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免疫学研究杂志/2021/文章

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体积 2021 |文章的ID 6659960 | https://doi.org/10.1155/2021/6659960

青浅正正、萨达姆·侯赛因Md、坂田智子、古贺庆田、重光高成、正谷裕二、山口元典、齐藤健二、金无卓 基于表位的新型抗pad2单克隆抗体抑制瓜氨酸化",免疫学研究杂志 卷。2021 文章的ID6659960 10 页面 2021 https://doi.org/10.1155/2021/6659960

基于表位的新型抗pad2单克隆抗体抑制瓜氨酸化

学术编辑器:宝会许
收到了 2020年12月08
修改后的 2021年3月10
接受 2021年3月25日
发表 2021年4月12日

摘要

蛋白质精氨酸脱亚氨基酶2- (PAD2-)催化瓜氨酸化的异常上调在各种自身免疫性疾病(类风湿关节炎和多发性硬化症)和几种癌症中都有报道。目前,还没有抗pad2单克隆抗体可以抑制瓜氨酸化反应。在这里,一个抗原决定基341YLNRGDRWIQDEIEFGY357作为PAD2的抗原位点。用该抗原表位免疫鸡,筛选产生的单克隆抗体对全长PAD2的反应性。酶联免疫吸附试验表明,从噬菌体展示文库中筛选的6种单克隆抗体与小鼠PAD2发生交叉反应。动力学分析表明,单抗与PAD2的结合在纳米摩尔范围内,表明具有强结合能力。的结果在体外瓜氨酸化抑制实验结果显示,单抗对组蛋白和苯甲酰- l-精氨酸乙酯瓜氨酸化抑制的半最大有效浓度值在6-75 nM范围内,具有较强的抑制能力。对表位进行丙氨酸扫描,发现该肽片段344RGDRWIQDEIEF355负责产生强烈的抗体反应,抑制pad2催化的瓜氨酸化反应。这些抗体可以帮助了解细胞外PAD2功能和治疗与异常瓜氨酸化相关的疾病。

1.简介

瓜氨酸化是一种翻译后修饰,涉及到通过精氨酸的脱亚基产生瓜氨酸(一种非编码氨基酸)。该反应是由肽精氨酸脱亚胺酶(PAD)家族的酶催化。pad调节多种细胞过程,包括基因表达的转录调控[1,皮肤角质化[2],以及维持髓鞘绝缘[3.].此外,瓜氨酸化促进中性粒细胞胞外陷阱(NETs)的形成,这是一种中性粒细胞捕获和消除病原体的机制[45].在人类中,PAD家族包括5种钙依赖同工酶(PAD1-4和6)[6].钙诱导构象变化,从而激活酶[7].最近,主要在免疫细胞、大脑、骨髓和关节表达的PAD2和PAD4同型引起了科学界对药物发现的兴趣[68].

pad是缺乏跨膜区或分泌信号序列的细胞质或核蛋白。因此,pad的表达和功能仅限于细胞质[9].然而,最近的研究表明,在炎症过程中,pad的表达上调,导致瓜氨酸化上调,NETosis的激活,从而导致受损细胞释放pad [1011].胞外pad导致蛋白质过度瓜氨酸化,并在几种自身免疫性和炎症性疾病中报道了瓜氨酸化异常上调[12],尤其是类风湿性关节炎(RA)。在RA患者的滑液(滑膜液)中,已鉴定出100多种瓜氨酸化蛋白,包括几种中性粒细胞相关的细胞内蛋白、细胞外基质蛋白和血清蛋白,如白蛋白、纤维蛋白原和免疫球蛋白[1314].因此,脱亚胺蛋白作为新抗原,促进抗瓜氨酸蛋白抗体(ACPAs)的产生,而ACPAs介导局部炎症反应并加剧RA的严重程度[15].在大约70%的RA患者中发现acpa。此外,在RA患者的SF中检测到PADs的活性[1617].Spengler等[10]在RA患者的细胞游离SF中均检测到PAD2和PAD4蛋白,但其表达水平在不同患者中存在差异。有趣的是,一个体外Zhou等人的研究[18[译文]报道称,活中性粒细胞天生可以在细胞表面表达具有催化活性的PAD4,而活性PAD2可以在不受刺激的情况下由中性粒细胞自发地释放到培养基中。

