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埃舍图·加迪萨,海达尔·乌斯曼, "精油及其合用对皮肤溃疡多药耐药菌的抑菌活性评价”,国际微生物学杂志, 卷。2021, 文章的ID6680668, 8 页面, 2021. https://doi.org/10.1155/2021/6680668
精油及其合用对皮肤溃疡多药耐药菌的抑菌活性评价
摘要
背景.多药耐药细菌的出现会影响用于治疗皮肤感染的抗生素的有效性。这些细菌给21个国家带来了公共健康问题,并对医疗保健提出了质疑圣世纪。在这种情况下,药用植物来源的精油是结构和功能差异化合物的最高来源,抑制了常见伤口定植MRSA的生长和ESBL的产生铜绿假单胞菌。本研究的目的是评价提取的香精油的复合抑菌活性阿比西霉素,扁黄瓜,而且Discopodium penninervium对抗皮肤溃疡耐多药(MDR)分离株。方法.植物精油(EOs)是从植物的地上部分提取的阿比西霉素,脓毒杆菌,d . penninervium用蒸汽蒸馏。每种油(1:1)的混合物被吸附到一个圆盘上,并放置在Mueller Hinton琼脂上。37℃孵育18 ~ 24小时,测定EOs的最小抑菌区和杀菌浓度。以分数抑菌浓度指标测定其联合抑菌效果。结果.混合精油的抑菌活性因其剂量和细菌种类的不同而不同r . abyssinicus而且d . penninervium有抑制区(32 mm);其MIC和MBC值在1-2之间μl/ml抗MRSA。其抑菌范围为36 mm, MIC值为4μl/ml, MBC (8μl/ml)对抗ESBL的产生铜绿假单胞菌的综合效果r . abyssinicus而且c . pustulatusMIC值在2-8之间μl /毫升大肠杆菌而且k .肺炎和2μl/ml为MRSA。两者之间有很强的协同效应r . abyssinicus而且d . penninervium对MRSA和铜绿假单胞菌。结论.与平行测试的现代药物相比,EOs联合作用的体外研究对伤口定植细菌具有显著的抗菌活性,并减少了伤口愈合延迟。因此,进一步阐明活性化合物的结构有助于我们正确地设计或合成用于伤口护理的外用抗生素。
1.背景
现代人类普遍使用药用植物来治疗许多疾病。1,2].基于蛋白质组学、代谢组学和基因组学的强大分析工具的发展有助于从药用植物中发现新的化合物。植物源化合物具有不同的化学结构和功能相关的前体分子,以发现抗生素[2,3.].此外,对植物精油的广泛的民族植物学和民族药理学研究有助于发现各种化合物,其中钩端精子酮、三环素、黄酮、月桂烯、卡瓦克醇、对伞花烃、丁香酚、γ萜品烯,糖类,β-selinene和calamenene是抑制病原菌生长和生物膜形成的重要化合物,被用作免疫调节化合物[4,5].例如,卡伐克罗引起质子动力崩溃和ATP池耗竭,从而导致细胞死亡[6].因此,精油可作为制药工业中开发抗生素的前体[7,8].
目前,人们越来越重视探索潜在的治疗性生物活性,以治疗由多药耐药细菌引起的严重疾病,如慢性伤口[3.,4,8,9].世卫组织报告说,有820多万人因伤口感染或未感染而感染。这导致急性和慢性伤口的治疗损失281 - 968亿美元。在这方面,美国每年因非愈合性溃疡而损失250亿美元的保健开支[10].同样,在欧洲进行的一项研究表明,有150万至500万人因伤口而痛苦。除非发明了新的治疗方法,否则会造成严重的经济影响,在未来5年每年花费150 - 220亿美元。它已成为重大的公共卫生问题,对感染者造成心理和社会后果[9,10].MRSA、VRE和ESBL的出现铜绿假单胞菌被确定为常见伤口定植的多药耐药细菌已经恶化了医疗-外科护理和其他卫生服务[9- - - - - -11].在这种情况下,来自药用植物的精油是开发伤口护理用外用软膏的合适人选[8,12].
