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化学杂志/2021/文章
特殊的问题

新型生物活性小分子的发展

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体积 2021 |文章的ID 5542455 | https://doi.org/10.1155/2021/5542455

Almira Zhanzhaxina, Yerlan Suleimen, Ahmed M. Metwaly, Ibrahim H. Eissa, Eslam B. Elkaeed, Raigul Suleimen, Margarita Ishmuratova, Kydyrmolla Akatan, Walter Luyten 在体外而且在网上一种二萜的细胞毒活性和抗菌活性Cousinia alataSchrenk",化学杂志 卷。2021 文章的ID5542455 11 页面 2021 https://doi.org/10.1155/2021/5542455

在体外而且在网上一种二萜的细胞毒活性和抗菌活性Cousinia alataSchrenk

学术编辑器:特奥多里克·c·拉马略
收到了 2021年2月7日
修改后的 2021年3月18日
接受 2021年4月3日
发表 2021年4月19日

摘要

从植物中分离次生代谢产物的生物学指导方法Cousinia alata从生长在哈萨克斯坦Akmola地区的Schrenk野生植物中分离出具有生物活性的二萜grindelic acid(1)。还分离出6种黄酮类化合物,分别为retusine (2), pachipodol (3), jaranol (4), penduletin (5), casticin(6)和5,7,3 ' -三羟基- 3,4 ' -二甲氧基黄酮类化合物(7).Penduletin(5)显示中等的细胞毒活性。格林德尔酸表现出良好的细胞毒活性卤虫盐沼和抗菌活性金黄色葡萄球菌蜡样芽胞杆菌,而且肠炎沙门氏菌.组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂在grindelic酸结构中的基本药效特征促使我们对HDAC酶进行分子对接研究,以在分子水平上了解其作用机制。Grindelic酸具有与共晶配体相似的结合方式,对HDAC具有良好的结合亲和力,结合自由能为−18.70 kcal/mol。用MS、1D和2D NMR等方法确定了化合物的结构。化合物(1 ~ 7)为首次从该化合物中分离得到Cousinia属。

1.简介

癌症是一种发生在身体某个器官或组织中的疾病,原因是异常细胞不受控制地生长,侵入身体其他部位并扩散到其他组织[12].根据世界卫生组织的数据,2018年,癌症是全球第二大死因,占死亡人数的六分之一[3.].全球抗生素耐药性的增加导致医疗费用和死亡率的增加,特别是在一些严重的细菌感染,如肺炎、结核病、淋病和沙门氏菌病[4].天然产物可被认为是抗菌和抗癌化合物的主要来源[5].天然产物的活性要么源于植物[5- - - - - -7],海军陆战队[89]或真菌[10- - - - - -14]含有多种次级代谢物,这些代谢物属于不同的化学类别,如类黄酮[15- - - - - -17]、皂甙[618]、火石[19]、等色素[20.],以及生物碱[21].

Cousinia卡斯。是最大的属之一菊科科,约有600-700种,在中亚和西南亚种类最多[22- - - - - -24].必威2490大约56种分布在哈萨克斯坦各地,包括Cousinia alataSchrenk。,which is a perennial plant, up to 50–90 cm high; its stems are straight, freely branched, naked, and winged; wings are with spiny-dentate margin; leaves are thin and simple; corolla is yellow or pink color. During the flowering period from flower baskets, there is a significant release of rubber. This plant grows on the slopes of low hills, in sandy places, and in plains throughout Kazakhstan’s territory. General distribution: China, Mongolia, and Central Asia [25- - - - - -27].

生物活性指导分离导致从四种不同的细胞毒性化合物的鉴定Cousinia物种(Cousinia davisianaCousinia foliosaCousinia ramosissima,Cousinia stenocephala) [28].此外,甲醇提取物c . davisianaHub.-Mor。, C. fololia木香。, C. ramosissima直流。,而且c . stenocephala对A549、Beas-2b和Colo205细胞株显示出良好的细胞毒活性[29].此外,细胞毒作用c . verbascifolia报道了抗OVCAR-3和HT-29癌细胞的Bunge [30.].还有细胞毒性c . alata用盐水虾法测定施伦克挥发油[27].另一方面,抗菌性能不同Cousinia物种已被证明[3132].此外,一些报道讨论了抗氧化作用Cousinia物种(2933].从属中分离出多种次生代谢产物Cousinia包括多糖及其单糖[3435]和倍半萜内酯[3637],除了类黄酮、单宁、糖苷、萜类、酚类和皂苷外[2231].

