SERPINA1 mRNA可治疗α -1抗胰蛋白酶缺乏

摘要

α -1-抗胰蛋白酶(AAT)缺乏是一种遗传疾病，由于编码AAT的SERPINA1基因突变，导致AAT失活/缺陷。这种疾病与肺中AAT活性降低和肝脏中过量缺陷AAT蛋白沉积有关。目前还没有针对AAT缺乏症相关肝病的特异性治疗方法。AAT肺病通常用几种血清蛋白替代产品中的一种来治疗;然而，SerpinA1替代疗法的有效性的长期研究还没有得到，它不能减少AAT缺乏症患者的肝损伤。mRNA治疗可能同时靶向AAT缺陷患者的肝脏和肺。用编码SerpinA1的mRNA转染AAT患者成纤维细胞和AAT患者成纤维细胞来源的肝细胞，检测细胞培养基中SerpinA1的表达。我们的数据显示，治疗AAT患者成纤维细胞和AAT患者成纤维细胞衍生肝细胞的培养基中SerpinA1蛋白增加。在野生型小鼠体内研究表明SERPINA1 mRNA在肝脏和肺部的生物分布，以及SERPINA1蛋白在这两个靶器官中的表达，这两个靶器官在AAT缺乏中受到严重影响。综上所述，我们的数据表明SerpinA1 mRNA治疗有可能使患有AAT缺陷的患者受益。

1.简介

α -1抗胰蛋白酶缺乏症(AATD)是一种破坏性疾病，缺乏适当的治疗方法。目前的治疗方法只保护肺部，在晚期病例中需要经常静脉注射血浆来源的AAT蛋白。AATD患者易患阻塞性肺疾病和肝病(例如，儿童和成人的肝硬化和肝细胞癌)[1- - - - - -3.］．据估计，约1-5%确诊为慢性阻塞性肺疾病(COPD)的患者有α -1-抗胰蛋白酶缺乏症[4］．尽管极其罕见，但有报道称AATD患儿发生肺气肿[3.肝病的发病率随着年龄的增长而增加[3.］．严重的症状会在晚年出现，尤其是吸烟者。AATD的肝脏症状见于生命晚期，通常需要肝移植。AATD是一种遗传病，由细胞内的突变引起SERPINA1基因(5］．SERPINA1基因有两个等位基因称为M等位基因(正常患者有MM基因型)。导致严重AAT缺乏的最常见的等位基因是Z (E342K) [6，7］．据报道，95%的严重AATD患者具有ZZ基因型，血清SerpinA1水平仅为10-20% [6］．在ZZ突变的情况下，SerpinA1蛋白不能正常折叠，不会被肝细胞分泌;因此，AATD不是由于无法制造蛋白质，而是由于无法分泌功能性蛋白质。ZZ SerpinA1在肝细胞中的积累导致严重的肝损伤[6］．纯合子的PIZZ非常常见，在北美和欧洲发生在1:25 500-3000的新生儿中。

α -1-抗胰蛋白酶(AAT)，也被称为SERPINA1(丝氨酸蛋白酶抑制剂，A族，成员1)，是一种主要由肝细胞产生的分泌蛋白，在较小程度上由单核吞噬细胞、中性粒细胞和气道/肠上皮细胞产生[5，8］．SerpinA1是一种循环糖蛋白，也是水溶性和可组织扩散的[5］．SerpinA1的主要作用是调节丝氨酸蛋白酶，其作用的主要部位在肺部。在那里，SerpinA1结合并灭活中性粒细胞弹性蛋白酶，从而在炎症反应期间保护肺泡组织免受蛋白水解降解[9］．SerpinA1是最丰富的循环抗蛋白酶，正常血浆中SerpinA1的浓度通常可达1-2g/L [5］．

AATD的特征是肝细胞粗面内质网中错误折叠的SerpinA1蛋白聚合，降低血液和组织中SerpinA1的浓度和活性[6］．对于严重缺乏症患者，SerpinA1血清水平低于50 mg/dL，而正常水平为200mg/dL。由于循环中的SerpinA1水平较低，肺无法免受中性粒细胞弹性蛋白酶的影响，这种酶会破坏肺泡，导致肺部疾病。因此，AATD最常见的临床并发症是肺气肿和肝脏疾病[10］．

