研究蚯蚓的效果（Aporrectodea molleri）细菌生长的皮肤排泄物

摘要

对细菌生长的影响Aporrectodea molleri皮肤排泄物具有非常令人满意的结果。使用我们的实验室最近开发的电气刺激技术获得皮肤排泄物。该技术使得可以以足够的量收集排泄物，同时排除任何可能的土壤化学成分的干扰。作为不同浓度的细菌生长以不同浓度的培养培养物测试的皮肤排泄物的有效性不仅是由高生长率而合理的，而且由所用浓度低于常规培养基（营养琼脂）的数倍。实际上，记录的最大增长率大肠杆菌和p .荧光分别为1.32倍，比传统介质上观察到的2.99倍。在最佳排泄浓度下获得这些较高水平，分别是比常规介质的浓度低的8倍和133.33倍。界定的疗效间隔占据过排泄浓度的占用8个连续浓度，范围为0.0075％至1％p .荧光，而对于大肠杆菌，这种间隔仅覆盖三种浓度，范围为0.06％，0.25％。增长率p .荧光总是高于大肠杆菌．较高的排泄效率对生长p .荧光表明该菌株更适合利用这些排泄物作为营养来源，并对生长的刺激做出积极的反应。这些结果,获得体外，证明在自然环境中，润滑油的生产和粘性皮肤分泌物不仅促进了运动的作用和画廊的挖蚯蚓还丰富土壤的营养物质和生长因子激活与发展高附加值的植物促生长细菌对土壤肥力至关重要。

1.介绍

蚯蚓是根际的主要动物生物质。根据文献，这些嗜菌动物的巨大质量占每公顷（鲜重）的0.5和5吨（鲜重），其占土壤的动物生物量的60％至80％[1］．在这方面，它们构成了第一个陆生动物群体[2］．

蚯蚓每年每公顷千千万公里的画廊。这些画廊构成了土壤的名副其实的曝气和排水阀。在没有粘性皮肤排泄物（CEX）的情况下，不能挖掘地面中的画廊，这保护蚯蚓免受脱水，促进运动[3.那4.］．皮肤排泄物代表蚯蚓体表面产生的所有液体，包括在蚯蚓体的整个表面的腺体细胞的微孔中产生的粘性粘液，从后面的重晶孔中释放的碳水液，通过腹侧尿液排出尿液毛孔[4.那5.此外，已知引用的流体富含培养物，例如氮化合物和蛋白质[3.］．

陆地生态系统的运作高度依赖于细菌活性。事实上，土壤细菌有效地参与了分解和物质回收过程。在农业中，植物生长促进的根瘤菌（PGPR）促进植物营养素的可用性和吸收，并限制害虫的蔓延[6.那7.］．

细菌和蚯蚓之间的相互作用对于土壤肥力的自然改善至关重要[8.］．此外，这些穴居动物参与细菌群体的动态，并通过其肠道过渡它们在土壤中的分散[9.那10.］．

因此，鉴于这些无脊椎动物的大型生物量和连续生产的CEX，我们的实验室有兴趣研究CEX对细菌生长的影响，特别是在土壤中的PGPR细菌上。在这项工作中，我们研究了蚯蚓原油提取物和CEX作为培养培养基的生长的影响大肠杆菌，在这里用作研究细菌生长的参考菌株，以及p .荧光作为土壤的PGPR应变特征。

2。材料和方法

2.1。生物材料

蚯蚓:Aporrectodea molleri是地中海西部各种生态系统和农业生物群落中普遍存在的一种蚯蚓。这种环节动物是在拉巴特(摩洛哥)东南约20公里的Akrach地区收获的。必威2490

细菌：菌株大肠杆菌ATCC 25922是摩洛哥拉巴特国家卫生研究所(INH)借给我们的。压力假单胞菌荧光属于我们的实验室的收集：蚯蚓，改善Rabat（摩洛哥）的土壤生产力和环境（流逝）。

2．2．蚯蚓皮排泄物(CEX)的制备

由我们的实验室开发的电刺激技术[11.]，包括刺激前、严格刺激感觉和刺激后三个阶段。

推测:这是蚯蚓禁食的阶段。这一步很重要，因为它避免了任何皮肤排泄物与蚯蚓消化道的内容物的干扰，这些内容物在电刺激时通过肛门和口腔孔被拒绝。新鲜重量(FW_EW1 = 843.6 g) ofAporrectodea molleri被剥夺了土壤和食物8-10天。为了防止脱水，蚯蚓的蚯蚓被包裹在湿棉组织中。每两天，润湿的组织更新，然后将整体转移到第二罐中。将操作重复4至5次，直至固体粪便耗尽。通过使用立体镜，可以确保蚯蚓的消化道已经变空。最后，用蒸馏水迅速冲洗蚯蚓。仓虫批次在禁食期后的鲜重量（FW_EW2）确定。

