无肺蝾螈线粒体蛋白编码基因的自然选择模式:轻松的纯化选择和家族中正选择密码子位点的存在

摘要

尾状两栖动物(蝾螈和蝾螈)有两个不同的无肺类群(蝾螈科和蝾螈属)Onychodactylus，来自蟹科)。无肺被认为是在对氧气需求的环境和/或生态适应的反应中进化而来的。我们对无肺蝾螈进行了选择分析，以阐明与无肺相关的线粒体蛋白编码基因的选择模式。分支模型和RELAX分析显示了松弛选择的发生(dN/dS的增加) 值)在长齿娃娃鱼分支的大部分线粒体蛋白编码基因中均有表达，而在长齿娃娃鱼分支的线粒体蛋白编码基因中无表达Onychodactylus。分支模型和RELAX分析表明，直接发育的赘齿动物线粒体基因大多为松弛模式，而变态赘齿动物的松弛基因较少。此外，aBSREL分析在3个褶突分支中检测到正选择的密码子，而在褶突分支中未检测到Onychodactylus。这三个分支中的一个与最近的共同祖先相对应，而其他分支则与半足科直接发展分支的最近的共同祖先相对应。宽齿蜥科线粒体蛋白编码基因的正向选择可能与直接发育的进化有关。

1.简介

大多数真核生物需要氧气来通过有氧呼吸产生能量，这是在线粒体中进行的。动物细胞中的线粒体有自己的基因组，它编码13种蛋白质成分，这些蛋白质成分有助于氧化磷酸化途径的5种酶复合物中的4种[1]: NADH脱氢酶亚基1-6和4 L (nad1- - - - - -64 L)，细胞色素b (cytb)，细胞色素c氧化酶亚单位1-3 (cox1- - - - - -3.)、atp酶F0亚基6和atp酶F0亚基8 (atp6而且atp8)．这些线粒体蛋白亚基与核编码蛋白相互作用，参与有氧呼吸和ATP合成。

经典观点认为，线粒体蛋白质编码基因的大多数变异是选择性中性的(意味着较少收敛的核苷酸替代)。因此，这些基因经常被用来推断种群或物种之间的系统发育关系[2］．人们也普遍认为，线粒体DNA (mtDNA)受到强烈的功能限制[3.］．然而，在动物分类群中，线粒体蛋白编码基因的选择力因多种因素而异，如环境氧环境[4]、机车性能[5，6]，以及生活史模式[7，8］．此外，越来越多的证据表明，线粒体蛋白质编码基因中的氨基酸替换受到适应性进化的影响[9- - - - - -11］．这一过程可能与代谢性能有关[12，13]及/或该动物的生境/环境[14- - - - - -17］．

肺是脊椎动物呼吸系统的主要器官，在现存的四足动物中几乎无处不在。然而，在一些两栖动物中，肺已经退化或丢失。无肺类群存在于所有三个两栖目:无尾目、裸子目和尾目[18- - - - - -20.］．在尾目动物(蝾螈和蝾螈)中，无肺在两个不同的谱系中进化:科Plethodontidae和属Onychodactylus(属于犬科)。蝾螈科是蝾螈中最大的科，包括两个亚科:半爪螈科和蝾螈科。与大多数两栖动物类似，一些赘齿类动物有一个双阶段的生命周期，包括在水中自由游泳的幼虫阶段，然后蜕变成陆地上的成年动物(例如，Desmognathus fuscus而且Eurycea bislineata；这里称为变形褶齿恐龙)。

属中另一种无肺蝾螈Onychodactylus也有这种双相生命周期。然而，大多数多齿恐龙已经适应了陆地环境。它们在陆地上交配和产卵，幼崽在成年时孵化，没有自由游泳的幼虫阶段(直接发育)，使它们的一生只在陆地上度过。虽然宽齿龙也可以通过口咽腔呼吸，但它们的呼吸高度依赖皮肤气体交换[21］．在功能方面，Full等[22]显示，在运动过程中，与弓步蝾螈相比，宽齿龙的最大耗氧量和耐力都是有限的。然而，肺损伤对线粒体基因组的影响尚不清楚。

有人提出，两栖动物(如婆罗洲蛙，Barbourula kalimantanensis，和Eiselt’s cecilia，Atretochoana eiselti)会阻止个体在山溪栖息地向下游漂流，因为在山溪栖息地，肺部的正浮力会使个体无法适应[19，23］．这一假设最初是针对Plethodontidae科提出的[24- - - - - -27］．假设宽齿龙起源于阿巴拉契亚山脉，这种情况很可能与肺的重要性降低有关，因为凉爽、快速流动和富氧的水。然而，基于地质角度，Ruben和Boucot [28]坚持认为，在宽齿恐龙进化的时候，这样的溪流并不存在于阿巴拉契亚地区。另一种假说提出，无肺的赘齿龙是随着行为的转变而进化的，在这种转变中，祖先的赘齿龙的求偶和交配行为不再发生在水中，而是发生在陆地上[29］．这个情景假设在陆地上生殖活动的能量消耗比在水中低。根据这一假设，蝾螈生殖活动所需的氧气较低，导致肺功能的重要性降低。尽管在这些场景之间存在不同的进化假设，但氧气需求被认为是肺复位过程中的重要因素之一;因此，线粒体的性能也很重要。