到目前为止，只有AAT增强疗法可用于治疗AATD。AAT增强疗法于1987年发展起来，目前只被批准用于特定的严重AATD相关肺气肿患者的商业应用[6，11］．AAT增强只有助于向肺部供应SerpinA1，它可以帮助防止中性粒细胞弹性蛋白酶损伤。由于血清缺乏不是肝损伤的原因，因此对与AATD相关的肝病患者没有特殊的治疗方法。对于失代偿期肝硬化患者，唯一的治疗方法是支持治疗典型肝功能衰竭和肝移植[12］．

AATD是一种单基因遗传病，是mRNA治疗的理想靶点。信使核糖核酸是一种新颖的方式，由于它比传统的生物和酶替代疗法具有巨大的灵活性，因此有可能适用于广泛的疾病。基于mrna的治疗方法利用宿主细胞的内源性机制来生产和翻译后修饰靶蛋白，从而开发出以前无法靶向的疾病治疗方法。我们进行了体外和体内研究，以确定我们是否可以表达外源编码的SerpinA1，并将mRNA/蛋白靶向到适当的器官。

mRNA治疗可能同时靶向AAT缺陷患者的肝脏和肺部(有待于当前的实验)。我们的数据显示，在治疗的AAT患者成纤维细胞的细胞培养基中，以及在AAT患者成纤维细胞来源的原代肝细胞的细胞培养基中，SerpinA1蛋白增加。此外，在静脉注射SERPINA1 mRNA的WT动物中，SERPINA1 mRNA和SERPINA1蛋白都被观察到定位于肝脏和肺。综上所述，我们的数据表明，mrna介导的SerpinA1蛋白在肺中的表达可以抑制中性粒细胞弹性蛋白酶，而在肝脏中则可以促进MM亚型的表达，为AAT患者提供了多条获益途径。

2.材料与方法

2.1.AATD患者成纤维细胞

细胞培养条件．以下患者成纤维细胞来自科瑞尔医学研究所，细胞库(卡姆登，新泽西):GM11423和GM12445来自AATD患者肝脏，GM02522来自AATD患者皮肤，正常对照成纤维细胞系ND34769来自皮肤。细胞在Eagle 's Minimum Essential Medium中培养，其中含有Earle 's盐和非必需氨基酸(Thermo Fisher Scientific, Inc.， Waltham, MA)，并添加15%的胎牛血清，在37°C和5% CO中培养₂．

转染条件．患者成纤维细胞分别转染2.5ug的mRNA和4μl的mRNA-In脂质转染试剂(MTI-GlobalStem, Gaithersburg, MD)，在3个独立实验中，每个实验3个生物重复。每个mRNA被稀释到2.5μg在OptiMEM (Thermo Fisher Scientific, Inc.， Waltham, MA)中，每口井稀释同样适当体积的mRNA-In，并按照制造商的建议进行操作。稀释的mRNA与稀释的脂质混合，室温孵育15分钟后加入细胞。将mrna -脂质混合物添加到患者成纤维细胞后，将细胞置于37°C和5% CO的培养箱中₂．24小时后，用PBS轻轻清洗细胞两次，并在新鲜RIPA缓冲液(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)中与1X蛋白酶抑制剂(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)中裂解。

细胞裂解和总蛋白定量:将患者成纤维细胞裂解物收集在0.5mL试管中(德国汉堡Eppendorf)，在4℃下18000 x g离心，以去除细胞碎片。离心后，清上清小心地转移到一个单独的标记管，并放置在冰上。根据制造商的协议，使用BCA检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific, Inc.， Waltham, MA)测定总蛋白浓度，一式两份，96孔格式。

Wes自动毛细管电泳SERPINA1表达．最终样品5μl每个蛋白浓度为0.4 mg/mL，按照protein Simple Wes生产商的说明制备。利用ProteinSimple Wes大小毛细管电泳系统(ProteinSimple Wes;ProteinSimple，圣何塞，加州)。用SERPINA1特异性抗体在1:125稀释(Novus NBP1-90309, Novus Biologics, Littleton, CO)和1:1000的硫氧还蛋白(CST 2429, Cell Signaling Technologies Inc.， Danvers, MA)检测大小分离的蛋白质，使用标记的兔二抗进行可视化，并使用制造商的软件进行定量。对于每个车道，SERPINA1的曲线下面积(AUC)归一化为硫氧还蛋白对照的AUC。