精油中含有许多有助于伤口愈合的化合物。在这方面,精油具有免疫调节潜力,可典型地激活体液和细胞介导的免疫反应。其他化合物如卡瓦克罗酯通过抑制产MRSA和产ESBL肠杆菌科的蛋白质和核酸合成而具有杀菌性能[5,12,13].有的抑制生物膜的形成和增殖,抑制炎症性水肿的形成,抑制伤口周围白细胞的趋化作用。因此,精油提高了伤口护理的质量,降低了发病率和死亡率,克服了慢性伤口感染的不愈合轨迹和低治疗反应[8,12,13].
许多研究表明精油的联合作用对伤口定植病原菌多药耐药菌有很强的抗菌活性[3.,12,13].的EOs樟属verum与哌拉西林合剂对-内酰胺酶TEM-1具有协同活性E。杆菌.这种组合破坏了细菌细胞的外膜或QS抑制作用[14].有趣的是,清热百度混合物可以抑制细菌生物膜的形成金黄色葡萄球菌而且铜绿假单胞菌。它减少了人工智能-2HIF的水平和上调表达-1α,HIF-2α,和HIF-3α,增加了VEGF的水平,从而促进了慢性和难治性伤口的血管生成和伤口愈合[15].另一项研究表明EOs的Pilgerodendron uviferum而且白千层属灌木alternifolia能抑制泵的射流机理吗金黄色葡萄球菌诺拉.这些精油可以抑制外排泵,并表征出一种潜在安全且负担得起的成分,用于开发对伤口定植多药耐药细菌的皮肤友好型软膏[16- - - - - -20.].
目前,使用常规抗生素和精油或精油本身的组合作为伤口护理药膏是克服多药耐药细菌的有前途的策略。产生MRSA和ESBL大肠杆菌曾对阿莫西林、四环素、哌拉西林、氧氟沙星和苯唑西林耐药[21- - - - - -23].许多研究表明Leptospermum scoparium和Tri-EDTA;薄荷和小薄荷而且;肉桂皮油和肉桂醛对MSSA有协同抑菌作用,大肠杆菌,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,ESBL和铜绿假单胞菌[24,25].从这些角度出发,我们的目的是评价提取的EOs的联合抗菌活性阿比西尼亚icus, pustulatus,而且d . penninervium防止伤口上分离的细菌精油具有免疫调节化合物,可作为基线数据,以制定和设计新的化合物,并找出不同社会使用的未开发药用植物的综合效应的科学原理。
2.材料与方法
2.1.研究区域及设计
2.1.1.研究区域
本研究在Bale区Seweyna woreda进行。这个woreda距离北东方向的罗布镇(zone town) 437公里,距离首都亚的斯亚贝巴750公里。海拔从海拔400-1850米延伸,位于座标纬度7°19 ' 60.00″N和经度41°19 ' 60.00″e。主要河流包括Mekenisa, Dare, Manduba和Kurkura。根据全国土地调查,Seweyna被丰富的牧场(46.3%)、耕地或可耕地(24.4%)和森林或茂密的植被(24.1%)覆盖。这个地区是最偏远的地区,没有基础设施(交通、医院和电力供应)。有一个保健中心,居民依靠TMP的传统知识治疗诸如皮肤病、糖尿病、性传播感染癌症、高血压和阳痿等疾病。
2.1.2.研究设计与周期
体外实验研究了复合精油的抑菌效果,阿比西尼亚icus, pustulatus,而且d . penninervium2020年1月至4月在KMU核心实验室对耐多药及其参考菌株进行了检测。
2.2.药用植物选择标准
如今,牧民社区被剥夺了现代医疗保健,依靠传统药用植物治疗人类和动物的许多疾病,如皮肤病、糖尿病、肝炎和癌症。这些药用植物是根据治疗师的传统知识选择的,用于治疗细菌感染,如湿疹、淋病、梅毒、肺炎、疥疮和其他常见的皮肤感染阿比西尼亚icus, pustulatus,而且d . penninervium。
2.3.植物采集和提取
植物样本阿比西尼亚icus, pustulatus,而且d . penninervium采集自Seweyna woreda的Mekenisa河和Kurkura河的侧面。每株植物都被安乐死并存放在国家植物标本室Rumex abyssinicus凭证编号(E-55/07)Cucumis pustulatus(E-45/07),Discopodium penninervium(E-18/07)在美国农业大学自然与计算科学学院生物系任教。收集每株植物生长良好的空中部分,并使用AMIO-37/04模型进行蒸汽蒸馏,提取其精油3-5小时,保存在Eshetu所述的4℃棕色小瓶中[3.].