PAD2除了参与RA的进展外,还参与多发性硬化症(MS)的发病和进展[19],内毒素致死性[20.,以及乳腺癌[21].目前,还没有特异性药物抑制PAD2。胞内或胞外瓜氨酸化在RA发病机制的起始或进展中的作用尚不清楚。因此,使用特异性单克隆抗体(mAb)抑制细胞外PAD2将有助于阐明该同工酶的生物学作用,以及治疗与PAD2活性失调相关的特定疾病。在本研究中,我们旨在开发一种新型的PAD2特异性单克隆抗体,可以抑制PAD2的瓜氨酸化活性。

2.材料和方法

2.1.材料

Keyhole帽胚血青素- (KLH-)修饰肽抗原(表位)购自日本东京SCRUM公司。Freund的佐剂(完全或不完全)从WAKO Pure Chemical Industries, Ltd.(大阪,日本)采购。RNA分离试剂TRIzol和高纯度RNA分离试剂盒分别购自美国加州生命科技公司(Life Technologies)和瑞士巴塞尔罗氏诊断公司(Roche Diagnostics)。ficol - paque PLUS购自Cytiva(马尔伯勒,美国)。DNA操作过程中使用的试剂购自Takara (Kusatsu, Japan)。XL1-Blue电活性细胞和VCS-M13购自美国加州Stratagene公司。h链或l链表达载体pcDNA3.4取自美国加州Invitrogen公司。Expi293表达系统购自美国Thermo Fisher Scientific公司(Waltham, USA)。限制性内切酶购自美国马萨诸塞州新英格兰生物实验室(New England Biolabs)。用于克隆的寡核苷酸和重组体的DNA序列从Eurofins Genomics(东京,日本)获得。 Recombinant human PAD2 (rhPAD2) was purchased from Cayman Chemical (Michigan, USA) and was used for all experiments unless otherwise stated. Substrate Nα-苯甲酰- l-精氨酸乙酯(BAEE)和组蛋白分别来自Peptide Institute Inc.(日本茨城)和Sigma-Aldrich(美国密苏里)。抗体纯化柱蛋白A购自日本香川ProteNova公司。

2.2.筛选抗原表位

为了通过免疫激发鸡的强抗原性,对PAD进行了高通量抗原表位筛选。此前,我们和我们的团队基于专有技术禽先导抗体基因(ALAgene®-鸡源性单克隆抗体的筛选和生成平台)成功开发了基于表位的抗pad4抗体[22].PAD2和PAD4在结构和功能上具有相同的性质[23].因此,我们选择了PAD2的免疫原性表位,其定位与之前发表的PAD4表位几乎相同[22].随后,蛋白质-蛋白质BLAST (Blastp) [24]分析筛选的表位与鸡PAD2蛋白序列的相似性。

2.3.鸡的免疫与RNA的分离

3个月大的Boris Brown鸡每4周腹腔免疫1次,共接种333只μ在弗氏完全或不完全佐剂中乳化PAD2的klh修饰的表位。每隔一周采集一次翅膀静脉的血液样本。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定抗体滴度。末次免疫时,静脉注射用磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释的抗原。末次免疫后第3天收集鸡脾脏。采用Ficoll-Paque PLUS密度梯度离心分离淋巴细胞。用TRIzol从淋巴细胞中提取RNA,用RNA分离试剂盒纯化。

