AmpCβ-内酰胺酶变量在埃及开罗某三级医院常见耐多药医院致病菌中的表达

摘要

的出现AmpC（pAmpC）β-内酰胺酶对第三代头孢菌素的耐药已成为全世界临床关注的主要问题。在本研究中，我们旨在评估的表达AmpCβ-内酰胺酶编码基因的致病性革兰氏阳性和革兰氏阴性耐药菌筛选的临床样本中登记在埃及开罗的El-Qasr El-Ainy三级医院的埃及患者。该物种共有153个细菌分离株铜绿假单胞菌,肺炎克雷伯菌,而且肠球菌都有效从诊断为尿路感染(UTI)、呼吸道感染(RTI)和伤口感染的患者中分离出来。的总数大肠都有效分离株为53株，其中尿分离株29株，痰分离株5株，伤口拭子分离株19株铜绿假单胞菌分离物49株，其中尿分离物27株，痰分离物7株，伤口拭子分离物15株k .肺炎分离物51株，其中尿分离物20株，痰分离物25株，伤口拭子分离物6株。我们的结果表明，在表达上无显著差异AmpCβ-内酰胺酶基因与感染类型和/或临床标本相关。的表达模式AmpCβ-内酰胺酶基因根据被测菌株的耐药特性有显著差异。

1.简介

20世纪将抗生素引入临床实践，以对抗传染病和微生物，这无疑是人类文明的福音，挽救了数十亿人的生命。然而，抗菌素耐药性在过去几十年一直在稳步增加，并已成为人类发病率和死亡率的一个全球性致病威胁[1］．在美国，每年有6.3万多名患者死于医院获得性细菌感染。同样，在欧洲，估计每年有2.5万名患者死于耐多药细菌感染。抗生素的广泛和不谨慎使用在很大程度上促成了耐药微生物菌株的出现[2］．对第三代头孢菌素类、喹诺酮类和碳青霉烯类等抗菌剂的耐药性继续急剧增加，特别是在革兰氏阴性细菌病原体中[3.］．

根据世界卫生组织(WHO) 2017年发布的全球抗微生物细菌优先清单，铜绿假单胞菌,肺炎克雷伯菌,而且肠球菌都有效属于关键或高度优先的常见卫生保健相关病原体[4］．铜绿假单胞菌是一种需氧革兰氏阴性菌，可在住院患者、免疫功能低下的宿主和囊性纤维化患者中引起感染。因此，它是世界上主要的医院感染病原体之一，可引起严重的医院感染，如肺炎、尿路感染(UTI)、血流感染(BSI)、手术部位感染。和皮肤感染[5］．它还可引起社区获得性感染，包括溃疡性角膜炎、外耳炎以及皮肤和软组织感染[6］．它是越来越多报道和普遍识别的耐多药甚至泛耐药细菌之一[5］．肺炎克雷伯菌是一种革兰氏阴性菌，与多种感染有关，如泌尿道感染、肺炎、腹腔内感染、BSI、脑膜炎和化脓性肝脓肿(PLA) [7),而肠球菌都有效是一种革兰氏阳性细菌，在20世纪70年代和80年代开始成为耐多药医院获得性感染的主要原因，目前它是血流、尿路、手术伤口和其他部位的医院获得性感染的主要原因之一。在混合感染中还发现伴专性厌氧菌，从而导致腹腔脓肿[8］．