2.4.培养基与多药细菌
2.4.1.文化传媒
用营养琼脂、TSY肉汤、麦康基、MHA、MHB、BA、甘露醇盐琼脂、巧克力琼脂和其他试剂培养从伤口收集的细菌。
2.4.2.测试生物
的参考菌种大肠杆菌(ATCC25922),k .肺炎(ATCC700603),粪大肠(atc29212)及金黄色葡萄球菌(写明ATCC 25923),铜绿假单胞菌(ATCC 27853)和它们的多药耐药菌株是从亚的斯亚贝巴梅内利克医院门诊病人的伤口中分离出来的。环丙沙星(5μG),庆大霉素(10μG),头孢噻嗪(30μG),头孢噻肟(5μG),头孢他啶(10μG),头孢西丁(30μG),头孢曲松(30μG),阿米卡星(30μG),头孢呋辛(5μG),头孢曲松(30μG),氯唑西林(5μG)和augmentin (30μg)为CLSI指南中描述的抗生素[26].
2.5.多药耐药细菌筛选
从伤口中分离出耐多药细菌。所有细菌首先在37°C的5% BA板上培养18-24小时,然后接种到MHA上。用无菌接种环将各细菌形态相似的少量菌落(3-5)转移到液体培养基中,直到McFarland浓度为0.5时浊度足够增长。然后,使用无菌拭子将细菌悬浮液划到MHA平板上,以确保平板完全覆盖,并在孵育后形成均匀厚的生长草坪。用含有多种抗菌药物的MHA检测临床分离株的药敏。将隔夜稀释的肉汤培养基接种到含有抗生素的平板上,产生大约10的最终接种量6CFU / spot for金黄色葡萄球菌,粪肠杆菌,肺炎克雷伯菌,大肠杆菌,而且铜绿假单胞菌根据CLSI指南推荐的圆盘扩散方法[3.,26].
2.5.1.革兰氏阴性菌的筛选
选择耐多药革兰氏阴性菌如ESBL产生大肠杆菌而且铜绿假单胞菌通过Jarlier所述的双盘协同试验(DDST)进行检测[27].Mueller Hinton琼脂用无菌棉签接种标准化接种物。安灭菌(20μG阿莫西林和10μg克拉维酸,AMC)片置于平板中央,头孢菌素(头孢他啶30μG,头孢曲松30μG,头孢噻肟30μG)和氮曲南30μG盘在孵育前放置于距离阿莫西林-克拉维酸盘20mm处(中心到中心)。在35°C下孵育一夜。四种药物盘中任何一种对阿莫西林-克拉维酸的抑制区增强表明广谱β -内酰胺酶的存在。k .肺炎根据CLSI指南采用圆盘扩散法筛选其对两种以上不同种类抗生素的耐药性[3.,26,28].
2.5.2.耐药革兰氏阳性菌的筛选
本研究以头孢西丁作为甲氧西林耐药介导的mecA/mecC的标记物金黄色葡萄球菌万古霉素(VRE)是CLSI指南推荐的椎间盘扩散方法的首选药物。另一方面,用Eshetu描述的MHB肉汤微量稀释法测定浓度值(MIC和MBC)和分数抑制浓度指数[3.,26,29,30.].
