螺旋藻水提物对高血压大鼠动脉血管扩张功能的有益作用

摘要

高血压是一种多因素疾病，被认为是世界范围内过早死亡的主要原因之一。这种病理与血管功能/结构改变有关，其中一氧化氮(NO)和氧反应性物种参与。另一方面，微藻提取物在心血管疾病治疗中的应用正在增加。基于螺旋藻的抗氧化和降压特性，本研究旨在研究螺旋藻水提取物对自发性高血压大鼠(SHR)主动脉血管舒张功能的影响，分析NO的功能作用。为此，将男性SHR主动脉段分为两组，一组为对照组，另一组暴露于螺旋藻水提取物(0.1% w/v, 3小时)，以分析(i) NO、超氧阴离子和过氧化氢的产生;(ii)乙酰胆碱(ACh)、NO供体和硝普钠(SNP)以及K_{三磷酸腺苷}开槽器和pinacid;(iii) p-Akt、p-eNOS和HO-1蛋白的表达。结果表明，螺旋藻水提物(i)增加了NO的生成，对超氧化物的生成没有显著的修饰，而降低了过氧化氢的生成;(ii)增加ACh、NPS和pinacid诱导的血管舒张反应;(iii)增加p-Akt和HO-1的表达。这些结果表明，螺旋藻水浸提液通过增加NO的释放/生物利用度/功能来改善SHR动脉的血管功能。增加K_{三磷酸腺苷}pAkt和HO-1的通道激活和表达似乎参与了这些作用。

1.简介

心血管疾病是全世界最常见的死亡原因，高血压是其发展的主要危险因素之一。这种病理与血管重塑有关[1]这可能是由于内皮因子的产生和功能不平衡而引起的[2从而导致血管阻力增加。在内皮因子中，一氧化氮(NO)通过其血管扩张剂、抗增殖和抗聚集作用在血管张力调节中起着至关重要的作用[3.］．众所周知，一氧化氮诱导的血管舒张是通过增加血管平滑肌中的环单磷酸鸟苷(cGMP)水平和cGMP依赖蛋白激酶(PKG)激活介导的[4］．同样，NO、cGMP和PKG也能激活钾通道，使细胞膜超极化[5，6］．因此，钾通道在维管组织中广泛表达，其在血管张力调节中的作用已得到很好的证实[7］．超极化机制的参与通过激活钙和atp依赖性钾(K_Ca或者K_{三磷酸腺苷}，分别为)通道[8，9］．在这方面，NO生物利用度的降低通常与活性氧(ROS)的产生增加有关，后者是包括高血压在内的心血管疾病的另一个标志[10］．然而，在氧化应激增加的病理生理条件下，不同的稳态机制可以被激活。因此，核因子红系2相关因子2 (Nrf2)介导II期抗氧化蛋白的转录，负责消除ROS [11］．在Nrf2的不同靶蛋白中，值得注意的是，血氧合酶-1 (HO-1)已被认为是保护血管组织免受促氧化环境影响的最重要因素之一[12，13］．

除了经典的降压药物治疗[14，15]，如今天然化合物的消耗量日益增加[16- - - - - -19］．近年来，微藻的应用受到越来越多的关注，因为它们含有各种有价值的天然化合物，可用于制药、化妆品和营养工业[20.，21］．在微藻中，该属的丝状蓝藻Arthrospira(例如,答:platensis，答:最大值)，俗称螺旋藻，是一种“超级食物”，具有抗氧化、降压、控制胆固醇及抵抗胰岛素的功效[22，23］．基于这些信息，本研究的目的是分析螺旋藻水提取物对自发性高血压大鼠(SHR)主动脉血管舒张功能的影响，并探讨NO的贡献。还研究了与NO产生和/或生物利用度相关的细胞介质(超氧阴离子和过氧化氢)和信号蛋白(eNOS、Akt和HO-1)的磷酸化和/或表达。