2.4.抗pad2抗体的噬菌体文库制备、平移和表达

先前公布的方案被用于制备鸡源嵌合抗pad2抗体[25].简单地说,将提取的RNA进行逆转录,合成互补DNA。可变区域(重链(VH)和轻链(Vl),用PCR扩增抗体。纯化VH和Vl片段使用单链可变片段(scFv)链接器组装。该连接子富含灵活的甘氨酸,由15个氨基酸组成(GGGGSGGGGSGGGGS)。然后将单链抗体片段与噬菌体载体pPDS (accession number D50401)连接。将该重组载体电穿孔入XL1-Blue电感受态细胞。用VCS-M13感染,在含氨苄西林(50μg / mL),四环素(25μg / mL),卡那霉素(25μg / mL),异丙基β- d -1-巯基半乳糖苷(0.1 mM)过夜。用离心方法收集细胞。将制备好的含scFv文库的上清液过滤,用聚乙二醇沉淀,储存在4℃摇匀。

在每个周期的平移中,平板都涂上全长的rhPAD2 (5μ在PBS g / mL)。pad2特异性抗体克隆经过5个循环筛选富集。对反应性增强的文库进行噬菌体筛选。单噬菌体片段抗体克隆在96孔板中培养产生噬菌体。用ELISA法筛选得到的噬菌体与PAD2特异性结合。与PAD2结合而不与牛血清白蛋白(BSA)结合的克隆被判定为PAD2特异性克隆。

得到的阳性克隆进行测序。具有不同V的单链抗体H和Vl序列被视为单独的克隆。PCR扩增单链抗体的DNA序列,得到鸡抗体的H链可变区和L链可变区基因。将H链和L链可变区序列克隆到鼠/鸡嵌合抗体(IgG)表达载体pcDNA3.4中。配对的重链和轻链表达载体按照制造商的说明转染到Expi293表达系统中。培养5 d后,用蛋白A柱层析法从培养上清中纯化已组装好的IgG抗体。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测IgG的纯度。280nm分光光度法测定IgG浓度。纯化后的嵌合IgG保存并用于后续实验。

2.5.ELISA法测定嵌合IgG的反应性

采用rhPAD2、重组小鼠PAD2 (rmPAD2)或BSA(对照抗原)检测嵌合IgG反应性。如前所述,rhPAD2或rmPAD2在Expi293表达系统中分别表达[2627].简单地说,293F细胞系转染了含有pad2特异性克隆的pcDNA3.4。培养3天后收集细胞,分离PAD2用于进一步实验。rhPAD2或rmPAD2 5μ将g/mL PBS涂布在Maxisorp NUNC - immuno™ELISA平板(NUNC, USA)上,4°C过夜。然后用25% BlockAce PBS在37°C阻滞平板1小时。接下来,用含0.1%吐温20的PBS清洗盘子。向孔中加入四倍连续稀释的嵌合IgG(从200 ng/mL开始),在37°C孵育1 h。洗板后,山羊抗小鼠IgG (H+L)辣根过氧化物酶结合二抗(KPL;1: 1000), 37℃孵育1 h。盘子又洗了一遍,3,3 5、5 -将四甲基联苯胺微孔过氧化物酶底物体系加入微孔中显色。通过使用EMax Plus分光光度计(Molecular Devices, California, USA)测量450/650 nm处的吸光度来定量色强。半最大有效浓度(EC50),利用SoftMax Pro软件(Molecular Devices, California, USA)估算和计算嵌合IgG亲和力。

2.6.利用表面等离子体共振(SPR)测量亲和度

使用Biacore T200仪器(Cytiva,马尔伯勒,美国),通过SPR评估嵌合抗体与PAD2的结合动力学。小鼠抗体捕获试剂盒用于Biacore系列S传感器芯片CM5表面制备,按照制造商的说明。简单地说,兔抗小鼠多克隆抗体通过胺偶联固定到CM5芯片表面的自由羧基,使用标准的NHS/EDC程序。接下来,抗PAD2 (2μg/mL)的HBS-EP缓冲液(10 mM HEPES;pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA和0.005% ( 表面活性剂P20)被兔抗小鼠多克隆抗体捕获。此外,不同浓度的人类PAD2(0.625, 1.25, 2.5, 5和10)μg/mL),使用Biacore T200进行分析,生成动力学传感图。利用评价曲线拟合软件将数据全局拟合为1:1绑定模型,得到动力学参数。解离速率常数( 通过拟合解离阶段结合反应的变化来确定,而结合速率常数( 通过拟合不同浓度的PAD2来确定。平衡解离常数( 是由?的比率计算出来的