Sensu Sticho刺激：根据电刺激装置（100至200mL）的电刺激装置的体积，从禁食时期的蚯蚓的大量分为5至10个小批次。蚯蚓的收缩促进了皮肤排泄物的大量生产。根据激励容器的体积，每种小蠕虫在20至40毫升蒸馏水中沐浴。连接到双脉冲刺激器型电流发电机的电极浸入与蚯蚓接触的水中。最后，对电压的电气刺激进行电动刺激你= 20v频率F= 100次刺激/秒一段时间T.= 5分钟。

刺激后:在每次严格感官刺激结束时，每个小批被排放到另一个容器中，在那里用蒸馏水冲洗，以回收残留在蠕虫身体上的粘性皮肤排泄物。然后把小批收集成一批，用约瑟夫纸晒干。刺激后的最后新鲜重量(FW_EW3）确定。刺激前初始鲜重（FW）之间的差异是差异_EW2)和刺激后的最终鲜重(FW_EW3）确定产生的皮肤排泄物的鲜重的量（FW_CEX.)．所有来自激发容器和漂洗水的皮肤排泄物都积累起来，然后在烤箱(70°C)中蒸发，直到重量稳定。这是皮肤分泌物的最终干重(DW_CEX.)，用于制备细菌培养基。

2.3。细菌培养基的制备（CEX）

用2 g的排泄物干残渣配制200 mL的原液。用该溶液连续稀释制备细菌培养基。将pH调至中性pH。将200 mL的原液分成2体积的100 mL。第一个体积(100毫升)构成C'₁培养基为1％。将第二体积（100mL）加热至200ml，蒸馏水。均质化后，将该体积分为两个;第一个卷构成了C'₂培养基为0.5％，即稀释因子（FD）等于2x。以与上述相同的方式稀释第二剩余体积（100mL）以获得C'_3.媒体0.25％;fd = 4x。一系列连续稀释液持续到文化媒体C'_4.在0.12% (Fd = 8x)时，C'_5.在0.0.06% (Fd = 16x)，C'_6.0.0.03％（fd = 32x），C'_7.以0.015％（FD = 64X），和C'_8.获得0.0075％（FD = 128x）。

对培养基细菌生长的影响（C₁，......，C_8.)和传统的营养琼脂(NA)培养基进行了比较，后者由2%的可同化营养素组成。

2．4．接种与生长参数

10倍稀释系列从大肠杆菌和p .荧光悬浮液以获得30至300个菌落/盘之间的许多菌落。从稀释含量的菌落中，在30和300之间，沉积0.1ml悬浮液并在每个制备的固体培养基的中心处涂布。最终将培养皿在37°C下温育24小时大肠杆菌在30°Cp .荧光．细菌的生长是由每个培养皿形成的菌落的平均数量(NCF)决定的。

2．5．效率参数

cex的效率（e_CEX.与常规Na培养基相比，表达了两种参数。

相对浓度（RC）：它是CEX的浓度（C_CEX.）相对于Na培养基的浓度（C_NA): rc = (C_CEX./C_NA）×100。

相对增长：它是CEX媒体的增长（G_CEX.)与传统NA媒体(G_NA）：RG =（G_CEX./G_NA）×100。

当RC小于或等于100％时（提取物的浓度小于或等于NA培养基）和RG高于或相等时，CEX将与常规NA培养基有效或更有效100％（提取物中的生长大于或等于Na培养基中的增长）。

当RC和RG不符合上述效率条件时，CEX被描述为无效。

当在小于或等于Na培养基的Cex的浓度下，获得最佳效率时，获得大于或等于Na培养基的最大生长。

2.6。分析统计数据

根据实验模型，对形成的平均菌落数(NCF)进行单因素方差分析(SPSS软件，第22版)。在0.05的概率水平下确定显著性差异，并使用Tukey多重比较检验来比较均数。所有数据均以均数±标准误差表示。

结果

3.1。蚯蚓皮肤护出的产量

少量的皮肤排泄物（CEX）几乎足以进行计划在细菌生长上的生物学试验。电刺激产生的CEX的量取决于所用蚯蚓的数量。然而，在禁食期（预刺激阶段）期间，这种大量的蚯蚓经历了相当大的减少。观察到在禁食期（预刺激阶段）期间估计40％的体重减轻。在此期间的重量损失估计为40％，这不仅是由于生长下降，可观察到蚯蚓的大小和成年蚯蚓中克莱姆的消失，而且是一些死亡率。