组蛋白脱乙酰酶(HDAC)是一组负责组蛋白上n -乙酰赖氨酸氨基酸脱乙酰的酶;这一步(去乙酰化)在DNA表达过程中非常重要,因为它可以使组蛋白更有效地包裹DNA [38].HDAC抑制剂是任何通过抑制HDAC酶活性来增加组蛋白和非组蛋白上赖氨酸残基乙酰化的分子。因此,HDAC抑制剂可能是发现新的抗癌药物的绝佳选择[39].此外,已有报道称HDAC同源物以乙酰蛋白利用蛋白(AcuC)的形式存在于细菌中[40].此外,组蛋白去乙酰化酶抑制剂在感染小鼠中的使用结核分枝杆菌抑制细菌生长,加速免疫细胞募集,诱导促炎细胞因子表达,抑制IL-10表达[41].另一个被感染的老鼠模型大肠杆菌用丙戊酸(HDAC抑制剂)处理后,细菌负荷夸张和细胞因子表达明显下降[42].最近,Grabiec报道了几种HDAC抑制剂通过不同机制的抗菌作用[43].

本研究旨在分离和鉴定具有细胞毒性和抗菌作用的次生代谢产物Cousinia alataSchrenk提取物。此外,在此之前进行了分子对接研究,以便在分子水平上更好地了解活性化合物的作用机制。必威2490

2.实验部分

2.1.提取,分离和纯化

空中部分c . alataSchrenk (菊科)在开花期间采集于哈萨克斯坦共和国阿克莫拉地区阿斯特拉罕地区Zhaltyr村附近(阿拉木图-叶卡捷琳堡公路)。凭证样本一份(编号:2002.07.23.02.04)保存在E.A. Buketov Karaganda大学生物和地理学院的植物标本馆。

风干的花和叶子c . alata(500 g)用氯仿在65°C水浴中提取1小时。过滤后,滤液在40℃下减压蒸发。此过程重复三次,浓缩提取物用水-乙醇(1:2)溶液处理以去除压载物。经水-乙醇处理后,采用硅胶柱层析。使用硅胶进行柱层析(63-200µM, 735 g)和一种极性递增的石油醚/乙酸乙酯流动相,可获得120个馏分(每个250ml)。

所有馏分均置于薄层色谱板(硅胶60 F254).组分29-34(85:15%,石油醚:乙酸乙酯)相结合,进行薄层色谱(CHCl3.: MeOH, 98%: 2%),这表明它是两种化合物(217毫克)的混合物。然后,用硅胶60 F进行薄层色谱纯化2542毫米,20 20厘米,CH2Cl2-MeOH, 99%: 1%),得到31 mg化合物(2),经核磁共振光谱鉴定为5-羟基- 3,3 ',4 ',7-四甲氧基黄酮(retusine)。馏分39 ~ 43(75:25)含有化合物(3)和(4)的混合物,用硅胶柱分离,溶剂梯度为CHCl3.: MeOH(40: 1),经核磁共振鉴定分别为pachipodol和jaranol。将44 - 48,49 - 57和63-70馏分组合,然后用混合溶剂(石油醚:乙酸乙酯)再结晶/洗涤纯化。结果,这导致了分别鉴定出penduletin (5), casticin(6)和5,7,3 ' -三羟基- 3,4 ' -二甲氧基黄酮(7)。