2.2.α -1抗胰蛋白酶缺乏肝细胞

细胞培养条件．AATD患者源性肝细胞由DefiniGen (Cambridge UK)使用专利分化协议从AATD成纤维细胞中生成。细胞在DTM培养基和DRM培养基(DefiniGen，英国剑桥)中生长，并在24孔板中每孔镀50万个细胞。细胞在37°C、5% CO的低氧条件下生长₂5% O₂根据专利制造商的协议(英国剑桥DefiniGen)，转染前10天内每两天更换一次培养基。细胞按照制造商的说明在低氧条件下生长，这有利于细胞生长，而非低氧条件会减少细胞生长。

ELISA法转染条件及蛋白表达．在3个独立实验中，每2.5ug mRNA转染AATD肝细胞4ul Lipofectamine®2000 (Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA)，每个实验有3个生物重复。然后将细胞孵育24、48和72小时，然后取出细胞培养基，使用Abcam (Cambridge, MA)的ELISA试剂盒并按照制造商的协议检测SerpinA1蛋白浓度。

2.3.在活的有机体内研究

所有实验、动物安置、处理和实验程序/协议都是按照Alexion制药公司的要求批准和执行的。IACUC的指导方针和规章。本研究采用C57BL/6雄性小鼠(6周龄)。小鼠被饲养在一个温度控制的环境中，12小时/12小时的明暗循环，标准饮食和自由饮水。

mRNA合成脂质纳米颗粒和体内给药．使用含有SERPINA1 mRNA的自组装可电离脂质纳米粒(LNP)构建mRNA构建。本实验以编码GFP的mRNA作为载体对照，PBS作为阴性对照。通过在pH值为4.0的乙酸缓冲液中快速混合mRNA与脂质混合物Hepato9 mRNA kit (Precision NanoSystems)，以脂药比约11 (wt/wt)悬浮在乙醇中制备LNPs。动物经尾静脉单次静脉注射1.5 mg/kg配方mRNA。注射24小时后处死动物，组织固定后进行原位杂交(ISH)和免疫组化(IHC)处理。

样品采集和FFPE样品制备．对动物进行尸检，并将左外侧叶平置于组织盒中(Fisher Scientific)。然后将磁带放入充满10%中性缓冲福尔马林，NBF (Sigma)固定溶液的容器中，固定溶液与组织体积的比例至少为1:20。样品在室温下至少固定24小时，但不超过48小时。组织固定后，将卡带放入充满PBS的容器中，放置时间不超过3天。PBS洗净后，处理肝组织，包埋石蜡块。

2.4.免疫组化和原位杂交方法

SERPINA1在福尔马林固定的石蜡包埋上进行免疫组化μm组织切片使用SERPINA1抗体(Atlas, HPA001292 at 1:100)。免疫染色在Leica BOND RX平台(Leica Biosystems, Leica Microsystems Inc.， Buffalo Grove, IL)上进行，按照标准方案进行，并有适当的阳性对照。抗原提取，在徕卡BOND RX平台上标准，使用徕卡ER1, EDTA-Tris, pH 8.0溶液。玻片在分级乙醇系列中脱水，在二甲苯中清除，并使用Cytoseal安装。使用VS120系统在40倍放大(Olympus)下成像。

对于mRNA的可视化，进行了原位杂交(ISH)。定制RNA原位杂交探针(Affymetrix, Santa Clara, CA)用于检测SERPINA1 mRNA。采用ViewRNA eZ-L检测试剂盒(Affymetrix, Santa Clara, CA)和Leica BOND RX平台(Leica Biosystems, Leica Microsystems Inc.， Buffalo Grove, IL)进行自动化RNA ISH检测。福尔马林固定，石蜡包埋(FFPE)组织在5 um厚度的玻片上制备，并放在徕卡BOND RX上。ViewRNA eZ-L试验根据制造商的协议进行，但简单地说，RNA在95°C Bond表位检索溶液1(莱卡生物系统，Buffalo Grove, IL)中孵育10分钟，然后用Bond酶预处理试剂盒中的蛋白酶K以1:1000稀释孵育20分钟(莱卡生物系统，Buffalo Grove, IL)。用SERPINA1 1:40稀释探针进行杂交，然后进行FastRed检测。为了确保RNA的完整性和检测过程，额外的切片也与肽基脯氨酰基异构酶B (PPIB)的探针杂交，PPIB是一种内源性管家蛋白，用于ISH的阳性对照．以细菌蛋白二氢二吡啶酸还原酶(dapB)为阴性对照，进行非特异性染色对照。所有探针均以1:40稀释。玻片风干，二甲苯清除，使用Cytoseal安装。使用VS120系统在40倍放大(Olympus)下成像。