2.6.统计分析
统计数据为使用SPSS 21版本分析的抑制区和浓度值(MIC和MBC)的读数。每个实验值用平均值±标准差表示统计学意义采用学生t检验。
意义由学生决定t以及。值和 被认为是重要的。
3.结果
3.1.现代抗生素的抗菌作用
大多数从伤口分离出的细菌对两种或两种以上的抗生素具有耐药性。在这方面,甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)和ESBL产生铜绿假单胞菌是主要的伤口定植细菌。来自革兰氏阳性菌的MRSA和VRE对阿米卡星、头孢西丁、阿莫西辛、氨苄西林和头孢噻肟均耐药1).另一方面,革兰氏阴性菌ESBL产生大肠杆菌而且铜绿假单胞菌从手术伤口中分离出来这些革兰氏阴性菌在伤口护理中一直被破坏,而这些细菌菌株对经典的现代第三代头孢菌素类和青霉素类的耐药是不可预测的(表1).在这种情况下,这些细菌的基因或基因产物转移到细菌内或细菌间物种损害了治疗方案,并恶化了医疗保健的未来。
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甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌;Ar = ESBL生产铜绿假单胞菌;Ec = ESBL生产大肠杆菌;N =未完成;Ef =万古霉素耐药粪大肠;K =耐多药k .肺炎;I =中级(17-20 mm IZ);R =电阻(≤16 mm IZ);根据CLSI指南,S =敏感(≥21 mm IZ) [25]. |
3.2.精油的抗菌作用
本研究表明,试验挥发油具有广泛的杀菌活性。它们抑制了粪大肠杆菌,大肠杆菌,铜绿假单胞菌,肺炎克雷伯菌,而且金黄色葡萄球菌IZ范围为12-26毫米(见表2)2).因此,油显示了对伤口定植的MRSA和产生ESBL革兰氏阴性菌的抗菌效果。它们的有效性因细菌种类的浓度和类型而异。例如,r . abyssinicus抑制MRSA (23 mm)的生长和ESBL的产生大肠杆菌(22毫米)和铜绿假单胞菌(20毫米)在其20μl /盘,而d . penninervium抑制MRSA (21 mm)的生长和ESBL的产生大肠杆菌(18毫米)和铜绿假单胞菌(22毫米)在其20μl /盘。这些挥发油对直径为9 ~ 26 mm、MIC和MBC值为2 ~ 32的对照菌株和MDR菌均有抑制作用μl /毫升。的EOs阿比西尼亚icus, pustulatus,而且d . penninerviumMRSA的IZ直径分别为23 mm、19 mm和21 mm。万古霉素耐药粪大肠与其他物种相比,对测试的EOs高度敏感。
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平均值±SD, C =环丙沙星;NI =无抑制区;NT =未检测;ATCC =敏感>21 mm IZ,抗性<16 mm IZ,其中与头孢西汀治疗的MRSA相比,而而且与现代药物治疗相比粪大肠而且当与k .肺炎;与现代药物治疗相比铜绿假单胞菌,₫
与现代药物治疗相比大肠杆菌. |
香精油r . abyssinicus对一般的革兰氏阳性和革兰氏阴性菌以及VRE和K.肺炎特别是25毫米的IZ在20μl /盘。同样的,阿比西尼亚icus, pustulatus,而且d . penninervium在ESBL生产中,IZ分别为20 mm、19 mm和22 mm铜绿假单胞菌这是第二种常见的伤口细菌分离物。这些EOs的MIC和MBC值在4-32之间μl /毫升。总的来说,测试的EOs可以取代伤口定植和形成生物膜的细菌3.).
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平均值±SD, C =环丙沙星;NI =无抑制区;NT =未检测;ATCC =敏感>21 mm IZ,抗性<16 mm IZ,其中而且与头孢西丁治疗的MRSA相比,而而且与现代药物治疗相比粪大肠;
而且当与k .肺炎而且与现代药物治疗相比铜绿假单胞菌,而且₫
与现代药物治疗相比大肠杆菌. |
3.3.精油的复合抗菌作用
本研究发现,精油1:1比例的组合抗菌效果比单独使用精油更强,甚至相当于现代药物的选择。联合使用EOs可抑制MRSA的生长和ESBL的产生大肠杆菌而且铜绿假单胞菌参考菌株在20μl /阀瓣(表3.),其中的组合EO为r . abyssinicus而且d . penninervium(1:1)抗菌活性最强。对MRSA、VRE和ESBL产生的IZ直径分别为32 mm、34 mm和19 mm铜绿假单胞菌而且大肠杆菌在20μ分别l /盘。与其他混合物相比,该混合物具有最低的MIC和MBC值。VRE的MIC值为1.0μl/ml和MRSA (2.0μl /毫升)。MBC为1.0 ~ 8.0μl/ml用于生产ESBL铜绿假单胞菌(表4).与现代抗生素相比,该合用油显示出强大的杀菌效果,对测试的参考菌和耐药菌种。
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ATCC =各种参考菌株;耐多药菌株;MBC =最小杀菌浓度;MIC =最低抑制浓度;NT =未检测;C= 5μG环丙沙星+生长已见。 |
的组合c . pustulatus而且r . abyssinicus精油对MSSA和MRSA均有29 mm的抑制作用。显示出有效的抗菌作用k .肺炎而且大肠杆菌。它的MIC值在2.0-8.0之间μ检测的革兰氏阴性菌为l/ml, 2.0μl/ml抗MRSA。MBC评分为4.0μl /毫升k .肺炎MRSA和16μl/ml对抗ESBL生产铜绿假单胞菌.同理,得到EOs的综合效应r . abyssinicus而且d . penninervium有29毫米和22毫米的IZ直径20μl /盘与k .肺炎而且大肠杆菌,分别(表3.).对MSSA和MRSA的IZ直径均为32 mm.有趣的是,三种EOs在1:1的组合作用下对MRSA、VRE和ESBL的产生有34 mm、37 mm和26 mm铜绿假单胞菌,分别。该组合的MIC和MBC在0.25-4.0之间μL /ml为被测细菌。总的来说,每种EO的组合对MRSA有更强的抗菌作用肺炎克雷伯菌,绿脓杆菌,而且大肠杆菌与目前可获得和负担得起的抗生素相比(表1).