2.材料与方法

2.1.动物与血管组织制备，“，

雄性SHR大鼠，5个月大，在马德里大学Autónoma (UAM)动物设施(注册号EX-021U)通过杂交Wistar-Kyoto大鼠选择构成性高血压。所有动物实验方案均由UAM研究伦理委员会根据西班牙农业部(Pesca y Alimentación)指令609/86 CEE和R.D. 233/88 (PROEX 202/16)批准。实验是根据欧盟指令63/2010 UE和西班牙法规RD53/2013批准的已出版的《动物护理和使用指导原则》进行的。在牺牲前，通过尾袖法间接测量清醒动物的收缩压(Letica, Digital pressure Meter, LE5000, Barcelona, Spain)。CO处死大鼠₂吸入和随后的斩首;将主动脉仔细解剖，置于含115 mM NaCl, 2.5 mM CaCl的4℃Krebs-Henseleit溶液(KHS)中₂， 4.6 mM KCl, 1.2 mM KH₂阿宝₄， 1.2 mM MgSO₄， 25毫米NaHCO_3.， 11.1 mM葡萄糖。从SHR取主动脉，清除附着脂肪和结缔组织，切成4毫米长的圆环，根据螺旋藻有无分为两组:在螺旋藻水溶液萃取物(0.1% w/v)中暴露3小时的动脉和螺旋藻溶解的KHS培养基中培养的动脉(对照组)，除了NO释放实验，螺旋藻萃取物溶解在含有119 mM NaCl, 20 mM HEPES, 1.2 mM call的4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)缓冲液中₂， 4.6 mM KCl, 0.4 mM KH₂阿宝₄， 1 mM MgSO₄， 5毫米NaHCO_3.， 5.5 mM葡萄糖，0.15 mM钠₂H₂阿宝₄．

2.2.螺旋藻水提取物

要获得螺旋藻生物质能,Arthrospira platensis使用Biodesma s.l.提供的BIO1菌株。答:platensis在马德里大学Politécnica (40.446353 N-3.738341 E)的温室内的塑料生物反应器中生长，如前所述[24，25］．简单地说,答:platensis当培养物达到约1g /L干重时收获。在蛋白质含量较高的9:00 - 10:30进行收获[26］．然后，将细胞在50°C的水平薄片上干燥约4-6小时，并在4°C的不透明容器中保存，以防止氧化。

采用Bligh & Dyer法，采用溶剂萃取法制备极性螺旋藻提取物[27]在螺旋藻生物量声波化的前一步之后。简单地说，将50 mg螺旋藻生物量悬浮在1 mL氯霉素/甲醇1:2 (v/v)中，在25°C下进行40 kHz声波处理15分钟。液相过滤，用0.5 mL氯霉素/甲醇1:2 (v/v)萃取回收的生物质。接下来，极性螺旋藻生物组分通过在氯气/甲醇相中加入两次0.6 mL含0.58% NaCl的水来分离。相在4°C重力分离24小时后，水相在Buchi B480旋转蒸发器中干燥，称重，并在-70°C冷冻直到使用。

2.3.血管反应性

用于等距张力记录的方法已在其他地方详细描述[28］．简单地说，将主动脉段悬浮在含有5ml KHS的器官浴中，在37°C下，连续以95% O起泡₂-5%的公司₂混合物(pH值7.4)。通过血管段的管腔引入了两个平行的不锈钢销:一个固定在浴槽壁上，另一个连接到力传感器(Grass FTO3C;Grass Instruments Co.， Quincy, MA, USA);这又与7D型格拉斯测谎仪相连。在给药前90分钟平衡期内，主动脉段张力为1g，每15分钟重新调整一次。在此之后，将血管暴露于75 mM KCl中以检查功能完整性。洗脱期后，用10的能力测定血管内皮活力μM ACh放松预收缩节段0.1μM NA。然后用KHS冲洗血管以恢复基础张力。为了研究螺旋藻水溶液提取物对血管扩张剂反应的影响，将SHR分离的主动脉段与螺旋藻提取物(0.1% w/v)孵卵3小时(每小时变化一次)，然后进行0.1 nM-10的累积浓度-反应曲线μmach，到NO供体0.1 nM-10μM硝普钠(SNP)和K_{三磷酸腺苷}开信道器0.1μ打光最后一μM pin酸化0.1μM NA预收缩环。