3.结果

3.1.患者成纤维细胞和患者成纤维细胞来源的原代肝细胞的细胞裂解物和细胞培养基中mrna来源的人SerpinA1表达

来自TriLink的人SERPINA1 mRNA转染到从科瑞尔研究所获得的AATD患者成纤维细胞中。在细胞裂解液中观察到人SerpinA1蛋白表达显著增加(图1(一))和细胞培养基(图1 (b))转染野生型(WT)或标记型(FT) SerpinA1。

(一)

(b)

在从DefiniGen获得的患者成纤维细胞源性原代肝细胞中也进行了人SERPINA1 mRNA转染。与仅有GFP mRNA的对照相比，WT SerpinA1蛋白在24h时进入培养基的分泌增加。我们观察到在转染后48小时和72小时，SerpinA1蛋白的表达随着时间的推移持续增加(图2)．

3.2.人SerpinA1在WT小鼠体内的表达

随后在WT C57bl/6小鼠中评估人SerpinA1蛋白的表达。人SERPINA1 mRNA在肝脏中被观察到(图3(一个))，这是可以预料的，因为信使rna被包裹在脂质纳米颗粒中，而脂质纳米颗粒通常会将大量的货物运送到肝脏。一个有趣的发现是，SERPINA1 mRNA也在小鼠的肺中被检测到(图3 (b))．使用人特异性SerpinA1抗体检测SerpinA1蛋白的表达。SerpinA1蛋白可见于双肝(图3 (c))和肺(图3 (d))．SerpinA1蛋白在肝脏中的正弦分布模式提示SerpinA1蛋白可能是由肝细胞分泌进入血液的。

(一)

(b)

(c)

(d)

4.讨论

AATD是一种毁灭性的疾病，需要有效的治疗方法使患者受益。目前的强化治疗不足以避免AATD患者的肝脏长期损伤。目前，许多研究小组正在寻求新的治疗方法，以提供急需的治疗方法，如基因疗法。例如，骨髓来源的干细胞移植已经在AATD小鼠中进行了试验，并证明对肝细胞恶化有一定的挽救作用[13］．基因替代策略也在临床试验中[14，15]，其中WT SERPINA1基因被插入肝脏并表达适当的SERPINA1蛋白。目前的方法仍然需要优化，aav介导的基因传递可能导致抗体介导的蛋白分泌减少或对病毒衣壳的免疫反应。

我们评估了SERPINA1 mRNA在小鼠肝脏中短暂表达的影响，因为mRNA向肝脏的传递相对简单，且通过脂质纳米颗粒(LNP)建立，我们可以使用LNP包裹的mRNA而不产生显著的免疫反应。最初，我们在AATD患者成纤维细胞和患者成纤维细胞衍生的原代肝细胞中验证了我们的假设。我们的数据清楚地表明，我们可以用mRNA编码SERPINA1，然后从两种细胞类型表达SERPINA1蛋白。我们还证明了SerpinA1蛋白是从这些细胞中分泌的，并且可以在上清液/细胞培养基中测定其蛋白水平。这意味着mRNA编码的SerpinA1蛋白在细胞内被适当折叠和修饰，以使分泌出ER并进入细胞培养基，这是这种mRNA治疗的一个关键特征。利用mRNA疗法，我们可以利用身体自身的细胞作为工厂合成蛋白质，翻译后修饰，最后将其分泌到血液中。细胞培养基的初步分析表明，分泌的SerpinA1在中性粒细胞弹性蛋白酶抑制试验中具有酶活性(数据未显示)。我们在图表中的数据1，2,3.表明SerpinA1蛋白水平显著高于基线或阴性对照水平。这些水平应该足以降低血浆和肺中的中性粒细胞弹性蛋白酶活性，从而防止肺泡降解和肺气肿，这是AATD的特征。

