超高效液相色谱-串联四极杆质谱法研究10-羟基美乌头碱在大鼠血浆中的药动学

摘要

乌头碱是主要的有效成分乌头carmichaeliiDebx。化合物10-羟基美乌头碱是一种已知的美乌头碱代谢物，是有毒的。为了更好地了解其药代动力学，本文采用UPLC-MS/MS测定了大鼠口服(5 mg/kg)和静脉注射(0.1 mg/kg) 10-羟基美乌头碱后血浆中10-羟基美乌头碱的浓度。标准曲线测定大鼠血浆中10-羟基美乌头碱浓度范围为0.3 ~ 60 ng/mL。10-羟基美乌头碱样品在大鼠血浆中的日内和日间精密度均低于15%。准确度在96.0% ~ 109.3%之间，基质效应在88.9% ~ 98.1%之间，加样回收率均高于79.1%。的AUC_(0−t）10-羟基美乌头碱的生物利用度为17.6%，静脉给药和口服给药分别为23.6±5.9和207.6±72.9 ng/mL·h。最后,t_1／2静脉注射为1.3±0.6 h，口服为3.1±0.4 h。

1.简介

乌头是一种开花植物，因对治疗风湿关节痛有显著疗效而被广泛应用于临床[1- - - - - -3.］．乌头含有生物碱，如美乌头碱和乌头碱，具有抗炎镇痛活性，但同时具有强毒性和狭窄的治疗窗口[4- - - - - -7］．在乌头，中乌头碱含量高于乌头碱[4，5］．乌头中毒没有特定的临床症状，因为中毒会在体内迅速分解，难以察觉[6，7］．采用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)检测大鼠血液中的美乌头碱代谢物[5]，例如，10-羟基美乌头碱、次乌头碱、脱水美乌头碱16- o -去甲基美乌头碱、16- o -去甲基次乌头碱和16- o -去甲基脱水次乌头碱。采用LC-MS/MS分析大鼠尿液中乌头碱的代谢物[8]，如次乌头碱葡醛酸缀合物、10-羟基乌头碱、1- o-去甲基乌头碱、脱氧乌头碱、次乌头碱。代谢物10-羟基美乌头碱是有毒的，可以在大鼠血液和尿液中检测到;因此，本研究选择其进行量化。

LC-MS/MS广泛应用于药物的检测和分析[9- - - - - -11]，药物杂质[12，13]，降解产物[14，15]，以及代谢物[16，17]因为它具有灵敏度高、检出限低、抗干扰能力强、定性定量测量准确等优点。具体而言，可以采用超高效液相色谱法(UPLC)和可靠的内标来减少基质效应对定量结果的影响。此外，UPLC可以快速高效地对各组分进行定性和定量分析，提高检测灵敏度和准确度，减少测量时间。

关于美乌头碱的药代动力学分析已有多项研究报道在活的有机体内使用高效液相色谱法[18]， lc-ms / ms [19]，以及UPLC-MS/MS [20.］．然而，10-羟基美乌头碱的药代动力学分析在活的有机体内尚未报道。本研究采用UPLC-MS/MS对大鼠口服和静脉给药后血浆中的代谢物10-羟基美乌头碱进行分析。本研究对阐明乌头碱类生物碱的药理作用具有重要意义。

2.材料与方法

2.1.化学

10-羟基美乌头碱(纯度>98%)和地西泮(纯度>98%，内标)购自成都曼斯特生物科技有限公司(中国成都)。hplc级甲酸、甲醇和乙腈购自Tedia公司(美国俄亥俄州)。超纯水使用Millipore milliq水净化系统(Bedford, MA, USA)制备。