在禁食期之前和之后记录的新重量以及在表格之前和之后获得的新重量1和2．还显示了CEX的全部新鲜和干重以及每100克鲜重的蚯蚓的产率。

使用的很多蚯蚓最初重843.6克（FW_EW1)．这种重量从843.6g（fw_EW1)至506.16 g (FW_EW2）在禁食时期（预刺激阶段）之后。我们发现，只有60％的新重量实际上是在Sensu Sticko刺激的阶段中使用的。刺激后，蚯蚓的鲜重滴到437.67克（FW_EW3)．FW之间的鲜重的差异_EW2和fw._EW3间接给出CEX的新重量的金额，FW_CEX. = 68.5 g, i.e., a yield of 13.5%. This fresh yield is estimated in relation to 100 g of the fresh weight of the earthworms after the fasting period (FW_EW2)．实际收集的CEX在70°C下被还原为干燥的残渣。这些排泄物的干重为2.32 g (DW_CEX.)．相对于禁食期(FW)产生的100克鲜重，干重产量估计为0.45%_EW2)．

3．2．皮肤提取物(CEX)对细菌生长的影响

以皮肤排泄(CEX-)为基础的培养基在不同条件下的影响C_N浓度（C₁ = 1%, ....,C_8. = 0.0075%) on the growth of大肠杆菌和p .荧光分别显示在表格3.和4.．在两个表中，我们观察菌落/盘（NCF）的变化作为浓度的函数（C_N）在培养基中排泄。这种变化的程度取决于测试的细菌菌株。

表格3.表明，为此大肠杆菌在应变和高浓度之间C₁= 1%,C_4.= 0.12%，皮肤分泌物对生长有抑制作用。浓度较低时C_5. = 0.06% andC_7.= 0.0015%，生长显著增加( ≤ 0.05) betweenC_6.和C_7.．NCF生长的最大速率= 131.67至132级菌落/盘在这些浓度下记录（C_6.和C_7.)．在浓度C_8. = 0.00075%, the growth is suddenly inhibited. The efficiency of the cutaneous excretions on the growth (E_{cex / na})的相对生长(RG)必须大于或等于NA培养基的100%，相对浓度(RC)必须小于或等于NA培养基的100%。

表中粗体部分确定了CEX满足上述有效性条件的效率区间。在浓度之间的这个区间C_5.和C_7.，相对生长（RG）从110.07％到234.33％。这些值大于Na培养基的相对生长的100％。除了同化为100％的NA培养基相比，相对浓度（RC）的相对浓度（RC）仅为3％至0.75％。

为了p .荧光菌株（表格4.），生长开始于浓度C1 = 1%，为70.67菌落/盘，已高于NA培养基(67.7%菌落/盘)。随着CEX浓度的降低，生长增强，达到NCF = 299.67菌落/培养皿的最大值C_3.浓度= 0.25%。然后，在不同浓度之间，生长逐渐减慢C_4.= 0.12%,C_8.= 0.0075%。然而，我们注意到，在这种低浓度范围内，各自的生长速率远高于Na培养基的生长速率。皮肤排泄物的有效性区p .荧光包括测试的全部浓度范围，从C₁= 1%C_8.= 0.0075%。在该区域，NA介质的相对生长值大于100%。这些值范围从104.38%到340.22%。同时，皮肤分泌物的相对浓度均小于NA的100%。这些值仅在50%到0.39%之间。在C_3.浓度= 0.25％，其中增长是最大的（NCF = 299.67）。在这种浓度下，相对于Na，相对生长为442.64％。相反，与Na相比，相对浓度仅为12.5％。

数字1说明了相对生长（RG）和相对浓度（RC）的平行演变，作为在效率生长的有效性区内CEX浓度的函数大肠杆菌和p .荧光．为了比较，还显示了常规介质NA的RG和RC值，设置为100%。在这个图中，效率对区域的增长大肠杆菌只包括三个浓度(C_7.那C_6.,C_5.），而在p .荧光，该区域涵盖所有排泄浓度(C_8.至C₁)．在两个区域中，两个菌株的相对生长总是大于Na培养基的100％。相反，两个菌株相同的相对CEX浓度总是小于NA培养基的100％。我们注意到相对CEX浓度越低，两个菌株的相对生长越大。

在增长效率区大肠杆菌，234.33％的最大相对生长比Na培养基的100％大2.34倍。在效率领域p .荧光，442.64％的最大相对生长为4.42倍，大于100％的Na培养基。两个菌株的最大相对生长的值的比较表明p .荧光有一个值越高的值1.88倍。