mtDNA是研究与不同生态特征和呼吸环境相关的生物的局部适应性的一个易于处理的系统。在蝾螈中，肺损伤和行为改变可能与线粒体在能量产生方面的表现有关。在本研究中，我们研究了蝾螈线粒体蛋白编码基因的进化，以澄清选择性约束是否涉及无肺。正如Reagan和Verrell提出的，我们进一步比较了直接发育和变形的宽齿恐龙之间的选择性限制，以理解陆地适应的影响。29］．最后，我们检查了无肺蝾螈线粒体基因的正选择的发生，以分析与无肺相关的Caudata线粒体基因组的进化。

2.材料与方法

2.1.分子数据

我们从国家生物技术信息参考序列中心(RefSeq)数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/)， 2018年4月。由于几个属的序列没有在RefSeq中注册，我们从GenBank数据库下载了另外7个序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)．在初步选择分析中，通过最大似然进化分析(PAML) 4包的编码程序计算[30.]需要很长时间，有时由于分析的序列太多而无法完成。为了避免这个问题，我们从包含两个以上种的属中删除了三分之一的序列(31/93)。最后的数据集(62条序列)涵盖了尾目所有9个科:Ambystomatidae, Amphiumidae, Cryptobranchidae, Hynobiidae, Plethodontidae, Proteidae, Rhyacotritonidae, Salamandridae和Sirenidae。该数据集包括41种弓步蝾螈，2种Onychodactylus种，直接发育的赘齿动物13种，变态赘齿动物6种。

我们分析了四个与线粒体功能无关的核基因，以测试是否在核基因中观察到类似的褶齿龙线粒体基因的选择模式;我们考虑了以下基因:脑源性神经营养因子(脑源性神经营养因子)、原黑皮皮质素(pomc)，以及重组活化蛋白1和2 (rag1而且2)．核基因数据虽未覆盖全部62个类群，但每个基因数据至少覆盖了Caudata目的5个科。每个核基因数据集包含的分类单元数为28个(脑源性神经营养因子)， 38 (pomc)， 42 (rag1)及29 (rag2)。在这个核数据集中，弓鲵类群的数量为15 (脑源性神经营养因子)， 24 (pomc)， 27 (rag1)及20 (rag2)．每个数据集包括八个(脑源性神经营养因子)，九(pomc)，九(rag1)，以及四个(rag2)和五个(脑源性神经营养因子)，五个(pomc)，六(rag1)，以及五个(rag2)变形褶齿动物的分类群。线粒体和核序列的分类单元和登录号见补充表S1。

2.2.序列比对和系统发育分析

根据便携版TranslatorX 1.1版本翻译的推断氨基酸序列[31]与脊椎动物线粒体遗传密码，我们使用快速傅里叶变换程序的多重比对线粒体蛋白质编码基因序列[32］．我们使用Gblocks 0.91b [33]以排除所有包含缝隙的地点。我们使用标准遗传密码选项对四个核基因的核苷酸序列进行比对。我们使用每个线粒体和核蛋白编码基因的校正对齐进行后续选择分析。

我们利用13个线粒体蛋白编码基因的比对数据进行系统发育分析。我们在Phylogears2中使用卡方检验检验了每个基因的每个密码子位置在分类群中核苷酸组成的同质性[34］．因为核苷酸组成的第三个密码子位置除了所有基因atp8，显著偏离同质性( )，我们从系统发育分析中删除了所有基因的第三个密码子位置。最后，我们利用13个基因(26个分区)第一和第二密码子位置的6888个比对位点进行系统发育分析。在系统发育分析中也采用了分区模型。为了确定建议分区的最佳分区方案和替代模型，我们使用贪婪策略[35]在ModelFinder中实现[36]在IQ-TREE版本1.6.3 [37］．各分区的最佳分区方案和替代模型见补充表S2。我们利用最大似然(ML)和贝叶斯推理(BI)方法重建了蝾螈的系统发育。我们使用IQ-TREE 1.6.3版本进行ML分析，并使用1000个重复的非参数自举方法评估结果ML树的鲁棒性。我们从MrBayes 3.2.6版本中推断出BI树[38］．我们进行了1000万代的运行，每1000代采样一次，并在马尔可夫链蒙特卡罗(MCMC)分析中去除初始10%的老化样本。我们通过使用Tracer 1.6版本检查所有大于200的MCMC统计参数的有效样本量分数，确认了链的收敛性到平稳性[39］．我们使用贝叶斯后验概率评估了生成的BI树的鲁棒性。