2.7.Citrullination化验

一个在体外采用抑制实验评价嵌合IgG对rhPAD2瓜氨酸化活性的抑制能力。BAEE和组蛋白作为PAD2底物。瓜氨酸的生成是通过比色法检测的[22].阴性对照采用抗二硝基苯(DNP)抗体[28].标准抑制反应,5 nM的rhPAD2与四倍连续稀释(600 nM开始)的嵌合IgG在44孵育μL反应缓冲液(20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 1 mM二硫苏糖醇,150 mM NaCl)在25℃下30分钟。这种反应始于50年μL与衬底(10mm)和氯化钙的加入相等2(1毫米)。样品在37°C孵育4小时,用12.5溶液淬灭反应μL 5 M高氯酸。接下来,40μ将L的反应混合物与100混合后测定瓜氨酸活性μL试剂A (0.04% 氯化铁,25% H2所以4, 20%的 H3.阿宝4), 50μL试剂B (0.5% 2,3-丁二酮肟和0.01% 氨基硫脲)和10μL蒸馏水。然后将混合物煮沸5分钟,并在冰浴中冷却至25°C。测定样品在492 nm处的吸光度。嵌合IgG抑制rhPAD2瓜氨酸化活性的效果与抗dnp抗体进行了归一化。

2.8.丙氨酸扫描的表位定位

为了阐明抗原表位中涉及抗体识别的关键残基,进行了抗原表位作图。尽管有不同的方法,基于合成肽的丙氨酸扫描是绘制抗体分子表位特异性的最常用方法之一[29- - - - - -31].本研究合成了6个突变表位,将表位序列中的3 - 2个氨基酸替换为丙氨酸(Supplementary file, TableS1)使用GenScript(日本东京),纯度超过95%。如前一节所述,使用ELISA评估每个表位模拟物与抗pad2抗体的剂量依赖性反应性。

3.结果

3.1.筛选抗原决定基

表位,341YLNRGDRWIQDEIEFGY357,被确定(图1).该表位序列与鸡肉蛋白序列的Blastp分析表明,该表位与鸡肉PAD2具有显著的相似性,只有两个不同的残基(数据未显示)。

3.2.从噬菌体展示文库中筛选抗pad2抗体

将经PAD2选择性表位免疫的鸡构建噬菌体scFv显示文库,与rhPAD2进行5个周期筛选。采用噬菌体ELISA法鉴定rhPAD2特异性噬菌体单链抗体克隆。序列分析的VH和Vl结果显示,S4、S10、S24、S108、S170和S309共有6个克隆。这些阳性克隆随后在Expi293系统中表达,并通过蛋白A柱层析纯化。纯化程度经SDS-PAGE确认,数据显示纯化清晰良好的条带(补充文件,图S1).ELISA法验证了每个嵌合IgG与rhPAD2或rmPAD2结合的能力2),以及欧共体50计算各嵌合IgG值。结合亲和力与EC的大小成反比50价值。所有筛选的抗体均与rmPAD2发生交叉反应。

3.3.抗体与rhPAD2的亲和力评价

嵌合抗体和固定化rhPAD2之间的相互作用通过传感器图SPR进行测量。SPR分析结果证实,rhPAD2与抗体具有高亲和力。动力学常数,包括 而且 值的测定结果汇总于表中1.的 而且 S10和S170单克隆抗体的值相似,显示 值分别约为7.8和6.33 nM。单抗S4和S309的解离值较高,表现为 分别约为26和42 nM。然而, 单克隆抗体S24和S108的值分别约为80和74 nM。


Anti-PAD2马伯 (1 /女士) (1 / s) (M)