关于研磨酸(1)的分离,200克的架空部分c . alata粉末状,用甲醇提取,然后在旋转蒸发器上减压蒸发。粗甲醇提取物经己烷和二氯甲烷液-液萃取进一步分馏。然后使用旋转蒸发器再次浓缩馏分,得到己烷(12,3 g),二氯甲烷(25,8 g)和甲醇提取物。从每种提取物中提取样品用于抗菌活性的初步筛选。因此,正己烷提取物具有抗菌活性,并进一步进行了生物测定指导下的抗菌化合物分离。将干燥后的活性提取物(己烷)装入硅胶柱(高60 cm,直径5.5 cm)上,按极性逐级递增洗脱,己烷:乙酸乙酯,乙酸乙酯:甲醇。所有馏分的等分干燥并溶解在DMSO中进行生物测定。39 ~ 48的组分表现出活性,因此将其组合(4 g),然后将提取物再次装入硅胶柱,用相同的溶剂进行洗脱,每步10管15 ml。有三组分数表现出活跃:50-57、59-62和64-80。每组馏分都进行反相高效液相色谱,并配有紫外检测器(岛津,日本)。The gradient solution system was started from 50% acetonitrile (0,1% TFA) and 50% deionized water (0,1% TFA) over 10 min and then up to 100% acetonitrile (0,1% TFA) in 30 min and maintained 20 min at 100%. Flow rate: 4 ml min−1;注射量:2 ml;SunFire prep. C18柱(5μM, 10 × 250 mm);探测器波长:214和254纳米。他们收集了60个每分钟4毫升的分数,然后进行了测试。各组组分在32min时均含有相同的活性峰(grindelic acid(1))。

2.2.化合物的鉴定

质子核磁共振(1H NMR)、碳-13核磁共振(13C NMR),1H -1在Bruker 500 SB UltraShield上测量了H相关谱(COSY)、异核多键相关谱(HMBC)和异核单量子相关谱(HSQC)ТМ加上核磁共振光谱仪,工作在400兆赫1H和100兆赫为13C.用OptiMelt Stanford Device测定分离化合物的熔点。

2.2.1.化合物1 (Grindelic Acid)

无色透明晶体(70.8毫克)。M.p 102-104°C。HRMS (FTMS + pESI) m/z计算的。对于C20.H32O3.(mh)-: 319.2351,找到319.2329。不饱和度-5。

1H NMR (400 MHz, CDCl3.):δ0.79 (H3, s, -CH3.-20年),δ0.84 (H3, s, -CH3.-18年),δ0.87 (H3, s,-CH3.-19年),δ1.35 (H4, s,-CH3.-16年,δ1.73 (H3, s, -CH3.-17年),δ2.66 [H1, d (J= 15.4 Hz), -H-14a],δ2.53 [H1, d (J= 15.4 Hz), -H-14b],δ5.58 (H1, s, H-7)。

13С-NMR (100 MHz, CDCl3.): 32.8(颈- 1),18.7 (c - 2), 41.9(颈),33.3 (c - 4), 42.9 (c - 5), 24.3(其他),129.0(即),133.0 (8),92.9 (C-9), 40.9 (C-10), 27.6 (C-11), 39.6(技术),81.2 (c13), 47.5(碳14),172.1 (C-15), 26.9 (C-16), 21.4 (c - 17), 33.0 (C-18), 22.1 (C-19), 16.8 (C-20)。

温馨:-H(14a)⟶-H(14b)。

HSQC: - cH3.(20)⟶-CH3.(20), - cH3.(18)⟶-CH3.(18) - cH3.(19)⟶-CH3.(19) - cH3.(17)⟶-CH3.(17), - cH3.(16)⟶-CH3.(16)、H (14 a (b)⟶С(14),H(5)⟶С(5),H(7)⟶C(7)。

HMBC: - cH3.(20)⟶С (10), c (1), c (8), cH3.(18)⟶С (3), c (19), c (4)), -cH3.(19)⟶С (4), c (3), -cH3.(17)⟶С (9), c (8), c (7)), -cH3.(16)⟶С(12),C (13), C (14) - h (a) 14日⟶С(16)C (13), C (15) - h (b) 14日⟶СC C (15) (16) (13), C(12)。

2.2.2.化合物2(5-羟基-3,3 ',4 ',7-四甲氧基黄酮,黄黄酮)

黄色针叶(31毫克)。一下。156 - 157°C。(点燃160 - 162°C)。HRMS (FTMS + pESI) m/z计算的。对于C19H18O7[M + H]+: 358.1130,发现:359.1131。不饱和度−11。

1H NMR (400 MHz, CDCl3.):δ6.37 [H1, d (J= 2.5 Hz), H-6],δ6.45 [H1, d (J= 2.5 Hz) H-8],δ6.98 (H1, s, H-5 '),δ7.75 (H2, m, H-2 ', 6 '),δ12.7 (H1, s, 5-OH),δ3.87 (H3, s, -OCH3.),δ3.88 (H3, s, -OCH3.),δ3.90 (H3, s, -OCH3.),δ3.91 (H3, s, -OCH3.).