2.2.仪器及条件

本研究使用ACQUITY h级UPLC与XEVO tqs -微型三重四极杆质谱仪进行色谱分析(Waters Corporation, Milford, MA, USA)。A UPLC BEH C18 (2.1 mm × 50 mm, 1.7μm)色谱柱进行色谱分离，流动相为甲醇和水(含0.1%甲酸)，流速为0.5 mL/min。0 ~ 0.2 min，甲醇在10%时为等分态;从0.2 min到1.4 min，甲醇从10%增加到80%;1.4 min ~ 2.0 min时，甲醇在80%为等分态;从2.0 min到2.1 min，甲醇从80%下降到10%;从2.1 min到3.0 min，甲醇在10%时呈等分态。

毛细管电压为2.4 kV，脱溶温度为400℃，离子源温度为150℃。采用氮气脱溶(800 L/h)和雾化气体。采用正离子模式ESI多反应监测(MRM)对10-羟基美乌头碱的分子离子跃迁进行监测，m/z 648⟶105为内标(IS)， m/z 285⟶193为内标(图1）.

2.3.库存和工作方案的准备

在甲醇中制备10-羟基美乌头碱(0.6 mg/mL)和地西泮(0.2 mg/mL)的原液。用甲醇稀释10-羟基美乌头碱原液，制备不同浓度(3、10、50、150、300和600 ng/mL)的工作原液。

2.4.标准曲线的准备

空白大鼠血浆中加入之前配制的10-羟基美乌头碱工作溶液，得到血浆中浓度分别为0.3、1、5、15、30和60 ng/mL的10-羟基美乌头碱标准溶液。质量控制样品(0.8、12和50 ng/mL)也以同样的方式制备。

2.5.等离子体的准备

在1.5 mL离心管中，乙腈(200μL，含50 ng/mL IS)加入血浆(50μL)。溶液涡旋1分钟，13000转/分离心10分钟。由此产生的上清液(150μL)转入LC-MS小瓶μ将该溶液中的L注入UPLC-MS/MS中进行分析。

2.6.药物动力学

SD (Sprague Dawley)大鼠，雄性，体重200 ~ 220 g，取自温州医科大学动物实验中心。6只大鼠口服5 mg/kg 10-羟基美乌头碱(po)， 6只大鼠静脉注射0.1 mg/kg 10-羟基美乌头碱(iv)。实验开始前12 h禁止进食，但可免费饮水。血(150μL)于10-羟基美乌头碱给药后0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24 h从尾静脉抽提，肝素钠抗凝。等离子体(50μL)在3000rpm离心15min后收集，-20°C保存。

3.结果

3.1.方法验证

通过分析6批空白大鼠血浆、添加10-羟基美乌头碱和IS的空白血浆和大鼠血浆样品，评价了该方法的选择性。数字2所示为10-羟基美乌头碱和IS加标空白血浆样品的UPLC-MS/MS色谱图。未发现内源性物质干预10-羟基美乌头碱的检测。

为了评估线性关系，通过分析加标校准样品(大鼠血浆中0.3-60 ng/mL)并绘制10-羟基美乌头碱与IS的峰面积比与其浓度的关系，获得校准曲线。用标准曲线测定大鼠血浆中10-羟基美乌头碱标准溶液的浓度范围为0.3-60 ng/mL。由标准曲线生成的方程为y= 0.0154x+ 0.0124 (r= 0.9985)，其中y10-羟基美乌头碱与is的峰面积比是多少x表示大鼠血浆中10-羟基美乌头碱浓度。10-羟基美乌头碱在大鼠血浆中的最低定量限为0.3 ng/mL。

通过连续3天6次重复测定LLOQ和QC样品(0.8、12和50 ng/mL)来评估准确性和精密度。测定大鼠血浆中10-羟基美乌头碱的日内和日间精密度均小于15%，准确度在96.0% ~ 109.3%之间。

为了评估基质效应，提取空白大鼠血浆，并与10-羟基美乌头碱加标，以获得最终浓度为0.8、12和50 ng/mL的生物碱。基质效应是通过将三个质量控制样品的相应峰面积与以1:1甲醇和水(0.1%甲酸)制备的标准溶液在等效浓度下的峰面积进行比较来确定的。通过比较提取QC样品与参考QC溶液的峰面积，评价了10-羟基美乌头碱的回收率。从分析结果看，基质效应范围在88.9% ~ 98.1%之间，加样回收率高于79.1%(表1)1）.