我们扩展了我们的研究，以确定mrna编码的SERPINA1是否可以在体内表达。我们的研究表明静脉注射人SERPINA1 mRNA到达WT小鼠的肝脏和肺(图3(一个)而且3 (b))．因此，脂包mRNA治疗可能同时靶向AATD的两个部位(肝脏和肺)。更重要的是，人类SerpinA1蛋白在WT小鼠的肝脏和肺中都产生(图3 (c)而且3 (d))．SerpinA1蛋白在肝窦中的表达模式表明，蛋白质是由肝细胞或其他肝细胞类型分泌的，如通常表达SerpinA1的星状细胞。我们的数据不能排除mRNA进入或被肝细胞以外的其他肝细胞表达的可能性，这还需要进一步的研究。肺部的人SerpinA1蛋白可能来自两个来源:通过静脉注射到达肺部的SerpinA1 mRNA，以及肝脏中由人SerpinA1 mRNA产生的分泌的人SerpinA1。在任何一种情况下，SerpinA1蛋白在肺和肝脏中的表达和定位潜力都是有希望的，因为它可以阻断肺中中性粒细胞弹性蛋白酶介导的损伤，同时可能减少肝脏中PIZZ的形成。后一种假设是基于Karadagi等人的研究。[9其中通过强化治疗SerpinA1蛋白的增加证明了AATD患者PBMC中PIZZ形式的减少。这增加了一种可能性，即当mrna编码的SerpinA1蛋白在肝脏中表达时，可以减少肝脏中PIZZ形式的生成，并随后抑制肝纤维化。抑制肝纤维化和内质网应激可能最终减少/消除AATD患者对肝移植的需求。我们的假设需要在体内AATD模型中进行验证，该模型证明了肝纤维化和肝细胞癌的进展。

虽然这些数据令人兴奋，但我们想指出的是，mRNA疗法需要改进，才能为AATD患者提供潜在的慢性益处。目前外源传递的mRNA在组织中的半衰期通常为24 - 48小时，而蛋白质的半衰期取决于蛋白质及其降解机制。增加mRNA半衰期的策略目前正在研究中，早期数据表明，我们可以通过调节密码子优化mRNA两侧的utr来增加mRNA稳定的持续时间[16］．合理的蛋白质工程策略也旨在促进蛋白质半衰期的延长，从而提高酶活性，并最终减少对mRNA治疗剂量的需求[17］．这些新的改进可能导致mRNA治疗不频繁的剂量，并保持足够的酶活性，如SerpinA1蛋白，以提供临床改善。改善mRNA治疗的另一个方面是LNP传输的安全性，我们可以每隔几周给LNP一次剂量。目前的LNP技术促进了一个月一次的给药方案，但如果我们将给药与疗效结合，则不支持更频繁的给药。如前所述，与一些aav基因治疗不同，lnp包裹的mRNA治疗可以重给药，剂量可以滴定以提供最大的患者获益。

5.结论

我们的研究展示了一种新的治疗方式的潜力，即mRNA治疗，通过这种治疗方式，可以替换缺失或无功能的蛋白质来实现正常功能。我们的研究结果表明脂包mRNA可以靶向于肺和肝脏，这是AATD的两个主要部位。而此前探索mRNA治疗AATD的研究显示，蛋白在A549和HEK293细胞中24小时表达[18我们的研究证实了SerpinA1蛋白在AATD患者成纤维细胞和患者源性肝细胞中的表达，这些细胞与该疾病相关。此外，我们扩展了之前在该领域的研究，证明脂包被的mRNA可以传递到小鼠肝脏和肺，并产生与患者功能相关的SerpinA1蛋白。在考虑将这种方式用于人类之前，需要在AATD疾病模型中进行进一步的研究，并确保在啮齿动物和高等动物中多次给药mRNA的安全性。综上所述，我们的研究提出了一种有趣的可能性，即使用SERPINA1 mRNA的mRNA治疗可能对AATD患者有益。

数据可用性

本文中发表的所有支持结果的数据都在文中给出。目前没有其他数据。

利益冲突

所有作者都是Alexion Pharmaceuticals, Inc.的员工和股东，该公司开发罕见和超罕见疾病的疗法。

作者的贡献

Brendan Connolly设计并实施了细胞培养、转染和体内样本处理。Cleo Isaacs设计并实施了免疫组化。Lei Cheng设计并进行了ISH实验、手稿撰写和体内研究。Kirtika H. Asrani进行了免疫印迹、免疫测定和体内样本处理。romesr . Subramanian设计实验，审查数据，并撰写手稿

致谢

Alexion制药公司获得了资金支持。

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核酸杂志