13Сnmr (100 MHz, DMSO): 148.9 (c - 2), 139.1(颈),178.9 (c - 4), 162.2 (c - 5), 98.0(其他),165.1(即),92.4 (8),156.0 (C-9), 106.2 (C-10), 123.1(颈- 1(c-2)), 156.9), 151.5 (c-4), 111.4 (c-5 '), 122.3 (c-6 '), 56.0 (-och3.), 56.2 (-och3.), 56.2 (-och3.), 60.4 (-och3.).

2.2.3.化合物3(5,4 ' -二羟基-3,7,3 ' -三甲氧基黄酮,槲皮素,3,7,3 ' -三甲基醚,Pachipodol)

黄色粉末(20毫克)。一下。160 - 162°C。HRMS (FTMS + pESI) m/z计算的。对于C18H16O7(mh)-: 343.0823,发现:343.0825。不饱和度−11。

1H NMR (400 MHz, DMSO):δ6.34 [H1, d (J= 2.2 Hz), H-6],δ6.43 [H1, d (J= 2.2 Hz), H-8],δ7.68 [H1, d (J= 1.85 Hz), H-2 '],δ7.65 [H1, dd (J= 8.4, 2.1 Hz), H-6 '],δ7.03 [H1, d (J= 8.4 Hz), H-5 '],δ3.84 (H3, s, -OCH3.3),δ3.86 (H3, s, -OCH3.7),δ3.97 (3H, s, -OCH3.3 '),δ12.64 (1H, s, OH5),δ6.03 (1H, s, OH4”)。

13Сnmr (100 MHz, DMSO): 156.8 (c - 2), 138.9(颈),178.8 (c - 4), 162.1 (c - 5), 97.9(其他),165.5(即),92.3 (8),156.1 (C-9), 106.1 (C-10), 122.5(颈- 1), 110.9 (c-2), 146.4 (c-3), 148.4 (c-4), 114.5 (c-5 '), 122.8 (c-6 '), 60.2 (-och3.-3), 55.9 (-och3.-7), 56.2 (-och3.3 ')。

舒适:h-5 '⟶h-6 '。

HSQC: H(6)⟶С(6)、H(8)⟶С(8)、H(2)⟶С(2’),H(5 ')⟶C (5), H(6)⟶C(6’),ocH3.(3)⟶OCH3.(3)、ocH3.(7)⟶- oCH3.(7)、ocH3.(3)⟶- oCH3.(3)。

HMBC: ocH3.(7)⟶С (7), -ocH3.(3)⟶С (3), -ocH3.(3)⟶С(3’),- h(6)⟶С(5),C(7),С(10)- h(8)⟶С(7),C (9), C (6), C (10), C - h(2)⟶(6)、C(4)、C (2) - h(5 ')⟶С(1’),C (3) - h(6)⟶C(2 ')、C (4 '), - oH(5)⟶c (5), С (6), c(10)。

2.2.4.化合物4(5,4 ' -二羟基-3,7-二甲氧基黄酮,黄酮醇)

黄色粉末(70.8毫克)。一下。230 - 233°C。(lit. mpp . 235-236°C)。C17H14O6 . .不饱和度-11。1H NMR (400 MHz, DMSO):δ6.32 (H1, s, H-6),δ6.70 (H1, s, H-8),δ6.91 [H2, d (J= 9.16 Hz), H-3 ', 5),δ7.93 [H2, d (J= 9.16 Hz), H-2 ', 6 '],δ3.74 (H3, s, -OCH3.3),δ3.81 (H3, s, -OCH3.7),δ10.37 (H1, s, -OH4 '),δ12.62 (H1, s, -OH5)。

13Сnmr (100 MHz, DMSO): 156.5 (c - 2), 138.3(颈),178.6 (c - 4), 161.4 (c - 5), 98.3(其他),165.6(即),92.9 (8),156.8 (C-9), 105.7 (C-10), 121.0(颈- 1), 130.8 (c-2, 6 '), 116.2 (c-3, 5 '), 160.8 (c-4), 60.3 (-och3.-3), 56.6 (-och3.7)。

舒适:- h(6)⟶- h (8) - h(8)⟶- h (6) - h(2 ', 6 ')⟶- h (3 ', 5 '), - h(3 ', 5 ')⟶- h(2 ', 6 ')。