2.3.选择测验

我们使用PAML 4包的编码程序执行了三种不同的选择方法[30.］．通过codeml进行的这些分析使用LMAP 1.0.2版本自动化[40］．

首先，我们进行了位点模型分析，以研究尾状核系统发育过程中每个线粒体基因的选择力。在场地模型分析中，变异估计在值(=dN/dS比值)，即非同义替换率(dN)与同义替换率(dS)之比在整个系统发育过程中，不同位置的值不同[41，42］．我们首先比较了一个比率模型(M0:值在站点之间是恒定的)，采用离散模型(M3:每个站点属于三个不同的站点之一类别)为每个基因阐明同质性网站之间的价值。接下来，我们进行测试，以检测站点使用以下比较:一个接近中性的模型(M1a:有两个类别，一个是局限于另一个是 )与积极选择模型(M2a:有三个类别，两个像M1a一样受到限制，另一个是 )还有一个 model (M8a:有两个类别，一个来自beta分布[ ]另一个是 )与beta和 M8:有两个类别，一个来自beta分布[ ]另一个是 )．这些型号的名称参考了PAML手册[30.］．基于M0模型对每个基因的初步分析结果，我们应用了初始kappa值和分支长度。使用似然比检验(LRTs)检验这些站点模型的ML值的显著性。

其次，我们使用分支模型[43，44，来探索与无肺相关的价值。我们计算了多齿恐龙的价值，Onychodactylus，并为每个基因向蝾螈猛扑。我们检验了差异的统计学意义介于多齿龙和弓冲蝾螈之间或介于两者之间Onychodactylus并使用LRT对抗它们的嵌套模型。此过程允许数值在多齿龙和其他蝾螈之间或两者之间有所不同Onychodactylus和其他人。此外，我们进行了分支模型分析，以探讨的差异多齿恐龙双相与陆地生活史的比较值弓形蝾螈和直接发育和变态的宽齿兽的价值。因为从双阶段生活史过渡到直接发展的时间尚不清楚[45，46]，我们比较了仅通过假设所有内部分支都有一个单一的尖端分支值ω系统发育的价值。用同样的方法检验统计学意义。我们计算了多齿恐龙的价值，Onychodactylus，并对各基因进行箭弓蝾螈，并将结果与上述分析结果(包括内部分支)进行比较，以验证尖端分支比较的可靠性。

分支模型分析的结果可能会误导测试选择性约束的放松，因为价值受到强化的正向选择的影响。为了避免这个问题，我们使用RELAX [47]在HyPhy 2.5.1版本中实现[48］．RELAX用于使用参数测试放松或强化选择，哪个调节了哪个程度类别偏离了选择中立( )．在测试分支中，当选择放宽时，分布与参考分支相比，Categories接近于1，表示为。的分布则相反Categories远不是1，表示为，当在测试分支中加强选择时。我们使用LRT测试显著性，它比较了null模型(固定为1)到替代模型(是一个可变参数)。我们进行了五项比较:(1)宽齿龙和弓冲蝾螈，(2)Onychodactylus(3)直接发育的长齿龙与弓状长齿龙，(4)变态长齿龙与弓状长齿龙，(5)直接发育的长齿龙与变态长齿龙，与分支模型分析相对应。

我们对四个核基因采用了上述分支模型和RELAX分析的相同程序，不进行比较(2)，因为我们发现线粒体基因的选择模式没有显著差异，除了cytb之间的OnychodactylusVs.弓冲蝾螈。在核基因分析中使用的树形拓扑结构与从线粒体基因数据重建的相同。

最后，研究了线粒体蛋白编码基因的正向选择。为了检测具有积极选择的密码子位点的分支，我们使用aBSREL [49在HyPhy 2.5.1版本中实现。对于aBSREL分析，我们使用每个基因的默认设置和结果ML系统发育。我们使用LRT评估统计学意义。多重比较导致的家族错误率由在aBSREL中实现的Holm-Bonferroni顺序排除程序控制。

我们进一步分析了aBSREL识别的无肺分支，使用分支-位点模型[50，51］．我们使用PAML 4包的编码程序进行了分析[30.］．分支站点模型允许值在站点和分支之间有所不同。我们比较了可供选择的模型，该模型允许站点的一个子集在感兴趣的分支中，使用null模型，该模型将限制应用于检测积极选择的站点的存在。我们使用LRT评估统计学意义。当采用替代模型时，使用贝叶斯经验贝叶斯(BEB)方法来计算一个站点正选择的后验概率(PP) [50］．根据上述初步分析的结果，我们确定了每个基因的kappa值。我们比较了有肺和无肺物种之间的氨基酸化学性质，以了解积极选择对已识别位点的影响，并使用WebLogo 3 [52］．然后，我们按照WebLogo 3的默认方案对每种氨基酸的化学性质进行分类。