10-羟基美乌头碱在大鼠血浆中的稳定性是通过分析三种QC样品(0.8、12和50 ng/mL)在三种不同储存条件下(室温保存2 h)的峰值面积来评估的;三次冻融循环，随后在室温下保温12 h(处理后);-20°C 30天。这些结果与新制备的标准样品的结果进行了比较。三种不同条件下10-羟基美乌头碱在大鼠血浆中的稳定性变化均在±14%以内，RSD均在±14%以内2）.

3.2.药物动力学

10-羟基美乌头碱的血药浓度-时间曲线如图所示3.．采用DAS 2.0软件(中国药科大学)无室模型测定的主要药代动力学参数见表3.．

4.讨论

质谱方法通常评估ESI在正或负模式下的操作选择[21，22］．结果表明，ESI正离子模式比负离子模式更适合于10-羟基美乌头碱的质谱分析。我们优化了10-羟基美乌头碱的电离，发现m/z比为105的片段丰度最高。因此，m/z 648⟶105的转变为10-羟基美乌头碱(锥电压:35 V;破碎剂电压:26 V)进行定量分析。

流动相和固定相(柱)在色谱行为中起决定性作用[23- - - - - -25］．我们用BEH C18色谱柱比较了甲醇-水(w/0.1%甲酸)和乙腈-水(w/0.1%甲酸)。以甲醇-水(含0.1%甲酸)为流动相，可获得合适的保留时间和分析物峰形。与乙腈相比，甲醇作为有机相更适合在色谱柱上保留10-羟基美乌头碱，且具有更好的峰形和灵敏度。UPLC可以通过广泛的线速度、流速和背压实现分析物的高效分离，从而获得优异的结果。与HPLC相比，UPLC通过提供更小(1.7μM)颗粒对柱效率的提高。特别是柱效率所提供的1.7μM粒子的效率是含有5粒子的柱的3倍μ米粒子。以甲醇-水(w/0.1%甲酸)为流动相，10-羟基美乌头碱和IS的滞留时间分别为1.28和1.54 min。

消除潜在的干扰对样品制备尤为重要[26- - - - - -28］．研究了甲醇-乙腈(1:1,v/v)、乙腈和甲醇制备沉淀蛋白的方法。乙腈似乎是最佳的选择，因为它提供了更好的提取回收率和较低的背景干扰。乙酸乙酯和乙醚的萃取回收率约为60%，甲醇和甲醇-乙腈(1:1,v/v)的萃取回收率约为80%。必威2490而乙腈的回收率约为90%。必威2490

本实验建立了UPLC-MS/MS测定大鼠血浆中10-羟基美乌头碱浓度的方法。该方法灵敏、准确、特异、可靠。每个样品的分析时间为3.0 min，血浆样品的处理方法简单，所需样品体积仅为50个μL，每天可处理和检测300多个血浆样本。应用所建立的UPLC-MS/MS方法对10-羟基美乌头碱口服(5 mg/kg)和静脉注射(0.1 mg/kg)后在大鼠体内的药代动力学进行分析。的AUC_(0−t）静脉注射和口服分别为23.6±5.9和207.6±72.9 ng/mL·h，生物利用度为17.6%。t_1／2静脉注射为1.3±0.6 h，口服为3.1±0.4 h。

5.结论

乌头生物碱代谢迅速在活的有机体内，这使得它们很难被发现。本研究建立了一种快速、选择性的UPLC-MS/MS测定大鼠血浆中10-羟基美乌头碱含量的方法。本方法应用于10-羟基美乌头碱在大鼠体内的药代动力学分析。生物利用度为17.6%。

数据可用性

用于支持这项研究结果的数据包含在文章中。

利益冲突

作者声明，本文的发表不存在任何利益冲突。

作者的贡献

杨金照和曾国武对这项研究也有同样的贡献。

致谢

本研究由温州市科技局(Y2020858)资助。

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