HSQC: H(6)⟶С(6)、H(8)⟶С(8)、H(2 ', 6 ')⟶С(2 ',6 '),H(3 ', 5 ')⟶С(3 ',5 '),ocH3.(3)⟶- oCH3.(3)、ocH3.(7)⟶- oCH3.(7)。

HMBC: ocH3.(3)⟶С (3), -ocH3.(7)⟶С(7)- H(6)⟶С(5)C (10) - H(8)⟶С(6)C (10) C C(7)、(9)- H(2)⟶С(6)(2)C (4) - H(6)⟶СC C (2) (2) (4) - H(3)⟶С(5 ')C(1)、C(4)、H(5 ')⟶С(3)C(1)、C (4) - oH(4 ')⟶c (3 ') С (5 ') c(4 ')。

2.2.5.化合物5(5,4 ' -二羟基-3,6,7-三甲氧基黄酮,Penduletin)

黄色粉末(216.8毫克)。一下。210 - 212°C。(lit. mpp . 216-218°C)。HRMS (FTMS + pESI) m/z计算的。对于C18H16O7[M + H]+: 345.0974,发现:345.0969。不饱和度−11。

1H NMR (400 MHz, DMSO):δ6.92 (H1, s, H-8),δ6.955 [H2, d (J= 8.8 Hz) H-3, 5),δ7.99 [H2, d (J= 8.8 Hz) H-26),δ3.73 (H3, s, -OCH3.),δ3.80 (H3, s, -OCH3.),δ3.92 (H3, s, -OCH3.).

13Сnmr (100 MHz, DMSO): 152.3 (c - 2), 159.1(颈),178.1 (c - 4), 156.40 (c - 5), 138.1(其他),132.1(即),91.9 (8),152.2 (C-9), 106.0 (C-10), 121.0(颈- 1), 130.7 (c-26), 116.1 (c-3, 5), 160.8 (c-4), 57.0 (-oCH3.-3), 60.2 (-oCH3.-6), 60.5 (-oCH3.7)。

舒适:- h(3 ', 5 ')⟶- h (2 ', 6 '), - h(2 ', 6 ')⟶- h(3 ', 5 ')。

HSQC: H(8)⟶С(8)、H(3 ', 5 ')⟶С(3 ',5 '),H(2 ', 6 ')⟶С(2 ',6 '),ocH3.(7)⟶CH3.(7)、ocH3.(6)⟶- oCH3.(6)、ocH3.(3)⟶-oCH3.(3)。

HMBC: ocH3.(7)⟶С (7), -ocH3.(6)⟶С (6), -ocH3.(3)⟶С(3),- h(8)⟶С(7)C(9)С(10)- h(3 ', 5 ')⟶С(1’),C - h(2 ', 6 ')⟶(4 '),- oH(4)⟶C(4 ')。

2.2.6.化合物6(5,3 ' -二羟基-3,6,7,4 ' -四甲氧基黄酮,槲皮黄素,3,6,7-三甲基醚,Casticin)。

黄色粉末(403.3毫克)。一下。186.4 -187°C。HRMS (FTMS + pESI) m/z计算的。对于C19H18O8[M + H]+: 375.1079,发现:375.1074。不饱和度-11。

1H NMR (400 MHz, DMSO):δ6.87 (H1, s, H-8),δ7.11 [H1, d (J= 9.16 Hz) H-5),δ7.59 (H2, m, H-2 ', 6),δ3.75 (H3, s, -OCH3.6),δ3.81 (H3, s, -OCH3.3),δ3.88 (H3, s, -OCH3.4 '),δ3.93 (H3, s, -OCH3.7),δ9.32 (H1, s, -OH3 '),δ12.59 (H1, s, -OH5)。

13Сnmr (100 MHz, DMSO): 152.2 (c - 2), 138.6(颈),178.8 (c - 4), 152.3 (c - 5), 132.3(其他),159.2(即),91.9 (8),156.2 (C-9), 106.2 (C-10), 122.8(颈- 1), 115.7 (c-2), 147.0 (c-3), 150.9), 112.5 (c-5 '), 120.9 (c-6 '), 60.5 (-och3.-6), 57.0 (-och3.-4 '), 60.2 (-och3.-3), 56.1 (-och3.7)。