3.结果

3.1.系统发育分析

我们利用线粒体蛋白编码基因数据重建了蝾螈的系统发育关系(图1)．基于ML方法的合成树拓扑结构( )与基于BI方法的结果完全相同( )．统计支持在大多数节点(ML引导)较高和贝叶斯 )．虽然在较低分类水平上的几个节点(例如Plethodontinae和Hemidactyliinae亚科内的系统发育关系)得到了较弱的支持，但我们的系统发育结果证实了先前关于蝾螈的分子系统发育研究[53- - - - - -55］．

图1

从13个线粒体蛋白编码基因推断尾状核系统发育(6888 bp)。ML树如下所示。自举支持和贝叶斯后验概率( ， )表示在每个节点上。粗体的物种名称表示直接发育的物种。灰色的树枝显示了弓步蝾螈的谱系。分支A, B, C表示abrel检测到密码子位点正选择的褶突分支。

3.2.选择分析

我们使用位点模型分析来检查尾状核系统发育过程中每个线粒体蛋白编码基因中选择性力的一般模式(补充表)S3)．首先，我们比较了M0模型(常数ω模型)与M3模型(三变量模型)。我们拒绝了M0模型( )在所有基因中。这个结果表明不同站点的数值不同。接下来，我们比较了M1a(双变量模型: ， )与M2a(三变量模型: ，， )和M8a (beta分布和模型:遵循beta分布和 )与M8 (beta分布和模型:遵循beta分布和ω₁>1)在整个系统发育过程中检测积极选择的位点。对于所有基因，两个假设没有正选择位点的空模型(M1a和M8a)没有被拒绝( )．这些结果表明，负选择是蝾螈线粒体基因的主要进化趋势。我们计算了多齿恐龙的价值，Onychodactylus和采用分支模型的弓冲蝾螈(表1)，以研究无肺蝾螈的选择限制。


比较	基因	分支模型				放松
比较	基因	－2ΔlnL (d.f. = 1)	P	ω1	ω2	－2ΔlnL (d.f. = 1)	P	k

宽齿螈科vs.弓鼻蝾螈	atp6	-11.0074	0.001	0.046	0.033	-22.0306	0.000	0.722
	atp8	-0.7743	0.379	0.142	0.138	-0.2942	0.588	0.684
	cox1	-45.3786	0.000	0.013	0.007	-30.5404	0.000	0.842
	cox2	-42.3632	0.000	0.035	0.017	-50.8092	0.000	0.625
	cox3	-3.9068	0.048	0.033	0.028	-6.8323	0.009	0.891
	cytb	-1.4472	0.229	0.036	0.033	-4.4370	0.035	0.849
	nad1	-4.6464	0.031	0.030	0.025	-6.3163	0.012	0.852
	nad2	-36.1991	0.000	0.069	0.045	-28.5936	0.000	0.706
	nad3	-1.6005	0.206	0.054	0.046	-7.5547	0.006	0.784
	nad4	-16.1672	0.000	0.049	0.038	-11.2847	0.001	0.886
	nad4L	-0.4267	0.514	0.043	0.039	-0.2034	0.652	0.953
	nad5	-19.6304	0.000	0.056	0.044	-44.8124	0.000	0.759
	nad6	-21.7759	0.000	0.072	0.040	-29.7902	0.000	0.614

OnychodactylusVs.弓冲蝾螈	atp6	-0.9611	0.327	0.024	0.033	-0.0133	0.908	1.036
	atp8	-0.0915	0.762	0.105	0.138	-0.3936	0.530	7.676
	cox1	-1.2064	0.272	0.005	0.007	-1.2101	0.271	1.111
	cox2	-0.0705	0.791	0.016	0.017	-0.1654	0.684	1.019
	cox3	-0.1605	0.689	0.031	0.028	-0.9278	0.335	0.876
	cytb	-4.7672	0.029	0.020	0.033	-5.2470	0.022	1.477
	nad1	-0.9503	0.330	0.019	0.025	-0.5157	0.473	1.103
	nad2	-0.4529	0.501	0.053	0.045	-0.1290	0.719	0.968
	nad3	-0.0766	0.782	0.051	0.046	-1.4217	0.233	1.115
	nad4	-0.0001	0.994	0.038	0.038	-0.6303	0.427	1.129
	nad4L	-0.7078	0.400	0.025	0.039	-0.8172	0.366	1.337
	nad5	-0.1328	0.716	0.047	0.044	-0.0149	0.903	1.017
	nad6	-0.5708	0.450	0.054	0.040	-1.4766	0.224	0.690

显示斜体的值。而且表明分别在测试分支和参考分支中的值。这两个数值是根据替代模型计算的。

结果表明所有线粒体蛋白编码基因的值，宽齿龙均高于弓腿鲵。我们检测了统计学意义( )九个基因(atp6，cox1- - - - - -3.，nad1，2,4 - 6)．在Onychodactylus,五个基因的值(cox3，nad2，3.，5,6)高于弓冲蝾螈，尽管差异没有统计学意义。另一方面，的价值cytb在Onychodactylus显著低于弓冲蝾螈( )．为了确认没有内部分支的分支模型分析的鲁棒性，我们比较了宽齿龙与弓状蝾螈末端分支的数值。结果表明11个基因的值(atp6，cox1- - - - - -3.，cytb,nad1-6)在长齿娃娃鱼中比在弓头娃娃鱼中更高，并且在9个基因(atp6，cox1，2，cytb，nad1，2,4 - 6)(表S4)．虽然四个基因的值(nad3-6)Onychodactylus均高于弓突类群，差异无统计学意义。因此，基于末端分支的分支模型分析结果与基于末端分支和内部分支的分支模型分析结果相似，即长齿蝾螈具有更高的分支价值比弓冲蝾螈。

