胞因子诱导IL-1β、NOS2和IL-18(图1 (d))．这表明Klotho表达减少，TLR4-NF-活化κ退行性椎间盘B信号。

3.2.H处理NP细胞后Klotho表达降低₂O₂

收集原代NP细胞，用SOX9、collagen II和Aggrecan染色，证实99%以上的细胞为NP细胞(图2(一个))．据报道，Klotho在肾脏、小鼠巨噬细胞RAW264.7 (RAW)中表达[25］．我们在大鼠NP细胞中检测到Klotho蛋白(图2 (b))，这意味着Klotho可能直接调节椎间盘局部和全身炎症过程。NP细胞表达Klotho蛋白和mRNA, H₂O₂处理剂量依赖性地降低其丰度，并伴有显著的TLR4蛋白升高(图2 (c))．此外,H₂O₂剂量依赖性地提高IL-1的表达β、NOS2和IL-18(图2 (d))，表示H₂O₂Klotho下调可能与其上调NP细胞TLR4及炎症因子表达有关。

3.3.TLR4-NF-对Klotho的调控κB NP细胞的信号通路

为了探索Klotho和TLR4-NF-的潜在修正κ在NP细胞中，我们评估了TLR4的增加或损失是否影响Klotho的表达。结果表明，H₂O₂诱导TLR4积累和TLR4- nf -κB信号激活，但Klotho表达在NP细胞中钝化(图3(一个))．myc标记TLR4的过表达下调了NP细胞中Klotho的表达(图3 (b))．相反，转染TLR4特异性的小发夹RNA (shRNA)的NP细胞降低了对Klotho的抑制作用(图3 (c))．这些结果表明Klotho受TLR4-NF-的调控κNP细胞中的B信号。

3.4.TLR4-NF-的Klotho抑制κB NP细胞的信号通路

确认Klotho在TLR4-NF-抑制中的关键作用κB炎症信号，Klotho过表达对TLR4-NF-抑制的影响κ研究B信号通路和炎症细胞因子表达。Klotho过表达在NP细胞中消除H₂O₂-诱导TLR4积累和IκBα退化(图4(一))和废除NF-κB核易位(图4 (b))．H₂O₂诱导IL-1的促炎细胞因子表达β在过表达Klotho的细胞中，NOS2和IL-18也被显著消除(图2)4 (c))，表明Klotho有效抑制了TLR4-NF-κNP细胞中的B信号。

3.5.Klotho在退行性椎间盘中的作用

为了进一步研究Klotho的体内相关性，我们用小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)敲低Klotho对IDD大鼠模型的抗炎和椎间盘保护作用进行了实验，如图所示5．我们分别给大鼠注射siRNA-control和siRNA-Klotho, NP灌胃2周，观察大鼠椎间盘病理生理变化及促炎细胞因子表达。通过AF细胞和NP细胞判断，Klotho敲除明显引起椎间盘损伤的增加(图5(一个))、TLR4和p-IκBα积累,我κBα减少(图5 (b))， IL-1表达增强β、NOS2和IL-18(图5 (c))．因此，Klotho修复不仅可以抑制TLR4信号通路和相关细胞炎症，还可以减轻椎间盘损伤。

4.讨论

在这项研究中，我们提出了一个新的发现:TLR4-NF-κB信号通路与Klotho在NP细胞中形成负反馈回路，Klotho的表达受TLR4-NF-上调与下调的平衡调控κB信令(图6)．因此，我们的研究结果阐述了一种新的作用模式，通过这种模式，Klotho集中于其抗炎活性，可能对其椎间盘和肾外保护功能有重要贡献。

我们重点研究Klotho蛋白在椎间盘退变过程中的表达变化，以阐明椎间盘退变的分子机制。有研究表明，Klotho在心脏、主动脉、肾、脑、肺、肝、胰腺、脾脏、骨骼肌和脂肪组织中表达[26- - - - - -28］．但有研究表明，Klotho蛋白在椎间盘中表达[29］．