AmpC型酶是β-内酰胺酶，介导对头孢霉素、头孢唑啉、头孢西丁、大多数青霉素和β内酰胺酶抑制剂,β-内酰胺组合物[9］．这些酶可能编码在不同微生物的染色体上，包括肠杆菌科的许多成员，也可能编码在含有基因编码的可传播质粒上AmpC细菌中缺乏或表达染色体酶的酶[10］．碳青霉烯类通常可用于治疗由AmpC第细菌。然而，碳青霉烯耐药可能在某些微生物中通过减少内流(外膜孔蛋白丢失)或增强外排(外排泵激活)的突变而产生[10］．AmpCβ-内酰胺酶几乎不能降解碳青霉烯类，但它们可以将碳青霉烯类共价结合到外质上，阻止碳青霉烯类接触靶点[11］．在埃及，对第三代头孢菌素的抗菌素耐药性正在上升，导致医院暴发。然而，一些当地研究分析了这些耐药性增加背后的潜在基因。因此，在我们的研究中，我们旨在通过评估表达的作用来解决抗生素耐药的困境AmpCβ-内酰胺酶编码基因的选择革兰氏阳性和革兰氏阴性耐多药细菌，这些细菌通常导致在埃及开罗的El-Qasr El-Ainy三级医院登记的患者感染。我们选择的耐多药细菌病原体是铜绿假单胞菌,k .肺炎而且大肠都有效．它们被列入世卫组织全球抗微生物耐药性细菌优先清单，作为具有关键优先的病原体(铜绿假单胞菌而且k .肺炎)或优先级较高的(大肠都有效) [4］．此外，之间的相关性AmpCβ-内酰胺酶表达与不同菌株(革兰氏阳性或革兰氏阴性)的类型及其分离来源的相关性AmpCβ-内酰胺酶表达基因型和AmpCβ-内酰胺酶表型研究。

2.材料与方法

本研究的实验设计总结如图所示1．

2.1.细菌分离物和临床样本

这项研究是在《赫尔辛基宣言》之后进行的，并得到赫利奥波利斯大学和埃尔- qasr El-Ainy医院伦理委员会的批准。获得所有参与者的书面知情同意。这些样本于2016年12月至2018年1月从El-Qasr El-Ainy医院的住院患者中收集。从临床样本中获得的153株细菌分离株被鉴定为该物种铜绿假单胞菌,k .肺炎而且大肠都有效．利用常规微生物学方法(培养特性)对细菌分离株进行种级鉴定，并用Vitek 2系统(bioMérieux;Marcy l’etoile，法国)。

这些分离物分别从尿路感染(UTIs)、呼吸道感染(RTIs)和伤口感染患者的尿液、痰液和伤口拭子等不同临床样本中回收。的总数大肠都有效分离株为53株，其中尿分离株29株，痰分离株5株，伤口拭子分离株19株铜绿假单胞菌分离物49株，其中尿分离物27株，痰分离物7株，拭子分离物15株。的总数k .肺炎分离物51株，其中尿分离物20株，痰分离物25株，伤口拭子分离物6株。

2.2.抗微生物药物敏感性试验

根据临床和实验室标准协会描述的标准协议、指南和解释标准，使用不同种类的抗菌药物进行抗菌药敏试验和最低抑菌浓度(MIC)测定[12］．标准菌株铜绿假单胞菌写明ATCC 27853,k .肺炎ATCC 70060和肠球菌都有效ATCC 19434 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)被用作生产的阳性对照AmpCβ内酰胺酶。大肠杆菌ATCC 25922作为生产的阴性对照AmpCβ内酰胺酶。

2.3.检测AmpCβ-内酰胺酶表型

2.3.1.头孢西汀-氯唑西林双盘协同试验(CC-DDS)

这个测试是用来确定生产AmpCβ-内酰胺酶。简单地说，试验分离物的0.5-McFarland悬浮液是从过夜培养中制备的。然后，将调整后的悬浮液用无菌拭子接种Muller-Hinton琼脂板。包含30张的光盘µG头孢西丁加200µG氯唑西林的抑制剂AmpC酶)被添加到Muller-Hinton琼脂表面。最后在35°C下孵育16-18小时。头孢西汀-氯唑西林抑制带减去单独头孢西汀抑制带的差异≥4毫米被认为是指示性的AmpC生产(13- - - - - -15］．