接下来，我们应用分支模型分析，使用终端分支进行比较直接发育的宽齿龙、变形的宽齿龙和弓冲蝾螈的价值。对于直接发育的宽齿龙和弓冲蝾螈的末端分支比较，本文所有基因的值，除了nad4L的差异九个基因的值(atp6，cox1- - - - - -3.，nad1，2,4- - - - - -6)均有统计学意义( )(表2)．


比较	基因	分支模型				放松
比较	基因	－2ΔlnL ( )				－2ΔlnL ( )

长齿蝾螈科DD vs.弓鼻蝾螈	atp6	-7.4708	0.006	0.048	0.033	-14.0500	0.000	0.773
	atp8	-0.0262	0.871	0.147	0.139	-0.0706	0.790	1.222
	cox1	-45.1340	0.000	0.015	0.007	-34.4024	0.000	0.826
	cox2	-45.5633	0.000	0.044	0.018	-51.4044	0.000	0.555
	cox3	-6.7130	0.010	0.039	0.028	-8.6419	0.003	0.842
	cytb	-2.2026	0.138	0.035	0.030	-4.8904	0.027	0.827
	nad1	-8.5458	0.003	0.032	0.023	-10.9626	0.001	0.762
	nad2	-33.2628	0.000	0.072	0.041	-32.1149	0.000	0.652
	nad3	-0.2201	0.639	0.053	0.049	-9.6473	0.002	0.689
	nad4	-18.0457	0.000	0.055	0.038	-17.7786	0.000	0.826
	nad4L	-0.0002	0.989	0.040	0.040	0.0000	1.000	1.000
	nad5	-16.8708	0.000	0.055	0.040	-38.3770	0.000	0.803
	nad6	-11.6646	0.001	0.073	0.042	-13.0165	0.000	0.705

MM宽齿螈科vs.弓鼻蝾螈	atp6	-4.4268	0.035	0.049	0.033	-1.6165	0.204	0.859
	atp8	-0.4924	0.483	0.101	0.139	-1.4104	0.235	1.759
	cox1	-0.0082	0.928	0.007	0.007	-0.5711	0.450	1.047
	cox2	-2.5963	0.107	0.024	0.018	-2.2037	0.138	0.914
	cox3	-1.9094	0.167	0.022	0.028	-1.4144	0.234	1.132
	cytb	-4.5094	0.034	0.040	0.030	-1.4137	0.234	0.800
	nad1	-1.2678	0.260	0.027	0.023	-0.3337	0.564	0.967
	nad2	-5.3517	0.021	0.056	0.041	-5.3525	0.021	0.851
	nad3	-2.4007	0.121	0.071	0.049	-1.9701	0.160	0.763
	nad4	-0.0627	0.802	0.039	0.038	-0.6735	0.412	1.057
	nad4L	-0.0001	0.994	0.040	0.040	-0.1075	0.743	1.065
	nad5	-4.5264	0.033	0.050	0.040	-13.2843	0.000	0.834
	nad6	-6.8491	0.009	0.077	0.042	-9.0366	0.003	0.679

宽齿蛛科DD vs宽齿蛛科MM	atp6	-0.0041	0.949	0.048	0.049	-0.4736	0.491	0.832
	atp8	-0.5788	0.447	0.147	0.101	-1.4551	0.228	0.617
	cox1	-17.9793	0.000	0.015	0.007	-18.0031	0.000	0.573
	cox2	-8.2538	0.004	0.044	0.024	-7.8247	0.005	0.647
	cox3	-8.4264	0.004	0.039	0.022	-10.0902	0.001	0.614
	cytb	-0.8062	0.369	0.035	0.040	-0.7953	0.373	0.892
	nad1	-0.8558	0.355	0.032	0.027	-1.6064	0.205	0.824
	nad2	-3.1405	0.076	0.072	0.056	-3.0969	0.078	0.835
	nad3	-1.2157	0.270	0.053	0.071	-0.3625	0.547	0.905
	nad4	-6.4172	0.011	0.055	0.039	-12.1234	0.000	0.809
	nad4L	-0.0003	0.987	0.040	0.040	-0.4868	0.485	0.846
	nad5	-0.6011	0.438	0.055	0.050	-49.3683	0.000	0.944
	nad6	-0.0398	0.842	0.073	0.077	-0.6219	0.430	1.084