IDD的病理生理机制尚不清楚。近年来，人们对碘缺乏症的病理生理机制进行了大量的研究。认为其病理生理机制主要包括以下几个病理生理过程:细胞外基质合成减少，分解细胞外基质的酶分泌增加，细胞衰老和凋亡增加，神经和血管侵入椎间盘组织[1］．炎症因子与这些过程密切相关。先前的研究表明Klotho抑制TNF的上调α-诱导细胞间粘附分子和血管细胞粘附分子以及NF-的激活κB，直接抵抗促炎细胞因子的炎症作用[30.］．此外，Liu等在衰老细胞中发现细胞内Klotho可与维甲酸诱导基因1相互作用，抑制维甲酸诱导基因1诱导的白细胞介素6 (IL-6)和IL-8的表达，证实Klotho可抑制衰老相关炎症反应[31］．之后，我们研究了炎症信号与Klotho的关系。最后，我们研究了Klotho对IDD的保护作用。

很明显，椎间盘的退变随着年龄的增长而增加。我们假设Klotho蛋白在正常椎间盘中维持NP稳态。出乎意料的是，我们发现NP细胞中Klotho表达的降低是由椎间盘退变过程中炎症信号的激活引起的。众所周知，Klotho蛋白由三部分组成:细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。膜Klotho作为一种受体，调节肾脏中的磷酸盐排泄和活性维生素D的合成[32，33］．分泌型Klotho调节多种生长因子的活性11 [34］．Doi等报道了分泌Klotho抑制TGF-β1信号直接结合到细胞表面的II型TGF- β受体(TGFbR2)并阻止TGF-β1 .与受体结合[35］．TGF -β1是NP细胞中最有效的基质合成诱导因子。Kuro-o发现Klotho可直接调节内分泌FGF家族[36］．因此，Klotho在髓核细胞中的作用可能有许多不同的结果。未来的研究将集中于人类样本，以确定Wnt信号通路的作用，以确定Klotho对细胞生长和基质合成的调节是否对NP细胞具有特异性。此外，Klotho是否影响NP细胞中多种信号通路的活性，包括可能参与椎间盘退变的TGF、FGF或MMP家族的活性，仍有必要进一步研究。

5.结论

我们研究了Klotho在椎间盘和NP细胞中的表达，阐明了Klotho与炎症信号之间的信号串扰，这是椎间盘退变的潜在触发因素。我们证明了Klotho和TLR4-NF-的相互拮抗作用κ通过制备髓核炎症模型，发现B炎性途径。这些实验有力地表明，炎症信号的激活抑制了NP细胞中Klotho蛋白的表达。相反，增加Klotho表达可以抑制NP细胞的炎症信号。这些结果可能支持Klotho不仅仅是TLR4-NF-的拮抗剂κ还有TLR4-NF-的炎症信号κB信号和Klotho在NP细胞中形成负反馈循环。为了阐明导致椎间盘退变的机制，还需要进一步的研究来确定各种炎症信号通路上的哪些分子与Klotho相互作用，以调节髓核细胞生长和基质合成。