分数抑菌浓度指数(FIC指数)表明,复合挥发油的抑菌效果较好r . abyssinicus而且d . penninervium1: 1的比例对MRSA、VRE和肺炎。它对ESBL的生产也有适应作用大肠杆菌而且铜绿假单胞菌。另一方面,混合r . abyssinicus而且c . pustulatus对VRE和添加剂对MRSA和k .肺炎.相反,它对ESBL的产生有拮抗作用大肠杆菌而且铜绿假单胞菌.精油的混合物c . pustulatus而且d . penninervium对MRSA和肺炎。MRSA和MRSA的FIC指数分别为075和0.625k .肺炎分别。总的来说,MRSA对复合精油最敏感。与此相反,铜绿假单胞菌与其他细菌相比,对合成油的耐药细菌(表5).
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数值表示平均分数抑制浓度指数(n= 6),其中
X=协同作用,
X=部分协同,
X=无差异交互作用,和
X=精油的拮抗作用。 |
4.讨论
本研究揭示了MRSA、VRE和ESBL的产生大肠杆菌而且铜绿假单胞菌是从伤口样本中分离出的人类病原MDR细菌。在低收入和中等收入国家使用的所有或大部分抗生素中,这些菌株都受到了损害1).同样,许多研究表明,全球范围内耐多药细菌的增加令人担忧[3.,21- - - - - -23].它们的抗性基因或基因产物在非常动态和不可预测的现象中通过转化、转导和接合转移到种内和种间[16,27].另一方面,几乎所有发展中国家的医院都没有药物敏感性设施来诊断患者和进行临床管理。这样,带有多药耐药细菌的感染伤口的治疗选择有限,死亡率、发病率和治疗费用不断上升[13,15].这些都是导致他们在社区层面感染和传播的方式。因此,它们给社会带来了潜在的巨大健康和社会经济负担,并对未来提供的外科医疗和其他保健服务感到担忧[必威249010].在这种情况下,传统治疗师利用他们的独特知识,如药用植物,来治疗许多疾病,包括慢性伤口溃疡[8- - - - - -10].由于牧民社区被剥夺了现代医疗护理,并依赖于药用植物,因此他们善于创造知识,以应对普遍的耐多药微生物,特别是创伤定居物种[3.].这些社区从药用植物中提取精油,用作农村牧民社区伤口护理的局部药膏[12,19].
这些研究结果表明,几乎所有被测试的精油对定植并引发伤口感染的多药耐药致病菌都有良好的抗菌活性,其中MRSA对被测试精油的组合和/或单独使用更敏感。同样,大多数测试的精油在20岁时也会抑制VREμl /盘。这些发现证实了早期的研究,即从精油中提取的治疗剂可以破坏细菌的细胞壁,然后杀死它们。许多化合物,如钩端精子酮、三环素、黄酮、月桂烯、卡瓦克罗酯、对伞花烃和丁香酚,都能激活体液和细胞免疫[14,15].其中一些化合物可减少促炎细胞因子和TNF,从而改善伤口愈合[5,8,23,29].另一项研究显示精油中的卡瓦克罗酯具有杀菌作用[6].它能抑制革兰氏阳性菌,特别是MRSA和VRE的蛋白质和核酸合成[7,11].因此,精油是治疗慢性皮肤溃疡的候选药物[9,10,12].