显示斜体的值。而且表明分别在测试分支和参考分支中的值。这两个数值是根据替代模型计算的。DD和MM分别代表直接发育类群和变质类群。

在变形的褶齿动物中10个基因的值(atp6，cox2，cytb，nad1- - - - - -6,4L)高于弓突类群，其中五个基因的值(atp6，cytb，nad2，5,6)显示意义( )．在比较直接发育的赘齿动物与变态的赘齿动物之间的差异，8个基因(atp8，cox1- - - - - -3.，nad1，2，4，5)更高直接发展分支机构的值，其中四个(cox1- - - - - -3.，nad4)基因显示显著性( )．差异无统计学意义变形类群与直接发育类群的比较。这些结果表明，直接发育的赘齿生物比变态发育的赘齿生物表现出潜在的更宽松的纯化选择。

选择性的约束，也就是不同的程度类别偏离中立( )，采用RELAX软件进行进一步分析。当比较宽齿龙和弓步蝾螈时，所有基因的选择限制都明显放松( ， )在多齿动物中，除了atp8而且nad4L（， )(表1)．在比较中Onychodactylus对于弓步蝾螈，几乎没有显著的基因( )，除了cytb（， )．当我们比较直接发育的宽齿龙和弓步蝾螈之间的选择约束时，所有基因都表现出明显的选择约束松弛( ， )，除了atp8而且nad4L（， )直接发育的褶齿动物(表2)．另一方面，只有三个基因(nad2，5，6)与弓突类动物相比，变形棘齿动物的松弛程度明显( ， )，但我们没有检测到其他基因的显著差异( )．在直接发育和变态发育的类群比较中，5个基因(cox1- - - - - -3.，nad4，5)显示直接发育物种的选择压力明显松弛( ， )，但我们没有检测到这些组之间其他基因的显著差异( )．这些结果与分支模型分析的结果基本一致，证实了直接发育的赘齿动物线粒体蛋白编码基因的选择比变态赘齿动物更为宽松的趋势。

对于核数据集，采用带有内部分支的分支模型分析方法，估计了核数据集的误差三个基因的值(pomc，rag1,rag2)在宽齿龙类动物中比在弓步蝾螈中更高，尽管差异仅在rag1(表3.)．具有内部分支的RELAX分析显示，在rag1而且rag2。在没有内部分支的情况下，无论是分支模型还是RELAX分析，都没有导致宽齿龙和弓冲蝾螈之间的显著差异。在直接发育类群、变态类群和弓步类群的比较中，除了变态类群和弓步类群的分支模型比较外，在选择约束上没有显著差异pomc(显示高ω在弓步蝾螈中)。因此，核基因的估计选择模式与线粒体基因的不一致。其中，直接发育的宽齿龙的大部分线粒体基因的选择限制较弓冲鲵有所放松，但核基因的选择模式在这两个类群之间没有明显变化。


比较	基因	分支模型				放松
比较	基因	－2ΔlnL ( )				－2ΔlnL ( )

(所有分支机构)

宽齿螈科vs.弓鼻蝾螈	脑源性神经营养因子	0.0317	0.859	0.020	0.021	0.0742	0.785	1.033
	pomc	1.5407	0.215	0.087	0.084	0.0440	0.834	1.035
	rag1	9.8984	0.002	0.073	0.046	9.2968	0.002	0.670
	rag2	1.5442	0.214	0.173	0.142	7.0458	0.008	0.708

(分支)

宽齿螈科vs.弓鼻蝾螈	脑源性神经营养因子	0.2244	0.636	0.017	0.024	0.4279	0.513	1.111
	pomc	0.8963	0.344	0.078	0.103	1.2456	0.264	1.424
	rag1	2.7077	0.100	0.079	0.058	2.7967	0.094	0.790
	rag2	1.8219	0.177	0.217	0.164	2.4296	0.119	0.796

长齿蝾螈科DD vs.弓鼻蝾螈	脑源性神经营养因子	0.5339	0.465	0.012	0.022	0.7742	0.379	1.183
	pomc	0.0061	0.938	0.105	0.103	0.3638	0.546	1.313
	rag1	1.6841	0.194	0.077	0.058	1.6312	0.202	0.443
	rag2	0.3989	0.528	0.193	0.164	0.6024	0.438	0.811

MM宽齿螈科vs.弓鼻蝾螈	脑源性神经营养因子	-0.0371	- - - - - -	0.026	0.022	0.0037	0.951	1.013
	pomc	5.7446	0.017	0.041	0.103	1.8583	0.173	1.607
	rag1	1.8707	0.171	0.082	0.058	2.6868	0.101	0.807
	rag2	2.3532	0.125	0.249	0.164	3.1834	0.074	0.672

宽齿蛛科DD vs宽齿蛛科MM	脑源性神经营养因子	0.4522	0.501	0.012	0.026	0.3311	0.565	1.229
	pomc	3.4992	0.061	0.105	0.041	0.4250	0.514	0.816
	rag1	0.0406	0.840	0.077	0.082	0.5278	0.468	1.106
	rag2	0.6134	0.434	0.193	0.249	0.6722	0.412	1.483