2.4.量化的AmpCβ-内酰胺酶编码基因表达

2.4.1.总RNA提取

细菌分离株接种到5毫升等分LB (Luria-Bertani)肉汤培养基中，在37°C摇动(200 rpm)孵育一夜。接下来，分离株在50 mL LB肉汤培养基等分液中继代培养，并让其生长至光密度(OD600 nm)为0.6-0.8;然后，以14000 rpm的转速离心收集细胞球。使用GeneElute细菌总RNA纯化试剂盒(Sigma Aldrich, USA)从每个分离物中提取总RNA，并按照制造商的协议在不含rnase的水中洗脱。使用2 U的DNase I, RNase-free酶(Puregene, India)去除DNA污染物。使用NanoDrop仪器(Nano-100, UK)测定RNA浓度和纯度。最终提取的RNA浓度铜绿假单胞菌,k .肺炎而且大肠都有效10µ15克,µG和12µOD 260/280比测定的纯度在1.7 ~ 1.9之间[16］．

2.4.2.cDNA合成及实时荧光定量pcr (RT-qPCR)实验

利用提取的细菌分离物RNA模板合成互补DNA (cDNA)。首先，使用HisenscriptTmRH[−]cDNA合成试剂盒(韩国iNtRON Biotechnology)使用PCR热循环器(英国a & E Lab)将30ng纯化的RNA反转录为cDNA。然后,5µl的cDNA使用Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix (2X) (ThermoFisher Scientific, USA)和StepOne Plus实时PCR系统(Applied biosystem, USA)进行实时PCR扩增[17］．所有pcr均重复进行。利用NCBI的引物设计工具设计基因特异性引物(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)并由埃及开罗的HVD生命科学公司合成。的基因组序列k .肺炎(GenBank登录号。EF125013.1)和大肠都有效(GenBank登录号。以NC_017960.1)为模板设计引物。用于PCR扩增的寡核苷酸引物见表1．细菌分离株被认为是阳性的AmpC的mRNA水平铜绿假单胞菌,k .肺炎而且大肠都有效与对照菌株相比，至少有15倍、12倍和10倍的过表达。

2.5.统计分析

使用GraphPad Prism软件(版本6.01)进行统计分析。采用单因素方差分析进行定量统计分析，以确定是否存在显著差异AmpC三种耐药菌株或样本来源(尿液、痰液和伤口)之间的表达水平。斯皮尔曼相关检验，一尾在 ,进行了相关性检验AmpC表达水平与抗微生物药物耐药性。一个<0.05为有统计学意义。

3.结果

3.1.抗微生物药敏谱

抗菌药敏研究表明，本研究所纳入的细菌分离株总体具有较高的耐药β-内酰胺类抗生素(包括氨苄西林、阿莫西林和哌拉西林，无论是单独使用还是联合使用β-内酰胺酶抑制剂)，以及头孢菌素。表中列出了分离株的抗微生物药物耐药性概况2．回收的细菌分离株对测试的抗菌药物表现出高水平的多药耐药，153株分离株中有93株(60.8%)对3类或3类以上的抗菌药物耐药，被描述为多药耐药。此外，153株分离菌中有23株(15%)仅对一或两类抗菌素敏感，被归类为广泛耐药(XDR)细菌分离菌。用于检测AmpCCC-DDS表型测试显示81%(43/53)的大肠都有效86%(44/51)的分离株k .肺炎分离株占48.9% (24/49)铜绿假单胞菌隔离是AmpC第表型。评价AmpCβ-内酰胺酶编码基因的表达，通过实时PCR检测AmpC转录结果显示，该基因表达在81%(43/53)的大肠都有效86%(44/51)和48.9% (24/49)铜绿假单胞菌隔离(图2和表3.)．

3.2.量化的AmpCβ-内酰胺酶编码基因表达

根据表达式折叠变化，AmpCβ-内酰胺酶基因在54株(48.65%)分离株中表达，其中13株(54.17%)铜绿假单胞菌分离株19例(43.18%)k .肺炎分离株22株(51.16%)大肠都有效隔离(表2而且4)．

表达式的折叠变化AmpCβ-内酰胺酶基因铜绿假单胞菌,k .肺炎或大肠都有效无论来自尿液、痰液还是伤口拭子，都没有显示出任何显著的表达水平差异， ,如图所示2和表3.．其差异在折叠变化的表达式中AmpCβ-内酰胺酶编码基因AmpC表达的和有AmpC未表达被认为有统计学意义，用三个星号表示值0.0001(图3.和表3.)．然而，人们发现，表达的水平AmpCβ-内酰胺酶基因在三个不同种间差异不显著 ．