2.4.一氧化氮的释放

使用荧光探针4,5-二氨基荧光素(DAF-2，在0.5μM)如先前报告[29，30.］．在室温下，用LS50 (perkins - elmer Instruments)发光光谱仪测量介质的荧光，激发波长设置为495 nm，发射波长设置为515 nm。同样，从没有肠系膜段的介质中收集空白测量值，以减去背景发射。

2.5.超氧阴离子的检测

氢乙胺，一种氧化荧光探针，用于评估超氧阴离子水平原位，如上文所述[29，31，32］．组织也用核染料染色 ，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI, 10μg / mL)。切片被安装在欢喜载玻片上并在共聚焦显微镜上成像。用LEICA (TCS ST2 DM IRE2)激光扫描共聚焦显微镜检测核(激发405nm，发射410- 475nm，用于DAPI染料)和氧化氢乙胺(激发488 nm，发射610 nm)。激光和图像设置不变，以获取三组大鼠的图像。显微照片显示了氢乙胺的强度和位置，这反映了超氧化物的产生，因此可以对这些基团进行比较。为了分析荧光强度，使用ImageJ分析软件(美国国立卫生研究院)。超氧化物的形成量表示为氢乙胺发出的荧光与DAPI发出的荧光之间的比率。

2.6.过氧化氢的生产

用荧光H测定主动脉环中过氧化氢的形成₂O₂化验试剂盒(Cayman Chemical)，如先前报导[32］．在过氧化氢酶、H₂O₂清道夫，保证了方法的特异性。分别在530和590 nm激发和发射波长处的荧光记录在96-微板阅读器中(Multiskan Ascent, Labsystems)。使用BCA™蛋白测定试剂盒(Pierce)采用双辛酸法定量主动脉样本中的蛋白质含量。数据以每微克蛋白质的纳摩尔表示。

2.7.Western Blot检测p-Akt, p-eNOS和HO-1的表达

在含有磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂鸡尾酒的RIPA缓冲液中，对动脉段进行匀浆和处理，在4°C下定量蛋白质浓度。蛋白质(20μg)通过SDS-PAGE凝胶分离，转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Bio-Rad免疫- blot®，在4°C, 230 mA过夜，使用Bio-Rad Mini Protean III系统(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)。按照抗体制造商的说明，用5% (w/v)脱脂奶粉或5% (w/v)牛血清白蛋白阻断膜，用小鼠phospho-eNOS单克隆抗体(1:250稀释)(购自Transduction Laboratories (Lexington, UK)，抗phospho- akt (S473)，或兔HO-1多克隆抗体(1:20 0稀释)(购自streggen Bioreagents (Victoria, Canada))孵育过夜。清洗后，将膜与相应的结合辣根过氧化物酶的抗免疫球蛋白G (Amersham International Plc)孵育。彻底清洗膜，使用增强型山根过氧化物酶/鲁米诺化学发光系统(ECL Plus, Amersham International Plc, Little Chalfont, UK)检测免疫复合物，并进行放射自显影(Hyperfilm ECL, Amersham International Plc)。使用计算机程序(NIH Image V1.56)对免疫印迹上的信号进行量化。同样的膜用于测定GAPDH的表达，后者的含量用于校正每个样品中p-AKt, p-eNOS和HO-1的表达，通过抗GAPDH单克隆抗体(1:5000稀释，Sigma)。

2.8.数据分析

结果如下所示 (平均标准误差)。ACh、SNP或pinacid诱导的松弛表达为NA引起的初始收缩的百分比。采用双因素方差分析(ANOVA)，比较螺旋藻提取物孵育后SHR大鼠主动脉曲线与无螺旋藻提取物孵育时的曲线进行统计学分析。对NO、超氧阴离子和过氧化氢的产生及蛋白表达进行了Student’s统计分析 -未配对实验的检验。一个小于0.05被认为是显著的。使用统计程序GraphPad PRISM®(Version 6.01)对图表进行统计分析和阐述。

2.9.药物及化学品

所用药物如下:DAF-2、HE、L-NA盐酸盐、ACh氯化物、氯化钾、SNP和pinacid (Sigma-Aldrich)。除NA溶于NaCl(0.9%)-抗坏血酸(0.01% w/v)溶液外，其余药物原液(10 mM)用蒸馏水配制。这些溶液保存在-20°C，并在实验当天在KHS中进行适当稀释。