显示斜体的值。而且表明分别在测试分支和参考分支中的值。这两个数值是根据替代模型计算的。DD和MM分别代表直接发育分支和变质分支。带圆括号的All分支和终端分支分别表示所有分支(内部分支和终端分支)和仅终端分支的比较。Dash展示了由于替代模型的lnL比null模型低，因此无法计算出值。

aBSREL分析从5个基因中检测出8个不同的阳性选择分支( )如下:革齿科的最近共同祖先(MRCA) (nad4，5）;MRCA的Batrachoseps（nad3）;MRCA的Thorius，Oedipina,Bolitoglossa（nad6）;雀鸟科的MRCA (nad5）;流纹蝽科、水仙科及圆齿蝽科的MRCA (cytb）;蛋白质科的MRCA (nad4）;蝾螈科MRCA (nad1，2，4，5）;和MRCATriturus，Pachytriton,Paramesotriton（atp6)．在这个分析中，没有一个Onychodactylus分支在各基因中均表现出显著的正向选择。对于我们在上述分析中检测到显著正选择的褶状动脉分支，我们使用codeml程序通过分支-位点模型分析进一步检查了正选择的密码子位点(表2)4)．我们在一个替代模型(正选择下的一个位点子集)和一个零模型(正选择下的没有位点)之间进行了LRT，以测试每个基因中正选择位点的存在。另一种模型在nad4而且nad5这与aBSREL分析的结果相吻合。但是，空模型没有被拒绝nad3的MRCABatrachoseps而且nad6的MRCAThorius，Oedipina,Bolitoglossa。在nad4而且5对于祖先的褶齿恐龙，我们使用在codeml程序中实现的BEB程序计算了积极选择的地点的后验概率。总的来说，我们估计了两个密码子位点(40和352)nad4和三个密码子位点(23,241和491)nad5在祖先的褶齿动物谱系中受到正向选择( )．


分支	基因	－2ΔlnL ( )		积极选择的地点

一个	nad4	-8.3999	0.004	40
	nad4			352
	nad5	-9.5527	0.002	23
				241
				491

B	nad6	-0.0110	0.916

C	nad3	0.0000	1.000

斜体表示。对LRT检测阳性选择的基因，用BEB分析估计阳性选择位点。只有所示。而且代表和>0.99。分支标签被称为图1。

在比较宽齿蜥科和弓鲵的氨基酸化学性质时，我们发现正选择位点nad4在弓步蝾螈中，Asn高度占据，它代表中立(图2)．而宽齿藻科这些位点的氨基酸主要为疏水氨基酸(即Leu、Met和Pro)。在积极选择的地点nad5在蝾螈中，大多数氨基酸是疏水的(即Leu, Met, Phe和Pro)，而在弓腿蝾螈中，大部分氨基酸是碱性氨基酸(即Lys)，在23和491位点是极性氨基酸(即Tyr, Ser和Thr)和疏水氨基酸(即Phe, Leu和Ile)。

4.讨论

4.1.蝾螈线粒体蛋白编码基因的选择性约束

我们研究了蝾螈线粒体蛋白编码基因的自然选择趋势，特别关注无肺类群。站点模型分析(M1a vs. M2a和M8a vs. M8)显示对于整个蝾螈系统发育的所有基因，表明这些基因通常是在净化选择下进化的。这一结果与脊椎动物线粒体蛋白编码基因的一般进化模式一致(例如，[56])。

我们的分支模型和RELAX分析表明，长齿蝾螈倾向于有更高的线粒体蛋白编码基因的价值高于其他类群Onychodactylus物种表现出与弓冲蝾螈相似的趋势。通过进一步分析，我们发现直接发育物种的大部分基因(分支模型和RELAX分析分别为9个和11个)的选择约束都比弓步蝾螈宽松，但只有3个基因(nad2，5,6)。这些结果表明，在蝾螈中，无肺与线粒体基因组的选择性限制相关性较小。相反，我们发现宽齿龙线粒体蛋白编码基因选择性约束的放松与直接发育分支高度相关，对此有两种可能的解释。一种可能是由于能源需求。在两栖动物的特定群体中观察到线粒体蛋白质编码基因的宽松选择，这些群体被假设具有较低的能量需求[57]，鸟[6]， fish [8]，以及昆虫[5］．里根和弗瑞尔[29)提出，对蝾螈来说，在陆地上繁殖活动的能量消耗比在水中低。此外，之前的研究集中在钝口螈属欧显示，怀孕雌鱼的游泳能力低于雄性和产后雌鱼[58，这意味着在水生环境中繁殖的能量消耗比在陆地环境中更高。在陆地上繁殖的直接发育的宽齿恐龙可能会从这种能量限制中释放出来，导致对线粒体基因的选择放松。