S4
S10
S24
S108
S170
S309

3.4.抗pad2抗体抑制瓜氨酸化

研究了抗pad2抗体对rhpad2介导的小牛胸腺BAEE和组蛋白瓜氨酸化的影响。此外,电子商务50测定抗体值。抗体降低了rhPAD2的瓜氨酸化活性。抗体介导的瓜氨酸化反应抑制随底物的不同而不同。例如,EC50抑制BAEE瓜氨酸化的抗体值在8.0-20 nM范围内(图2)3.).相反,欧共体50组蛋白瓜氨酸化抑制抗体的值在7.0-75 nM范围内4).在筛选的抗体中,S10的EC最低50组蛋白瓜氨酸化的抑制作用(约7.6 nM)。S10的KD值也最低。S108和S4等其他单抗候选基因也有EC50组蛋白瓜氨酸化抑制作用小于15 nM。

3.5.丙氨酸扫描的表位定位

用ELISA法检测丙氨酸取代的抗原表位与嵌合抗体的反应性。欧共体50抗原表位的前三个氨基酸(341Y -343N)被丙氨酸取代,是原表位的1.5倍(见表1)2).EC中也有类似的变化50用丙氨酸取代表位最后两个氨基酸,观察其价值。然而,电子商务50表位的价值,其中接下来的三个氨基酸(344R -346D)被取代的丙氨酸比原表位增加3倍至250倍。此外,取代接下来的三种氨基酸(347R -349I)与丙氨酸显著改变抗体的结合亲和力,并显著增加EC50.另外,替换350Q-F355丙氨酸显著增加EC50在一些候选单抗中,如S4、S108、S170和S309,它们完全失去了结合亲和力。这表明这些残基在单抗结合中起着关键作用。一个典型的表位大约有8-10个氨基酸长。因此,筛选的单克隆抗体可以在344RGDRWIQDEIEF355抗原表位碎片。


残留不。 341 342 343 344 345 346 347 348 349 350 351 352 353 354 355 356 357 电子商务50,原始抗原决定基
氨基酸 Y l N R G D R W D E E F G Y

Anti-PAD2马伯S4 6.12 42.72 1.68×107 北达科他州 105.90 9.17 4.45
Anti-PAD2马伯S10 6.18 32.82 659.60 4.25×105 1.64×1012 9.08 4.49
Anti-PAD2马伯S24 7.15 123.90 1550.00 119.70 250.70 9.16 5.08
Anti-PAD2马伯S108 4.93 12.56 50.09 北达科他州 1.30×105 5.76 4.16
Anti-PAD2马伯S170 3.01 553.30 1.24×107 6.24×105 北达科他州 4.35 2.15
Anti-PAD2马伯S309 19.25 295.40 332.60 北达科他州 北达科他州 31.90 11.53

粗体区域在丙氨酸扫描中没有明显的反应性。

4.讨论

由于人类和小鼠是系统发育相关的,它们具有各种高度保守的蛋白质。因此,用人类蛋白免疫小鼠有时会导致胸腺耐受[33],并引起微弱的抗体反应。或者,可以产生敲除小鼠,这是费力和耗时的,并且经常会破坏耐受性[34].相比之下,鸡是免疫的替代宿主,因为它引起了针对表位的免疫反应,这些表位在哺乳动物蛋白的多个同源中大多保守[35].此外,鸡的免疫球蛋白库适合于抗体噬菌体的展示。鸡从一组V产生免疫球蛋白H和Vl带有序列(36].只用一组4个PCR引物就可以很容易地分析整个鸡抗体库[37].此前,Nakamura等人证明了使用鸡作为免疫宿主对抗高度保守的哺乳动物朊病毒蛋白的优势,并获得了大量的单链抗体库[25].有趣的是,人类PAD2与小鼠PAD2和鸡PAD2的序列相似性分别为93%和68%。这些结果表明鸡是免疫的最佳寄主。在本研究中,所选择的表位与鸡PAD2有88%的序列相似性(数据未显示),这表明即使在鸡中也不能引起足够的免疫反应。然而,免疫后鸡的血清稀释倍数高于64000,我们的专业知识足以成功制备噬菌体文库。