数据可用性

在这项研究中产生或分析的所有数据都包含在这篇发表的文章中。

利益冲突

作者声明，这篇论文的发表不存在利益冲突。

作者的贡献

作者毕芳芳、刘文波和吴宗涛对这项工作做出了同样的贡献。

致谢

本研究由西京医院发展基金项目(2018XJ-010)和陕西省自然科学基础研究计划项目(项目号2018JM7140)资助。

参考文献

1. C. K. Kepler, R. K. Ponnappan, C. A. Tannoury, M. V. Risbud和D. G. Anderson，“椎间盘退变的分子基础”脊柱杂志，第13卷，no。3, pp. 318 - 330,2013。视图:出版商的网站|谷歌学者
2. 王淑娟，李俊杰，田俊杰等，“高振幅和低频循环机械应变通过NF-促进人髓核细胞变性κB p65通路"细胞生理学杂志，第233卷，no。9, pp. 7206-7216, 2018。视图:出版商的网站|谷歌学者
3. 蒋海华，陈毅，陈刚等，“瘦素通过mTORC1信号通路加速大鼠肌腱组织异位骨化的发病机制”。细胞生理学杂志，第233卷，no。2，页1017 - 1028,2018。视图:出版商的网站|谷歌学者
4. r·沃姆斯利，《椎间盘的发育和生长》爱丁堡医学杂志第60卷，no。8, pp. 341-364, 1953。视图:谷歌学者
5. W. M. Erwin和R. D. Inman，“脊索细胞调节椎间盘软骨细胞蛋白聚糖的产生和细胞增殖”，脊柱，第31卷，no。10，页1094-1099,2006。视图:出版商的网站|谷歌学者
6. M. Kuro-o, Y. Matsumura, H. Aizawa等人，“小鼠klotho_基因突变导致类似衰老的综合征，”自然，第390卷，no。6655，页45-51,1997。视图:出版商的网站|谷歌学者
7. P. U. Torres, D. Prie, V. Molina-Bletry, L. Beck, C. silver和G. Friedlander，“Klotho:一种参与矿物质和维生素D代谢的抗衰老蛋白质”。肾脏国际，第71卷，no。8, pp. 730-737, 2007。视图:出版商的网站|谷歌学者
8. T. Yamashita, a . Nifuji, K. Furuya, Y. Nabeshima和M. Noda，“携带klotho基因位点突变的转基因小鼠骨骺小梁骨的延伸，导致类似衰老的综合征，”内分泌学杂志，第159卷，no。1，页1 - 8,1998。视图:出版商的网站|谷歌学者
9. Y. Wang和Z. Sun，“Klotho基因传递可预防自发性高血压和肾损害的进展，”高血压，第54卷，no。4, pp. 810-817, 2009。视图:出版商的网站|谷歌学者
10. Q. Zhang, L. Liu, W. Lin等人，“Rhein通过启动子去甲基化逆转klotho抑制，并保护慢性肾病小鼠的肾脏和骨骼损伤。”肾脏国际，第91卷，no。1，页144-156,2017。视图:出版商的网站|谷歌学者
11. Zhang Q. Yin S. Liu, Z. Liu, and W. Cao，“Rhein逆转DNA高甲基化相关klotho抑制改善小鼠肾纤维化”科学报告，第6卷，no。1、2016年第34597条。视图:出版商的网站|谷歌学者
12. Kuang, Y. S. Chen, L. F. Wang等，“Klotho上调对阿尔茨海默病小鼠模型中藁本内酯的神经保护作用，”衰老神经生物学，第35卷，no。1，页169-178,2014。视图:出版商的网站|谷歌学者
13. N. Tangri, a . Alam, E. C. Wooten和G. S. Huggins，“白种人Klotho基因变异与瓣膜和血管钙化缺乏关联:Framingham后代队列的候选基因研究”肾脏学，透析，移植，第26卷，no。12, pp. 3998-4002, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
14. H. S. Yu, J. J. Kim, H. W. Kim, M. P. Lewis，和I. Wall，“机械拉伸对骨和周围组织细胞行为的影响，”组织工程杂志， 2016年第7卷。视图:出版商的网站|谷歌学者
15. K. Kawano, N. Ogata, M. Chiano等人，“与老年绝经后妇女骨密度相关的Klotho基因多态性”，骨与矿物研究杂志，第17卷，no。10, pp. 1744-1751, 2002。视图:出版商的网站|谷歌学者
16. N. Ogata, Y. Matsumura, M. Shiraki等人，“协会克罗索基因多态性与绝经后妇女骨密度和腰椎病的关系骨，第31卷，no。1, pp. 37-42, 2002。视图:出版商的网站|谷歌学者
17. Y. Yamada, F. Ando, N. Niino和H. Shimokata，“日本女性雄激素受体和klotho基因多态性与骨密度的关系”分子医学杂志第83卷，no。1, pp. 50 - 57,2005。视图:出版商的网站|谷歌学者
18. M. Monchaux, S. Forterre, D. Spreng, A. Karol, F. Forterre和K. Wuertz-Kozak，“与犬椎间盘突出症相关的炎症过程”，免疫学前沿， 2017年第8卷第1681条。视图:出版商的网站|谷歌学者