舒适:H-5⟶6”。

HSQC: H(8)⟶С(8)、H(2)⟶С(2’),H(5 ')⟶С(5),H(6)⟶С(6’),ocH3.(7)⟶- oCH3.(7)、ocH3.(6)⟶- oCH3.(6)、ocH3.(3)⟶- oCH3.(3)、ocH3.(4)⟶- oCH3.(4)。

HMBC: ocH3.(6)⟶С (6), -ocH3.(7)⟶С (7), -ocH3.(3)⟶С (3), -ocH3.(4)⟶С(4 '),- h(8)⟶С(6)С(7)С(2)(10)- h(5 ')⟶С(1)C (3 ' - oH(5)⟶c (5) С c(6)。

2.2.7.化合物7(5,7,3 ' -三羟基-3,4 ' -二甲氧基黄酮)

黄色粉末(294.8毫克)。温度:228-230°C。(lit. mpp . 235-236°C)。HRMS (FTMS + pESI) m/z计算的。对于C17H14O7[m + h]+: 331.0817,找到:331.0812。不饱和度−11。

1H NMR (400 MHz, DMSO):δ6.21 [H1, d (J= 1.7 Hz), H-6],δ6.43 [H1, d (J= 2.3 Hz), H-8],δ7.11 [H1, d (J= 8.6 Hz) H-5),δ7.54 (H1, s, H-2),δ7.56 [H1, d (J= 8.6 Hz), H-6 '],δ3.86 (H3, s, -OCH3.4 '),δ3.79 (H3, s, -OCH3.3),δ12.67 (H1, s, -OH5),δ9.6 (H1, s, -OH),δ10.9 (H1, s, -OH).

13Сnmr (100 MHz, DMSO): 155.3 (c - 2), 138.0(颈),178.0 (c - 4), 161.3 (c - 5), 98.6(其他),164.2(即),93.7 (8),156.4 (C-9), 104.3 (C-10), 122.3(颈- 1), 115.0 (c-2), 146.4 (c-3), 150.2 (c-4), 111.9 (c-5 '), 120.4 (c-6 '), 59.8 (-och3.3), 55.6(哟3.4”)。

Cosy: -h(6)⟶-h (8), -h(8)⟶-h(6)。

HSQC: H(6)⟶С(6)、H(8)⟶С(8)、H(5 ')⟶С(5),H(2)⟶С(2 H),(6)⟶С(6’),ocH3.(3)⟶- oCH3.(3)、ocH3.(4)⟶- oCH3.(4)。

HMBC: ocH3.(3)⟶С (3), -ocH3.(4)⟶С(4 '),- h(6)⟶С(8)C (10) - h(8)⟶С(6)C (10) - h(5 ')⟶С(1)C (3) - h(2)⟶С(6)C (4) C C (2) (3) - h(6)⟶С(2’),- oH(5)⟶c (5) С c(6)。

2.3.细胞毒活性测定

在55 ml分离漏斗中加入人工海水和200 mg鸡蛋卤虫盐沼.然后,它被保存在柔软的空气中三天,直到甲壳类动物从无尾虾孵化出来。在漏斗的一侧盖上铝箔,5分钟后,在分离漏斗明亮一侧移动的幼虫被巴斯德移液器除去。

将20-40只无尾鼠分别放入24个含990的微量滴定板中μL的海水。死幼虫在显微镜下计数。10μ每10毫克ml含1升二甲亚砜溶液−1添加样品。以放线菌素D或staurosporine为标准比较试剂,DMSO为阴性对照。孵育24 h后,进一步保持微量滴度板24小时(以确保不动),在显微镜下计数死亡无尾鼠。

死亡率P由以下公式确定: 在哪里一个为24 h后无尾鼠死亡数量;N是试验前死亡的无尾鼠的数量;而且B是阴性对照无尾犬死亡的平均数量。

2.4.抗菌活性

采用微量肉汤稀释法对4株革兰氏阳性菌株进行抑菌试验金黄色葡萄球菌6532年,蜡样芽胞杆菌,革兰氏阴性肠炎沙门氏菌,以及酵母菌株白色念珠菌sc5314。在本试验中,标准抗生素(氨苄西林5 mg ml−1细菌和氟康唑白色念珠菌)和DMSO/水分别作为被测菌敏感性的阳性对照和阴性对照。