3.结果

3.1.动物体重与收缩压

体重( ）和收缩压( ）与以往研究报告的结果相似[33- - - - - -35］．

3.2.血管反应性

在na预收缩的动脉段，ACh (0.1 nM-10μM)在螺旋藻提取物孵育后升高(图1)．详细分析显示，螺旋藻诱导的乙酰胆碱舒张作用在内皮含量低于30%的血管中比内皮含量高于60%的血管中更明显(图)1(一),1(b))。

为了分析螺旋藻对平滑肌细胞对NO敏感性的可能作用，我们研究了NO供体SNP诱导的血管扩张剂反应。螺旋藻提取物孵育后，SNP (0.1 nM-10)引起血管扩张剂反应μM)增加(图2)．

由于K的参与_{三磷酸腺苷}在血管扩张剂反应中，螺旋藻提取物对K_{三磷酸腺苷}通道分析。K的浓度-响应曲线_{三磷酸腺苷}开槽器pinacidil (0.1μ打光最后一μM)在0.1中进行分析μM NA预收缩主动脉环 ．结果表明，螺旋藻提取物孵育后，pin酸化的血管扩张剂反应增强(图3.)．

3.3.没有释放

在与4,5-二氨基荧光素孵育后，与对照条件相比，暴露于螺旋藻水提取物的动脉发出的荧光更高4)．

3.4.超氧阴离子的检测

在SHR的动脉中，螺旋藻提取物的孵育没有显著改变超氧阴离子的产生(图5)．螺旋藻提取物没有修饰DAPI发出的荧光。

3.5.过氧化氢的检测

在SHR的主动脉中，螺旋藻提取物的孵育降低了过氧化氢的水平(图6)．

3.6.p-eNOS, p-Akt和HO-1的表达

western blot检测螺旋藻提取物对SHR主动脉匀浆中p-Akt、p-eNOS和HO-1表达的影响。结果显示螺旋藻孵育后p-Akt和HO-1表达增加，p-eNOS表达无统计学变化(图7)．

4.讨论

总的来说，目前的工作表明，螺旋藻水提取物孵育改善高血压大鼠动脉血管扩张剂反应。此外，NO释放/生物利用度的增加和钾通道活性的增加似乎是螺旋藻诱导效应的机制。

高血压通过改变血管扩张剂因子的释放/功能而影响血管扩张剂功能，其中NO和ROS是相关的参与者。在前人观察的基础上，研究了螺旋藻水提物对不同内皮功能含量的SHR大鼠动脉ach致血管舒张的影响。结果表明，在内皮细胞功能大于60%的主动脉中，螺旋藻提取物引起的ach反应增加幅度小于内皮细胞功能小于30%的动脉。这些结果表明螺旋藻水提物可能通过内皮依赖和内皮不依赖机制起作用。关于内皮依赖性机制，一个合理的机制是增加NO释放。我们的研究结果表明，与之前的研究一样，SHR增加了动脉中NO的释放[36，37］．此外，由于在高血压中已报道可收缩前列腺素的产生增加[38]，因此螺旋藻的作用更大，也可能是由于去除内皮后，收缩因子减少。然而，不能排除除NO以外的其他介质参与螺旋藻诱导的效应，这需要进一步的研究。

一旦确定了NO的释放量，接下来分析螺旋藻提取物可能对平滑肌对NO的敏感性产生的改变。结果表明，水溶液提取物增加了snp诱导的反应，这似乎与描述螺旋藻处理后不同激动剂诱导的反应中NO参与增加的研究一致[36，37］．此外，值得注意的是，螺旋藻提取物孵育后SNP诱导松弛的最大增量是在低浓度SNP下观察到的，这可能被认为与生理相关。虽然没有关于螺旋藻提取物对no供体诱导的血管舒张作用的具体信息，但本文所述的结果表明螺旋藻也可能通过内皮不依赖机制起作用。