之间的实际最佳CEX浓度C_6.= 0.03%,C_7. = 0.015%, which gave the best growth rate for大肠杆菌，对应于1.5％至0.75％的最佳相对浓度。这些值的66.66倍达到433.33倍，少于100％的Na培养基。同样，实际的最佳浓度C_3.= 0.25%，为最佳增长率p .荧光，对应于仅为12.5％的最佳相对浓度，这是Na培养基的8倍的8倍。

4.讨论

由于蚯蚓代表了第一种陆地动物群体并考虑到这些动物的活动期间永久性的皮肤排泄量，我们的实验室对蚯蚓粗提取物和蚯蚓皮肤排泄物的影响感兴趣，更具体地说，对土壤肥力至关重要的微生物活动。与之相关的研究体外效果可以通过收集这些皮肤排泄以足够的数量进行重复生物测试来理解。我们工作的原创性是它是完全进行的体外在土壤外面，消除了可能干扰土壤的生物和化学成分。此外，蚯蚓禁食期消除了消化道含量干扰的风险。在没有电气刺激皮肤排泄的情况下，不能进行这项研究，由我们的实验室开发的皮肤排泄的技术[11.］．该技术允许在足够的数量和很短的时间内收集皮肤排泄物。本作作品中收集的排泄量为13.53g湿重和0.45g干重。该量从100克鲜各重量的禁食蚯蚓调节。

在这项工作中，通过与已知组合物和浓度的常规培养基（营养琼脂）进行比较确定CEX对细菌生长的有效性。我们能够确认皮肤排泄物（Cex）的粗提物与常规NA培养基相比，细菌生长的细菌生长具有相当大的潜力。此外，知道成年标本的平均鲜重Aporrectodea molleri因此，大约是1g，因此我们可以表达由一个蚯蚓（鲜重）产生的Cex的新鲜重量的效果。的确，浓度C₁=每100毫升1克CEX干重约等于每218.16克新鲜蚯蚓29.52克新鲜CEX，等于13.5^*10.^-2一蚯蚓产生的CEX克克。因此，基于CEX的媒体将在营养和生长物质中更多样化。

基于关于皮肤排泄物（CEX）对细菌生长的影响的结果，可以说CEX的Aporrectodea molleri非常有利于细菌生长。与传统的NA培养基相比，CEX培养基的生长速率高，而且使用的CEX浓度低得多，这证明了它的生长效率。因此，在自然系统中，CEX的Aporrectodea molleri，以少量释放但以持续的方式释放，可能是PGPR细菌的营养素和生长兴奋剂的来源，例如p .荧光．

得到了有趣的结果体外在这项工作中，与直接在自然系统中观察到的结果一致。事实上，据报道，“粘液”，即皮肤分泌物，对微生物活动的刺激和土壤中植物残体的分解有启动作用[12.］．根据Bityutskii等。[12.]，“粘液”通过将腐殖物质增加20％至30％来促进湿度。Oleynik和Byzov [3.]表明蚯蚓皮肤分泌物通过刺激作用影响土壤微生物群落的形成。据黄和夏说[13.]，“粘液”积极刺激蛋白的生长，但在分解期间对压力产生负面影响。这种选择性措施被认为是蠕虫波在蚯蚓氏菌中的蛋白质丰富的原因，其中蚯蚓用于将有机废物转化为肥料[14.］．此外，CEX可提高脱氢酶活性高达20.7% [13.］．根据黄和夏的说法，这结果可以提出[13.]，“粘液”为微生物生长提供了有利的条件。此外，氮和溶解磷的浓度显示出较高的“粘液”值[13.那15.我们的实验室获得的积极结果和文献中引用的那些结果证实了可以通过微生物同化的营养和生长因素的CEX的丰富和多样性。根据Cortez和Bouché[16.]，蚯蚓的“黏液”由69%的蛋白质和肽和31%的碳水化合物组成。此外，构成皮肤分泌物的体腔液和尿液表明存在糖原、氨、尿素、尿酸、尿囊素等多种分子和几种蛋白质[17.］．

5.结论

虽然所有种类的蚯蚓被根际的永久运动动画，但这些动作伴随着皮肤排泄的持续生产。因此，由于其组成的丰富性和多样性，皮肤排泄物将不断使用养分和生长因子来提供土壤，促进PGPR细菌的发育对土壤肥力至关重要的影响。