将单个菌落从琼脂平板中接种到3ml MH培养基(0.2%牛肉提取物、1.75%氨基酸和0.015%可溶性淀粉)和YPD培养基(1%酵母提取物、2%蛋白胨和2%葡萄糖)中,培养白念珠菌.试管在37°C的震动培养箱(200 rpm)中孵育一夜。

十个μ将L的样品转移到96孔板的孔中,并将阳性对照(氨苄西林,原液5 mg/mL)和空白(溶剂)对照(DMSO和水)。然后将微量稀释板的每孔接种190μL稀释标准接种物(在620 nm时OD = 0.003)。对照井为190口μL MH肉汤和10μL提取物,以纠正任何吸收由于提取成分。微量稀释板放置在摇床培养箱中,37°C, 24小时,然后在620 nm的微孔板阅读器上读取。在620 nm波长下测量OD值。试验样品的相对抑制率(%)由下式计算: 式中,A为样品的OD值;B为未接种样品对照的OD值;C为溶剂(DMSO)的平均OD值[44].

2.5.分子对接

目标HDAC (PDB ID: 2VQM;分辨率:1.80 Å)从蛋白质数据库(http://www.pdb.org).对接分析采用分子操作环境(Molecular Operating Environment, MOE) [45].在这些研究中,测定了被测分子对HDAC的自由能和结合模式。首先,水分子从HDAC的晶体结构中去除,只保留一个链和锌原子,这是结合所必需的。共晶配体(羟肟酸衍生物,HA3)被用作参考配体。然后,蛋白质结构被质子化,氢原子被隐藏起来。接下来,将能量最小化,并定义蛋白质的结合袋[46- - - - - -48].

使用ChemBioDraw Ultra 14.0绘制所检测化合物和共晶配体的结构,并以SDF格式保存。然后用MOE软件打开保存的文件,进行三维结构质子化。接下来,分子的能量被最小化。通过仅对共晶配体运行对接过程,对目标受体进行验证过程。停靠构象和晶体构象之间的RMSD值较低表明性能有效[4950].对接过程使用默认协议进行。在每种情况下,使用遗传算法搜索生成10个停靠结构[51- - - - - -53].

3.结果与讨论

3.1.分离与结构说明

化合物1采用生物引导色谱法分离得到c . alata天线部分。此外,对氯仿提取物进行了不同的色谱技术,得到6种黄酮类化合物(2-7)。通过1D和2D NMR对化合物进行结构鉴定,并与文献数据进行比较。所有化合物均为首次从该属植物中分离得到Cousinia属。分离出的化合物(图1)经鉴定为grindelic acid (1) [54], retusine (2) [55], pachipodol (3) [56], jaranol (4) [57], penduletin (5) [58], casticin (6) [59], 5,7,3 ' -三羟基-3,4 ' -二甲氧基黄酮(7)[60].

3.2.细胞毒性的活动

分离化合物的细胞毒活性用盐水虾(卤虫盐沼)致命性试验。结果表明,在分离得到的化合物中,有研磨酸1)和penduletin(5)在所有测试浓度(10.0、5.0和1.0 mg ml)下都能抑制甲壳类动物−1),而格林德酸(1)的活性最高。retusine(2)和5,7,3 ' -三羟基- 3,4 ' -二甲氧基黄酮类化合物(7)均表现出平均活性;这些化合物在10-5 mg ml时是活跃的−1在1毫克毫升时不活跃−1.对于retusine(2),死亡率分别为96%和83%。

3.3.抗菌活性

表格1显示抗菌试验的结果。值得注意的是,样品的浓度为金黄色葡萄球菌,蜡样葡萄球菌,肠炎葡萄球菌范围从100到25μ克毫升−1白念珠菌从50到12.5μ克毫升−1.抑制的百分比超过50被认为是一种活动。所测黄酮类化合物(2-7)均未表现出任何活性,但二萜类化合物grindelic acid(1)对革兰氏阳性菌株有活性金黄色葡萄球菌(100和50μ克毫升−1),b的仙人掌(100μ克毫升−1),白念珠菌(50μ克毫升−1).