考虑到NO可以通过激活钾通道使细胞膜超极化，从而改变K的活性_{三磷酸腺苷}经络与高血压的发展有关[39，40]，血管扩张剂对K_{三磷酸腺苷}研究了开通道剂pinacid。结果表明，螺旋藻提取物与pinacidil诱导的松弛作用增强，说明螺旋藻提取物可提高K的活性_{三磷酸腺苷}频道。到目前为止，螺旋藻水溶性成分对钾通道的激活还没有报道，但这可能是一个合理的假设，就像多不饱和脂肪酸等亲脂性成分能够激活钾通道一样[32，41，42］．在低浓度的pinacid下再次观察到最大的影响，这一事实指出了螺旋藻提取物暴露的生理相关性，因为观察到水提取物对三种测试的血管扩张剂反应的影响相同。

有趣的是，据报道，开放K_{三磷酸腺苷}通道增加p-Akt的表达[43］．由于p-AKt参与eNOS的激活，因此还分析了两种蛋白的表达情况;结果表明，螺旋藻提取物可促进p-Akt的表达，从而促进NO的产生。然而，螺旋藻提取物未能显著增加p-eNOS的表达，这表明eNOS活性增加和/或NO代谢降低，这与螺旋藻提取物孵育血管后观察到的NO释放增加相匹配。由于螺旋藻具有抗氧化特性，因此不能排除其NO生物利用度的增加。在这方面，重要的是要注意，在对促氧化环境的反应中，就像在高血压中发生的那样，HO-1是最早表达的蛋白质之一，其参与心血管保护已被描述[12，13］．螺旋藻提取物增加HO-1的表达，这一事实与蓝藻的抗氧化特性是一致的，正如在胶质细胞中所描述的那样[44］．此外，一些研究报道了不同天然产物诱导HO-1表达的增加是通过p-AKt介导的[45- - - - - -48］．因此，下一步是分析螺旋藻提取物对超氧阴离子形成的影响。结果表明，与预期相反，螺旋藻提取物孵育后，超氧阴离子的产生没有统计学差异。这一结果显然与大多数描述螺旋藻抗氧化作用的研究不一致[49- - - - - -51］．一种可能的解释是，螺旋藻需要更高的浓度和/或孵育时间来减少超氧化物的过量产生，这可以通过调节NADPH氧化酶和/或SOD活性来实现。有趣的是，蓝藻菌株的选择也很重要，因为生物活性化合物合成的差异，即使是较小的量，也可能对促进健康的特性产生影响[52］．另一种可能是SOD已经作为一种代偿机制被激活，试图消除在不同生理病理条件下(如高血压)报告的超氧化物产生升高[53]、动脉粥样硬化[54]，及/或老化[55]并且螺旋藻提取物不能诱导进一步活化。因此，对过氧化氢的含量进行了分析，表明与螺旋藻提取物孵育降低了这种特定ROS的产生。这一结果与大多数描述螺旋藻一般抗氧化特性的研究一致[36，37］．螺旋藻分离提取物的性质与作用于特定生物组织的性质之间的差异仍然存在重要的问题，这也取决于组织必威2490的特定病理生理条件。总的来说，这些考虑确保了未来的研究将特别关注螺旋藻提取物膳食补充剂，因为这些实验可以报告与维持健康血管功能直接相关的不同生化、细胞和生理参数的任何潜在改善。

5.结论

综上所述，目前的研究描述了螺旋藻提取物诱导的一些可能机制，特别关注NO的功能作用。螺旋藻水溶液提取物的孵育可通过增加NO释放/生物利用度和功能来改善高血压大鼠主动脉的血管扩张剂反应，这与p-Akt和HO-1表达的增加有关。还有K的活化_{三磷酸腺苷}频道参与了这一效应。

数据可用性

用于支持这项研究结果的数据包含在文章中。

利益冲突

作者宣称他们没有利益冲突。作者单独负责论文的内容和写作。

致谢

本研究得到了Comunidad de Madrid (S2013/ABI-2783，“灵感”)的资助Α1-CM”)和Fondo Europeo de Desarrollo区域到JLG, CO和MF;西班牙Economía工业竞争部长(CTQ2017-86170-R)致CO;以及由卫生调查基金会(PI19/01282)捐赠给MF。作者感谢David Muñoz和医学学院动物设施的技术人员对动物的照顾，MªTeresa Alameda和Mireya Ruiz对western blot实验的技术援助。

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