19. K. L. Phillips, N. Jordan-Mahy, M. J. Nicklin和C. L. Le Maitre，“白细胞介素-1受体拮抗剂缺陷小鼠为人类椎间盘退变的发病机制提供了见解。”风湿病志第72卷，no。11，页1860-1867,2013。视图:出版商的网站|谷歌学者
20. K. T. Weber, D. O. Alipui, C. P. Sison等人，“在患有腰椎间盘疾病的个体中，促炎细胞因子白细胞介素-6的血清水平根据诊断而变化。”关节炎研究与治疗，第18卷，no。1，第3页，2016。视图:出版商的网站|谷歌学者
21. J. J. Park, H. J. Moon, J. H. Park, T. H. Kwon, Y. K. Park，和J. H. Kim，“巨噬细胞样THP-1细胞诱导椎间盘细胞产生促炎细胞因子需要丝裂原激活蛋白激酶活性，”神经外科杂志。脊柱，第24卷，no。1, pp. 167-175, 2016。视图:出版商的网站|谷歌学者
22. M. Sun, R. D. Brady, D. K. Wright等人，“白介素-1受体拮抗剂治疗可减轻多发性创伤后的神经炎症和脑损伤。”大脑、行为和免疫《中国科学》，vol. 66, pp. 359-371, 2017。视图:出版商的网站|谷歌学者
23. 陈冬，夏冬，潘卓等，“二甲双胍对髓核细胞凋亡和衰老的保护作用，并改善椎间盘退变在活的有机体内”,细胞死亡与疾病，第7卷，no。10，第e2441条，2016。视图:出版商的网站|谷歌学者
24. Liu J.， Wang J.， Zhou Y.，“营养剥夺诱导髓核细胞凋亡的BNIP3上调和线粒体转位，”关节，骨骼，脊柱，第79卷，no。2，页186-191,2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
25. F. Bi, F. Chen, Y. Li, A. Wei，和W.曹，“莱茵保存Klotho促进toll样受体4蛋白水解并减弱脂多糖诱导的急性肾损伤”分子医学杂志，第96卷，no。9，页915-927,2018。视图:出版商的网站|谷歌学者
26. S. A. Li, M. Watanabe, H. Yamada, A. Nagai, M. Kinuta，和K. Takei，“klotho蛋白在小鼠脑、肾和生殖器官中的免疫组化定位，”细胞结构与功能，第29卷，no。4，页91-99,2004。视图:出版商的网站|谷歌学者
27. I. Z. Ben-Dov, H. Galitzer, V. Lavi-Moshayoff等人，“甲状旁腺是大鼠FGF23的靶器官，”临床研究杂志，第117卷，no。12, pp. 4003-4008, 2007。视图:出版商的网站|谷歌学者
28. M. C. Hu, M. Shi, J. Zhang等人，“Klotho:一种在肾近端小管中起自分泌酶作用的新型磷酸盐物质，”FASEB期刊，第24卷，no。9, pp. 3438-3450, 2010。视图:出版商的网站|谷歌学者
29. A. Hiyama, F. Arai, D. Sakai, K.横山，和J. Mochida，“氧张力和抗衰老因子的影响克罗索Wnt信号在髓核细胞中的作用关节炎研究与治疗，第14卷，no。3、第R105条，2012。视图:出版商的网站|谷歌学者
30. Y. Maekawa, K. Ishikawa, O. Yasuda等人，“Klotho抑制TNF-α-诱导内皮细胞粘附分子的表达并减弱NF-κB激活。”内分泌，第35卷，no。3, pp. 341-346, 2009。视图:出版商的网站|谷歌学者
31. F. Liu, S. Wu, H. Ren和J. Gu，“Klotho抑制rig - i介导的衰老相关炎症”自然细胞生物学，第13卷，no。3, pp. 254-262, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
32. H. Kurosu, Y. Ogawa, M. Miyoshi等人，“klotho对成纤维细胞生长因子-23信号通路的调控”，生物化学杂志，卷281号10, pp. 6120-6123, 2006。视图:出版商的网站|谷歌学者
33. M. Kuro-o，“Klotho作为成纤维细胞生长因子信号通路和磷酸盐/钙代谢的调节剂，”《肾脏病与高血压杂志，第15卷，no。4, pp. 437-441, 2006。视图:出版商的网站|谷歌学者
34. A. Hiyama, D. Sakai, M. Tanaka等人，“Wnt/β-catenin和TGF-β/BMP信号，”细胞生理学杂志，第226卷，no。5, pp. 1139-1148, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
35. S. Doi, Y. Zou, O. Togao等人，“Klotho抑制转化生长因子-β1 (TGF -β1)信号传递和抑制小鼠肾纤维化和癌症转移，”生物化学杂志，第286卷，no。10, pp. 8655-8665, 2011。视图:出版商的网站|谷歌学者
36. M. Kuro-o，“内分泌fgf和klothos:新兴概念，”内分泌学与代谢趋势，第19卷，no。7, pp. 239-245, 2008。视图:出版商的网站|谷歌学者

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