复合 金黄色葡萄球菌 b的仙人掌 美国肠炎 白念珠菌

100年μ克毫升−1/ 50μ克毫升−1

1 92.3 73.6 39.5 51.9
2 28.8 48.5 −16.7 18.5
3. 28.1 45.7 −3.6 1.3.
4 7.1 46.8 23.4 0.3
5 8.5 22.7 8.3 13.2
6 4 42.7 29.6 9.8
7 16.6 22.5 26.7 9.5
氨苄青霉素(250μ克毫升−1 95 90 78 - - - - - -
制霉菌素(62.5μ克毫升−1 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 98

50μ克毫升−1/ 25μ克毫升−1

1 76.7 0.71 12.7 42.5
2 −13 38.7 −20 5.3
3. 10.7 19.7 2.6 −7.7
4 −9.5 34 −9.2 −4.4
5 −15.77 −19 −45.5 4.4
6 −9.87 20.8 −24.3 4
7 −7.9 −46 −38.8 3.2

25μ克毫升−1/ 12.5μ克毫升−1

1 10.8 2.03 −29.6 14.8
2 −27.4 −43 −30 −3.2
3. 12.1 11.3 1.7 −7.2
4 18.4 3.2 −8.6 −3.2
5 −41 −72 −64.8 0.6
6 −34 2.2 −39.3 0.3
7 −24 −48 −52.5 10.24

3.4.分子对接

三个不同的原因促使我们对grindelic acid(1)与组蛋白去乙酰化酶(HDAC)进行分子对接研究。首先是格林酸具有良好的细胞毒作用和抑菌效果,促使我们从分子水平深入研究其作用机制。其次是在研磨酸的化学结构中存在基本的药效特征。最后,报道了HDAC抑制剂的细胞毒性和抗菌作用[4361].报道的组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂必须具有三个主要的药效特征,包括锌结合基团(ZBG),在活性位点螯合锌原子,一个连接基团,容纳活性位点的管状通道,以及一个与表面识别基序相互作用的盖层基团,由一个小连接单元连接到连接基团(图)2(一个)) [6263].所有这些特征都在grindelic acid中发现(图2 (b)).

化合物1与HDAC进行了对接研究(PDB ID: 2VQM;Resolution: 1.80 Å)来检查其与提议目标的绑定模式。共晶配体(HA3)被用作参考分子。对接研究结果表明,对接化合物对HDAC具有良好的结合亲和力,结合自由能为−18.70 kcal/mol。这种化合物表现出类似于共晶配体的相互作用的结合模式(表2;数字3.).


广告样稿。 结合自由能(千卡/摩尔)

共晶配体 −14.02
1 −18.70

结晶配体(HA3)的结合能为−14.02 kcal/mol。结晶配体的具体结合方式如下N-羟基羧酰胺部分占据锌结合区,与His158和Gly167形成两个氢键。此外,它还与Zn原子形成静电相互作用。此外,2-羰基噻吩部分占据了HDAC的连接子区。此外,3-苯基- 5,6,7,8 -四氢咪唑[1,2 -a]吡嗪部分占据了受体的帽袋(表2;数据4而且5).

化合物1占据了HDAC的活性腔,其结合能为−18.70 kcal/mol。乙酸部分与锌结合,羧基与Gly167形成氢键。并与共晶配体的Zn原子形成静电相互作用。此外,(S)-2-甲基四氢呋喃部分占据了HDAC的连接子区。此外,(4aR, 8aS)-1,1,4a-三甲基- 1,2,3,4,4a, 5,8,8a -八氢萘部分占据了受体的帽袋(图4而且6).

4.结论

生物测定指导下分离的甲醇提取物Cousinia alata(1). grindelic acid表现出良好的细胞毒活性卤虫盐沼并对其有抗菌活性金黄色葡萄球菌,蜡样芽孢杆菌,而且肠炎。

药理特性和分子对接研究表明:(1)具有与共晶配体相似的相互作用结合模式,以−18.70的结合能占据HDAC酶的活性腔,这可能解释了其显著的生物活性。此外,从黄酮类化合物的氯仿提取物中分离得到6种黄酮类化合物(2-7)Cousinia alata。所有化合物均为首次从该化合物中分离得到Cousinia物种。

数据可用性

支持数据(化合物1-7的核磁共振)是公开的。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

致谢

作者感谢Wim De Borggraeve教授(KU Leuven, Belgium)在NMR分析方面的帮助和Zhanar Iskakova(哈萨克斯坦科技与商业大学)的支持和帮助。这项研究得到了哈萨克斯坦共和国教育和科学部科学委员会的资助(批准号为no. 1)。AP08051842)。

补充材料

分离化合物的质谱和核磁共振。补充材料

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