4.讨论

抗菌药物耐药(ABR)是指细菌对抗菌药物不敏感，从而给传染病的治疗带来困难，从而导致高死亡率。AmpCβ-内酰胺酶，由AmpC基因，是第一个坚定的破坏者β-内酰胺环β-内酰胺类抗生素，导致了ABR的显著挑战。因此，表型和基因型方面的AmpCABR相关基因值得研究[19,20.］．事实证明AmpCβ-内酰胺酶对多种抗菌剂具有潜在的抑制活性。事实上，据报道，对头孢霉素、头孢唑林、头孢西丁和大多数青霉素类药物的耐药在流行病学和遗传学上与青霉素的表达有关AmpC细菌物种中的基因铜绿假单胞菌,k .肺炎而且大肠都有效［21- - - - - -26］．越来越多的证据表明，对第三代头孢菌素的抗微生物药物耐药性在社区医院日益爆发，在某些情况下，特别是肠杆菌感染可导致死亡[27］．然而，有限的研究调查了原因。因此，在当前的研究中，我们旨在评估的影响AmpC从埃及开罗某三级医院收集的三种卫生保健相关病原体临床分离株，即两种革兰氏阴性菌(铜绿假单胞菌而且k .肺炎)和一个革兰氏阳性(大肠都有效)分别在世卫组织全球抗微生物细菌优先名单中属于临界或高优先分类的细菌[4]，并根据菌株和感染源;三种不同的感染源被用来回收细菌分离株。这些来源是细菌性尿路感染、呼吸道感染和伤口感染。在全球范围内，细菌性尿路感染的患病率为11% [28]，呼吸道感染为5-15%，继发于流感病毒感染[29］．

至于与感染源相关的未得到调查的菌株在全球的流行情况，一项涵盖54个国家的3193名确诊为社区获得性肺炎(CAP)的患者的研究报告称铜绿假单胞菌分别负责4.2%和2.0%的铜绿假单胞菌——而且是耐抗生素的铜绿假单胞菌帽的感染。临界速率铜绿假单胞菌气管造口术、支气管扩张和/或非常严重的慢性阻塞性肺疾病患者中，67%的患者引起呼吸道感染[30.］．在尿路感染/伤口感染中，铜绿假单胞菌为尿路感染的第三个致病因素，占12%，伤口感染占29.6% [31］．为k .肺炎，肺炎/尿路感染病例的15-40% /32.6%分别由其普遍导致[30.］．据报道，大肠都有效在通常由肠球菌引起的感染中，如尿路感染、呼吸道感染和伤口感染，15%是由大肠杆菌引起的[32- - - - - -34］．

在目前的研究中，表达AmpCβ-内酰胺酶基因的表达模式AmpCβ采用RT-qPCR方法对153株耐药和非耐药菌株的-内酰胺酶基因进行了分析铜绿假单胞菌,k .肺炎而且大肠都有效(表4)．结果显示，两组间无显著性差异AmpC无论其革兰±表型、感染类型或临床标本，在被测细菌物种中均存在过表达。

这证实了以前在[11在GenBank中，AmpC基因包含在COG 1680中，其中COG代表一组同源组。COG 1680包括其他青霉素结合蛋白和C类蛋白β-内酰胺酶，包括来自古生菌和细菌的蛋白质，革兰氏阳性和革兰氏阴性生物。

我们的研究表明AmpC共检出54株(48.65%)铜绿假单胞菌,k .肺炎而且大肠都有效无明显差异AmpC有关感染类型或标本、尿液来源的表达水平(AmpC其中表达50.45%n= 56)、痰(AmpC表达式为25.23%n= 28)，或伤口拭子(AmpC表达为24.32%n= 27)。这些发现与另一项来自埃及的研究结果一致AmpCβ-内酰胺酶检测结果表明，34.8%(22/46)分离出的k .肺炎表现出过度的表达AmpC基因(35,36］．我们发现，在本研究中检测的分离株中60%为耐多药，这与在埃及进行的另一项研究的思路一致，并发现87.5%的临床分离株为耐多药[37］．事实上，分离记录为AmpC头孢西丁圆盘试验呈阳性显示对多种抗菌药物类耐药，包括头孢菌素类、环丙沙星、阿米卡星、左氧氟沙星、头孢哌酮-舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、美罗培南和亚胺培南[38］．此外，在AmpC用Spearman相关法比较上述抗生素的耐药表达水平， ．这意味着可能有其他基因可以发挥重要作用与AmpC抗生素耐药性的基因。