另一种解释是遗传漂变对直接发育的宽齿恐龙选择性限制的放松。一般来说，直接发育的物种有相对较小的窝大小。这一特征可能会导致较小的种群规模，增加由于遗传漂变引起的有害突变的易感性。这一建议得到了一项哺乳动物线粒体基因研究的支持[59]，这表明种群规模小的哺乳动物积累了更多的非同义核苷酸取代，相对于同义取代的数量。如果后一种假设是正确的，那么基因漂变不仅会影响线粒体，还会影响核基因。然而，我们的分支模型和RELAX分析并没有显示直接发育的宽齿龙的四个核基因都有选择性约束的放松，与弓冲蝾螈和变形的宽齿龙相比。因此，我们的结果表明，种群大小的差异并不是直接发育的宽齿突动物松弛模式的主要原因。

4.2.线粒体蛋白编码基因的正向选择

abrel分析发现，所有尾状核谱系中有8个分支存在正选择。这些分支几乎与主要蝾螈类群的祖先谱系一致(例如，Proteidae, Salamandridae和Sirenidae的mrca)。在革齿蝗科内，革齿蝗科的MRCA在革齿蝗科中有显著的阳性选择nad4而且nad5， MRCA的Batrachoseps在nad3，以及三种多齿藻属的MRCA (Bolitoglossa，Oedipina,Thorius)nad6(分支A，分支B，分支C，图1)．其中，后两个分支与Hemidactyliinae中直接发育的plethodontids的mrca一致(图1)．直接发育是尾科巨齿动物的特有特征。前人基于祖先性状重建的研究表明，Plethodontidae的MRCA发育模式很可能指导发育[60- - - - - -62］．褶齿动物的正向选择似乎与直接发育的进化相一致。

在对一些线粒体蛋白编码基因进行阳性选择的三个褶齿分支中，褶齿科的MRCA在nad4而且nad5在分支点模型分析中得到验证。分支站点模型分析确定了五个积极选择的站点nad4而且nad5用BEB法对扁齿藻科的祖先谱系进行了研究。当我们比较每个位点的氨基酸组成时，我们发现宽齿龙相对于弓步蝾螈具有更多的疏水残基(图2)．高疏水性氨基酸残基数量的增加通过疏水相互作用有助于蛋白质的稳定[63］．因此，在正向选择位点观察到的疏水氨基酸的取代可能表明正向选择有助于更高的蛋白质稳定性。

4.3.无肺蝾螈的进化意义

本研究表明，Plethodontidae的线粒体蛋白编码基因的进化模式与另一种无肺类群(Onychodactylus)和许多其他弓步蝾螈。在宽齿蜥科中发现了积极选择和宽松选择的信号。这些选择模式与肺损伤无关，而与直接发育的进化有关。相比之下，其他无肺的蝾螈，比如来自Onychodactylus，具有两期生活史，需要凉爽的地下流水来繁殖[64，65］．这一特征与无肺进化的主要假设是一致的。因为两者的选择性约束无显著差异Onychodactylus猛扑的蝾螈，Onychodactylus由于它们的环境和/或通过皮肤和口咽腔进行的气体交换，物种可以获得足够的氧气。

近年来利用祖先状态重建的研究支持了祖先Plethodontidae的生活史模式为直接发育[60- - - - - -62］．这些结果反驳了一个主要的假设，即蝾螈的无肺是为了适应湍急的河流环境而进化而来的[25- - - - - -27]因为这种适应主要集中在水生自由游泳的幼虫身上[24］．由于直接发育的宽齿龙不需要水环境，Reagan和Verrell提出的另一个假设[29无肺起源于陆地适应是更合理的。Reagan和Verrell的假设认为，对于双相蝾螈(如大多数Ambystomatidae和Salamandridae)来说，生殖活动(即迁移到繁殖地、求偶、交配和在水中产卵)需要消耗大量能量。这种陆地适应会降低蝾螈的能量需求，导致低氧需求，随后肺部的重要性降低。分支模型和RELAX分析的结果表明，遗传漂变不会导致直接发育的宽齿恐龙由于种群规模减少而导致线粒体基因选择限制的放松。如果这种放松的选择约束源于线粒体蛋白的放松的功能约束，那么Reagan和Verrell的假设就得到了支持。关于线粒体蛋白编码基因的进一步研究可能有助于揭示长齿蝾螈的进化史。

数据可用性

支持本研究结果的序列数据保存在国家生物技术信息中心数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)．在本研究中产生的接入编号列表载于补充表S1。

利益冲突

作者声明，关于这篇论文的发表没有任何利益冲突，财务或其他方面。

致谢

我们感谢广岛大学的古野博士提出的宝贵建议。作者要感谢Enago (http://www.engao.jp/)浏览英文语文复习。

补充材料

我们提供了额外的表格文件如下:补充表S1:本研究使用的线粒体基因组序列。补充表S2:系统发育分析的最佳拟合分区方案和替代模型。补充表S3:场地模型分析结果。补充表S4:不含内部分支的分支模型分析结果。（补充材料)

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国际基因组学杂志