精油对革兰氏阴性菌的其他方面有抑制ESBL产生的作用铜绿假单胞菌和大肠杆菌而且k .肺炎将感染的伤口分离出来挥发油杀菌活性显著,对参考菌和耐药菌有明显的抑制作用。这种精油在伤口上的应用可以促进愈合。另一方面,油的剂量、种类和细菌种类决定了油的有效性。这些发现与精油可以减少生物膜的形成和增殖,抑制伤口周围炎症性水肿的形成和白细胞趋化作用一致[16,17,19].获得性对常规药物耐药有几个决定因素。与此同时,铜绿假单胞菌而且大肠杆菌对许多现有和负担得起的抗生素产生了耐药基因[20.,25].这些与自发突变有关,这些突变干扰药物靶点结合,破坏药物前活化或导致靶点过表达[24,31].其他研究表明,有内在基因、获得性抗生素耐药(表达新性状),并引起遗传变化。基因变化可以通过改变药物的靶位点、酶灭活药物和阻止药物到达靶位点来产生耐药性。这些因素影响了所有或第三代头孢菌素类和青霉素类[15].总的来说,这些因素促成了耐药阿莫西林、四环素、哌拉西林、氧氟沙星和苯唑西林[16,18,20.].
本研究表明,精油的联合作用比单独使用具有更有效和高效的抗菌作用,甚至与现代药物的选择相当。这些协同组合为开发新的精油化合物奠定了基础。这也是增强了化合物的杀菌效果。在这种情况下,精油是开发伤口护理用局部药膏的合适人选[9].另一项研究表明,EOs导致生物化学通路的顺序抑制,抑制蛋白质合成,并破坏外细胞膜[18,28].总的来说,精油含有化合物,用于生产负担得起和安全的抗生素,并有可能激活免疫系统,使伤口快速愈合。EOs具有治疗性化合物,在伤口护理方面发挥有益的药理潜力,以克服多药耐药细菌的问题。
5.结论
本研究表明精油的联合作用具有广泛的杀菌活性,其中精油对常见创面MRSA定植和ESBL产生具有较强的抗菌作用铜绿假单胞菌。此外,多数配伍精油具有协同和加性作用,为配伍精油或单独配伍精油寻找新化合物提供了信息。因此,从精油中识别和结构阐明具有免疫调节和杀菌作用的化合物有助于制药公司和研究人员开发毒性较低、安全且负担得起的药物或调节剂或前体,用于合成新的抗菌药物和/或治疗伤口的软膏。
缩写
空中交通管制: | 美国类型培养集用作各自细菌的参考菌株 |
芭: | 血琼脂 |
CLSI: | 临床检验标准协会 |
DDST: | 双盘协同试验 |
EOs: | 通过蒸汽蒸馏从各药用植物中提取的精油 |
ESBL: | Extended-spectrum beta-lactamase |
膜集成电路: | 分数抑制浓度指数 |
MBC: | 最低杀菌浓度 |
耐多药: | 耐药 |
尼古拉斯: | 穆勒辛顿琼脂 |
MHB: | 米勒辛顿肉汤 |
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌: | 甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌 |
MBC: | 最小杀菌浓度 |
麦克风: | 最小抑菌浓度 |
VRE: | 万古霉素耐药粪大肠. |
数据可用性
本著作的所有资料和资料均可向通讯作者索取。
利益冲突
作者声明他们没有利益冲突。
作者的贡献
EG和HU设计、提取并进行实验室工作,参与植物样品采集和数据分析。所有作者阅读并批准了最终稿件。
致谢
作者要感谢KMU对这个研究项目的财政支持。他们对KMU MLT部门的管理人员和工作人员提供的帮助和实验室设施表示感谢。他们也要感谢真正的分类学家Melaku Wondafrash博士在美国农业大学国家植物标本室识别植物样本。最后,特别感谢Ato Tufa Seboke, W/ro Simegne Terefe, Ato Shafi Mohammed, Ato Kasim Kedir, Mequanint Mitiku, Ato Sultan Mohammed, W/ro Kemeru Waliy, S/r Nigatua Desta,和Ato Deme Birhanu,感谢他们在植物收集和研究项目中对我们的鼓励。这项研究得到了埃塞俄比亚亚的斯亚贝巴的Kotebe都市大学的资助。
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