对于ABR byk .肺炎试图找出其ABR与药物滥用之间的时间和季节相关性β内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂(BLBLIs)，因此另一组进行了统计分析，将韩国健康保险三级保健医院每年开具的抗生素与发现的ABR病例相关联。他们发现用BLBLIs取代碳青霉烯类并不是理想的解决方案，因为ABR很可能在与哌拉西林/他唑巴坦联合用药时迅速扩散[39］．还有人指出β-arrestin招募基因是重要的诱导剂β-内酰胺酶信号通路，增加ABRk .肺炎抗克林霉素、红霉素、利奈唑胺和青霉素[40］．

为铜绿假单胞菌，我们的发现与另一项研究的结果一致AmpC艾滋病患者铜绿假单胞菌从烧伤患者中分离得到的菌株对头孢菌素类和碳青霉烯类耐药[41］．潜在的分子因素AmpC积极的铜绿假单胞菌在基因blaAmpC它编码了宽频C类β-内酰胺酶和ampr激活突变(G154R)，导致广谱AmpCS对替卡西林和哌拉西林、单巴坦类(阿曲南)和第三代(头孢他啶)和第四代(头孢吡肟)头孢菌素类药物的耐药[42,43］．在中国东北的一项扩展筛查研究报告了耐多药的高患病率铜绿假单胞菌对替卡西林/克拉维酸、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林、亚胺培南、美罗培南、头孢他啶、头孢吡肟、环丙沙星和左氧氟沙星耐药的菌株与入院后发生的感染显著相关[44］．此外，一项回顾性研究调查了抗微生物药物耐药性的发展铜绿假单胞菌表明亚胺培南或环丙沙星治疗是产生耐药菌株的关键因素铜绿假单胞菌［45］．同样，我们发现大肠都有效来β-lactams与拥有blazb - blai - blar1操纵子相关[46］．

许多基因被推测与微生物复杂的抗生素耐药特性有关，但现有数据有限。繁殖的基因澄清AmpC增加对β-内酰胺是证实的腹泻大肠杆菌(12月)的研究。基于转录组分析AmpCβ-内酰胺酶从DEC中分离得到，据报道突变发生在AmpCβ-内酰胺酶基因导致其转录增加[47］．此外，还表明β- n -乙酰氨基葡糖苷酶和PG循环酶在促进其生长中起着至关重要的作用AmpC通过与调控基因ampR相互作用表达AmpC此外，质粒携带AmpC基因作为一种来源AmpC超表达(43,48］．据报道，在药物敏感菌株的情况下，除了少数菌株的mRNA表达水平与对照菌株相当外，大多数发现mRNA表达水平下调，这表明它们是非致病性的。然而，敏感品系的下调可能是遗传获得或发育过程的结果。的本构表达式AmpC发生在较低的水平大肠杆菌［49,50];然而，各种突变可能导致本构性过表达β-内酰胺酶产生基因[51- - - - - -53］．

揭示了重大危机的程度AmpC对ABR的影响，我们研究了筛选菌株的耐药模式，并将其与表型过表达AmpC．我们的结果表明，研究中包括的不同细菌种类的分离株，无论其感染源如何，对氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林-克拉维酸酯、氨苄西林-舒巴坦、哌拉西林、哌拉西林-他唑巴坦和头孢克洛均具有100%耐药性。总的来说，该菌株的多药耐药率为60.8%，扩展耐药率为15%。一致地，这些发现归功于正表型相关的CC-DDS试验的结果AmpC81%(43/53)用于大肠都有效分离株，86% (44/51)k .肺炎分离株占48.9% (24/ 49)铜绿假单胞菌隔离。从这些发现可以明显看出，100%的受测菌株对大量抗菌素表现出ABR反应。此外，我们观察到只有48.65%的菌株表现出表达AmpC吉恩，暗示着AmpC并不是导致ABR的唯一因素，现象性ABR是一个涉及多遗传因素的复杂过程。