数据可用性

用于支持本研究结果的数据包括在文章中。

的利益冲突

作者声明本论文的发表不存在任何利益冲突。

致谢

本研究得到了国家科技研究中心(CNRST)优秀科研奖学金项目的支持和资助。

参考

1. M. Bouché，《地球的vers de terre》异国风味的，卷。156，pp.796-804，1984。视图:谷歌学术
2. C. A. Edwards和J.R. rofty，“蚯蚓接种对直接钻谷物根系生长的影响”，“应用生态学报，卷。17，不。3，p。533,1980。视图:出版商网站|谷歌学术
3. A. S. Oleynik和B. A. Byzov，“细菌对蚯蚓表面排泄物的响应”，mikrobiologiya.，卷。77，pp。854-862，2008。视图:出版商网站|谷歌学术
4. S.鲑鱼，“蚯蚓排泄物（粘液和尿液）影响森林土壤中弹簧的分布，”土壤生物学与肥力，卷。34，没有。5，pp。304-310,2001。视图:出版商网站|谷歌学术
5. M.Santocki，A. Falniowski和B.Plytycz，“恢复实验耗尽的少年和成人堆肥蚯蚓Eisenia Andrei，E.Fetida和Dendrobaen Aveneta”，“应用土壤生态学，卷。104，pp。163-173,2016。视图:谷歌学术
6. J. M. Raaijmakers, T. C. Paulitz, C. Steinberg, C. Alabouvette和Y. Moënne-Loccoz，“根际:土壤传播的病原体和有益微生物的游乐场和战场，”植物和土壤，卷。321，没有。1-2，pp.341-361,2009。视图:出版商网站|谷歌学术
7. G. Sellan，J. Thompson，N.Mapalap，R. Robert和F. Q. Brearley，“土壤氮气可用性和pH对热带荒地森林有机物分解和分解活动”的影响“pedobiologia，卷。80，p。150645,2020。视图:出版商网站|谷歌学术
8. F.Wu，J.H.C.Wan，S. Wu和M. Wong，“蚯蚓和植物生长促进rozobacteria（PGPR）对土壤中氮，磷和钾的影响”，“植物营养与土壤科学杂志，卷。175，没有。3，第423-433,2012。视图:出版商网站|谷歌学术
9. M. Aira，M.Pérez-洛萨和J.Domínguez，“蚯蚓茧中的细菌社区的多样性，结构和来源”，科学报告，卷。8，pp。1-9,2018。视图:出版商网站|谷歌学术
10. M.C.Cicón，大教堂，Zuisaire，M. S. Zutara和S.A.Giunta，“鉴定在不同的基质中提出的Eisenia Andrei（Annelida：lumbricidae）的肠道微生物群落”Munis昆虫学与动物学杂志，卷。10，pp。101-106,2015。视图:谷歌学术
11. M. Raouane和A. El Harti，“电刺激对地蚓产生皮肤排泄物的影响”，Bulletin de LaSociétéRoyaledes Sciences deliège，卷。89,2020。视图:出版商网站|谷歌学术
12. N.P.Bityutskii，E.I.Maiorov和N.E. Orlova，蚯蚓粘液诱导的灌注效应对植物残留物的矿化和腐殖质，“欧洲土壤生物学杂志，第50卷，第1-6页，2012。视图:出版商网站|谷歌学术
13. K. Huang和H. xia，“蚯蚓粘液在蠕虫系统中的作用：基于腐殖和微生物活动的生物降解试验”科学总环境，卷。610-611，PP。703-708,2018。视图:出版商网站|谷歌学术
14. Fu x, Cui g, Huang k, et al.，“蚯蚓通过塑造微生物生物量、活性和群落来促进颗粒化脱水污泥的稳定，”环境科学与污染研究，卷。23，不。5，pp。4522-4530,2016。视图:出版商网站|谷歌学术
15. G. G. Brown，I. Barois和P. Lavelle，“在Droilosphere中的土壤有机质动态和微生物活性的调节和与其他助性功能域相互作用的作用”欧洲土壤生物学杂志，卷。36,2000。视图:出版商网站|谷歌学术
16. J. Cortez和M. B. Bouché，“粘液的组成cutané de Allolobophora chaetophora chaetophora(少毛纲:蚓科)”，Comptes Rendus del'Académiedes Sciences III，卷。305，pp。207-210，1987。视图:谷歌学术
17. C. A.爱德华兹和C. J.博伦，蚯蚓生物学和生态学，Chapman＆Hall，伦敦，英国，1996年第3版。

betway赞助

betway赞助版权所有©2021 Lamia Yakkou等。这是分布下的开放式访问文章创意公共归因许可证，允许在任何媒介上不受限制地使用、分发和复制，只要原稿被适当引用。