为了表征单抗结合的特异性,我们对表位进行了丙氨酸扫描。酶联免疫吸附测定结果显示,344RGDRWIQDEIEF355,对于单克隆抗体的绑定至关重要(Table2).此前,抗pad4抗体也与这些位点结合340E -356PAD4 Y。我们推测该肽片段对于抑制PAD2和PAD4的瓜氨酸化活性具有重要意义。与该区域结合的抗体晶体学分析的细节正在进行中;我们希望在下次出版的时候,能放上足够的资料。

一般来说,pad在细胞生理条件下是不活跃的[38].暴露于毒素、感染或基因突变可能会促进细胞凋亡和坏死。因此,由于钙离子的涌入,pad在死亡细胞中被激活。PAD2和PAD4的瓜氨酸化效率随底物的不同而不同[39].与PAD4相比,PAD2能更有效地对血浆蛋白纤维蛋白原进行瓜氨酸化。然而,PAD4可以比PAD2更有效地瓜氨酸化组蛋白H3 [40].这些发现表明,这两种亚型表现出不同的酶活性[23].自身免疫性疾病的特征是细胞外瓜氨酸化,尤其是细胞外超瓜氨酸化[12].本研究报道的抗PAD2抗体可能直接抑制了PAD2的催化活性,从而抑制了PAD2与底物的相互作用。另外,抗PAD2抗体可能阻碍钙结合和二聚,而钙结合和二聚对PAD2活性至关重要。抗PAD2抗体将阻止细胞外瓜氨酸化而不是细胞内瓜氨酸化,这有助于保持细胞对PAD2细胞内底物的瓜氨酸化的先天能力。可以认为,含有抗PAD2抗体的药物比PAD2的小分子抑制剂副作用更小,这对患者的安全和依从性很重要。虽然PAD亚型之间的保守氨基酸序列在50-55%范围内,但本研究生成的单克隆抗体特异性识别PAD2亚型,而不识别其他PAD酶亚型(数据未显示)。这与PAD的小分子抑制剂的性质相反,它同时抑制PAD1、PAD2、PAD3和PAD4催化的瓜氨酸化[841].此外,我们希望抗PAD2抗体可以通过靶向补体激活免疫复合物或Fc受体介导的吞噬细胞内吞作用来清除细胞外PAD2 [42].

PAD2在大脑中表达,其特点包括通过促进大脑和脊髓轴突周围脂肪髓鞘的损伤而解除瓜氨酸化[19].因此,通过抗PAD2抗体抑制PAD2可能是一种有效的治疗MS的策略。使用小分子抑制剂抑制PAD2可能对MS无效,因为它们可以阻断细胞内瓜氨酸化,而瓜氨酸化对有功能的髓磷脂的产生至关重要。有研究报道MS患者血脑屏障(BBB)受损[43].因此,一种基于抗体的药物可能会穿过血脑屏障。

5.结论

PAD的小分子抑制剂在小鼠模型中取得了很好的结果[4445].然而,涉及这些小分子抑制剂的临床试验设计一直被批评为抑制剂抑制先天免疫,从而增加患者感染的易感性[46].传统的单抗治疗RA靶细胞因子,如TNF-αil - 1 -β或il - 6。然而,这些细胞因子的中和可能导致严重的副作用的发展。ACPA可在发病前数年检测到。因此,抗体介导的PAD2活性抑制可能是一种治疗异常瓜氨酸化相关疾病的新方法。

数据可用性

支持本研究结果的数据可根据要求从通讯作者处获得。

的利益冲突

MA、MSH、TS、KK、TS、YS、MY、KS、MK为医药食品国际有限公司员工。

致谢

我们要感谢Editage (http://www.editage.com)进行英文编辑。

补充材料

表S1:丙氨酸扫描的突变表位列表。图S1: PAD2抗体SDS-PAGE纯化结果。补充材料

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