为了有效地解决ABR的困境，建议对ABR的生物学原因有一个全面的认识β-内酰胺，基于我们对ABR潜在因素的理解，为表现出ABR的微生物设计新的疗法，并阐明广泛存在的抗生素滥用。已知的ABR的原因可以总结如下:(i)表现出对细菌细胞壁活性剂的耐药性，如β-内酰胺类(如氨苄西林和青霉素)，对细胞壁的肽聚糖合成有抑制作用，如大肠都有效．这种抗性特性可能是由突变的过表达pbp5 (Met485⟶Ala)和LDTfm呈现的，导致了低亲和力的结合β-内酰胺到细菌细胞壁，从而使肽聚糖合成[54,55］．(二)药物失活β-内酰胺环直接易被裂解β-由blaZ基因编码的使抗生素失活的内酰胺酶[56］．(iii)细胞信号转导/突变抗性:在大肠都有效都是引起ABR的关键因素突变的cror [57,58]、IreP和IreK会引起对头孢菌素类药物的耐药性[39］．在这方面，有人指出β-arrestin是高手k .肺炎产生抵抗β-lactams [59］．为铜绿假单胞菌， oprD孔蛋白缺乏导致对碳青霉烯类产生耐药性。此外，抗铜绿假单胞菌来β-lactams是由于固有突变基因(mexR, nalB, nalC，或nalD)/nfxB分别作为过表达MexAB-OprM/ MexCD-OprJ的关键因素[39,53,60,61］．基于当前研究中的抗微生物药敏谱，我们强烈假设k .肺炎,铜绿假单胞菌,而且大肠都有效分离株具有ABR的多致病因素。因此，这些分离株对所测试的抗微生物药物表现出类似的耐药模式。

值得一提的是，“上述耐药相关基因是如何在序列或表达上导致ABR的?”的问题没有得到充分的回答，其潜在的机制也没有被清楚地理解。提出的答案是基于敲除分析来揭示细菌对抗生素敏感的遗传功能的表型[62- - - - - -64］．此外，抗生素滥用的全球健康问题是ABR的一个重要驱动原因，因为抗生素滥用通过对抗生素的自然选择赋能，通过可传播耐药性(R)质粒的转移介导，进化出超可变细菌[65]通过不同微生物的细菌细胞壁作为基因编码的载体β-内酰胺酶[63］．

此外，值得指出的是，基于细菌发病机制的抗菌疫苗和针对引起继发性细菌感染的病毒的抗病毒疫苗是一种福音，可以减少处方抗生素的使用[66,67］．作为ABR潜在的解决方法，(i)用噬菌体疗法取代抗生素[68]， (ii)与抗生素相比，噬菌体治疗对细菌具有显著的特异性，并且可控制对广泛的细菌谱进行生物设计，(iii) CRISPR-Cas9是一种有前途的生物技术工具，可消除导致其ABR的致病性细菌基因，特别是对儿童和老年人[69,70]，以及(iv)进一步研究以全面了解背后的分子生物学AmpC过度表达是开发耐药感染新药的必要条件。

我们的工作是对细菌感染治疗领域的补充，旨在反对抗生素滥用的普遍习惯[65]，以避免耐药微生物的出现。我们建议进行进一步的研究，以发现新的治疗方案，而不是单一的抗生素治疗不同的细菌感染。

数据可用性

支持这项研究的数据可根据要求获得。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

致谢

作者要感谢埃及赫利奥波里斯大学药学院Mohamed Tarek先生、Esraa Effat女士、Esraa Abdelaziz女士和Mohammed Soliman先生的可持续发展，感谢他们通过制备和收集分离物来帮助开展这项工作。

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